Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunofluorescensbilleddannelse af neutrofile ekstracellulære fælder i væv fra mennesker og mus

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

Neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) er forbundet med forskellige sygdomme, og immunofluorescens bruges ofte til deres visualisering. Der er dog forskellige farvningsprotokoller, og i mange tilfælde undersøges kun en type væv. Her etablerer vi en generelt anvendelig protokol til farvning af NETs i muse- og humant væv.

Abstract

Neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) frigives af neutrofiler som et svar på bakteriel infektion eller traumatisk vævsskade, men spiller også en rolle i autoimmune sygdomme og steril inflammation. De er weblignende strukturer sammensat af dobbeltstrengede DNA-filamenter, histoner og antimikrobielle proteiner. Når de er frigivet, kan NETs fange og dræbe ekstracellulære patogener i blod og væv. Desuden deltager NETs i homeostatisk regulering ved at stimulere blodpladeadhæsion og koagulation. Imidlertid har den dysregulerede produktion af NET'er også været forbundet med forskellige sygdomme, herunder sepsis eller autoimmune lidelser, hvilket gør dem til et lovende mål for terapeutisk intervention. Bortset fra elektronmikroskopi er visualisering af NET'er ved hjælp af immunfluorescensbilleddannelse i øjeblikket en af de eneste kendte metoder til at demonstrere NET-interaktioner i væv. Derfor er der anvendt forskellige farvningsmetoder til visualisering af NETs. I litteraturen beskrives forskellige farvningsprotokoller, og vi identificerede fire nøglekomponenter, der viser høj variabilitet mellem protokoller: (1) de anvendte typer antistoffer, (2) brugen af autofluorescensreducerende midler, (3) antigenhentningsmetoder og (4) permeabilisering. Derfor blev in vitro immunfluorescensfarvningsprotokoller systemisk tilpasset og forbedret i dette arbejde for at gøre dem anvendelige til forskellige arter (mus, mennesker) og væv (hud, tarm, lunge, lever, hjerte, rygmarvsskive). Efter fiksering og paraffinindlejring blev 3 μm tykke sektioner monteret på dias. Disse prøver blev farvet med primære antistoffer mod myeloperoxidase (MPO), citrullineret histon H3 (H3cit) og neutrofilelastase (NE) ifølge en modificeret farvningsprotokol. Lysbillederne blev farvet med sekundære antistoffer og undersøgt ved hjælp af et widefield fluorescensmikroskop. Resultaterne blev analyseret i henhold til et evalueringsark, og forskelle blev registreret semikvantitativt.

Her præsenterer vi en optimeret NET-farvningsprotokol, der passer til forskellige væv. Vi brugte et nyt primært antistof til at plette for H3cit og reducerede uspecifik farvning med et autofluorescensreducerende middel. Desuden demonstrerede vi, at NET-farvning kræver en konstant høj temperatur og omhyggelig håndtering af prøver.

Introduction

Neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) blev først visualiseret af Brinkmann et al. som en vej til cellulær død forskellig fra apoptose og nekrose i 20041. I denne vej frigiver neutrofiler deres dekondenserede kromatin i det ekstracellulære rum for at danne store weblignende strukturer dækket af antimikrobielle proteiner, der tidligere blev opbevaret i granulatet eller cytosolen. Disse antimikrobielle proteiner omfatter neutrofil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO) og citrullineret histon H3 (H3cit), som almindeligvis anvendes til indirekte immunofluorescensdetektion af NETs2. Denne metode identificerer ikke kun den kvantitative tilstedeværelse af disse proteiner; Det har faktisk den fordel, at det specifikt detekterer NET-lignende strukturer. I NETs lokaliserer de nævnte proteiner sammen med ekstracellulært DNA, som kan detekteres ved en overlapning af fluorescenssignalerne for hvert farvet protein og det ekstracellulære DNA. I modsætning til de overlappende signaler på grund af ekstracellulær DNA- og protein-co-lokalisering i NET'er viser intakte neutrofiler ingen co-lokalisering. Her opbevares NET-komponenterne normalt separat i granulerne, kernerne og cytosol3.

Siden deres første opdagelse har det vist sig, at NETs spiller en central rolle i mange sygdomme, især dem, der involverer inflammation. NETs viser antimikrobielle funktioner under infektion gennem fangst og drab af ekstracellulære patogener i blod og væv 4,5. Imidlertid har NETs også været forbundet med autoimmune sygdomme og hyperinflammatoriske reaktioner, som systemisk lupus erythematosus, reumatisk arthritis og allergisk astma 6,7,8. NETs fremmer vaso-okklusion og betændelse i aterosklerose, blodpladeadhæsion, og spekuleres i at spille en rolle i metastatisk cancer 9,10,11. Ikke desto mindre menes de at have antiinflammatoriske egenskaber ved at reducere proinflammatoriske cytokinniveauer12. Mens NETs vinder mere interesse for et bredere forskningsfelt, er en robust NET-detektionsmetode grundlæggende for fremtidig forskning.

Selvom visualiseringen af NET'er i forskellige væv ved hjælp af immunfluorescensbilleddannelse er kompleks og kræver tilpasning, bortset fra elektronmikroskopi, er det i øjeblikket en af de mest kendte metoder til visualisering af interaktionerne mellem NET'er og celler og anvendes overvejende i formalinfikserede paraffinindlejrede væv (FFPE)13,14. Det er dog vanskeligt at sammenligne NET-billeddannelse, da forskellige laboratorier bruger deres egne tilpassede protokoller. Disse protokoller adskiller sig i deres brug af antistoffer, antigenhentning eller permeabiliseringsmetode og er ofte optimeret til en bestemt type væv 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Efter at Brinkmann et al. offentliggjorde den første metodiske undersøgelse ved hjælp af immunofluorescerende visualisering af NET'er i FFPE-væv, ønskede vi at optimere denne protokol til en bredere vifte af væv og arter15. For at etablere en bredt anvendelig immunfluorescensprotokol testede vi desuden forskellige modificerede protokoller fra undersøgelser, der anvendte immunfluorescensmetoder i FFPE-væv til at detektere NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Desuden prøvede vi et nyt H3cit-antistof til mere specifik ekstracellulær farvning28. Vi antager, at ved systematisk at tilpasse nuværende farvningsprotokoller til forskellige arter og væv, kan in vitro-billeddannelse forbedres, hvilket resulterer i en bedre repræsentation af interaktionen mellem neutrofiler og NET'er både lokalt og systemisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse omfattede musevæv fra forsøg, der var godkendt af Hamburg State Administration for Animal Research, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Tyskland (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). De anvendte væv var muselunge og tyktarm fra en septisk model og brændt hud. Vi brugte 8 uger gamle han- og hunmus. Det europæiske direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål, blev fulgt for alle forsøgene. De anonymiserede humane prøver omfattede væv fra neonatal enterocolitis, brændt hud, galde atresi, spondylodiscitis og myokardium. Ifølge Hamburgs etiske komité for medicinsk forskning behøvede prøverne ikke informeret samtykke, men undersøgelsen blev godkendt af komitéen (WF-026/21).

1. Prøvefiksering

  1. Brug følgende protokol afledt af Abu Abed og Brinkmann til prøvefiksering, dehydrering, paraffinindlejring, sektionering og montering 3,15.
    1. Forbered 4% formaldehydopløsning ved at opløse 40 g paraformaldehyd (PFA) i 800 ml Tris-bufret saltvand, pH 7,4 (TBS).
    2. Blandingen omrøres ved 60 °C under en stinkhætte, indtil PFA'en er opløst. Bring opløsningen til stuetemperatur (RT), og juster lydstyrken med TBS til 1.000 ml.
    3. Juster pH-værdien til 7,4. Opbevares ved 4 °C i 2-3 uger eller ved -20 °C i op til 1 år.
  2. Til prøvefiksering anbringes frisk væv i TBS-buffer og dissekeres i stykker, der er mindre end 20 mm x 30 mm x 3 mm. Nedsænk vævssektionerne i 4% paraformaldehydopløsning i 12-24 timer.
    BEMÆRK: Den oprindelige protokol anvendte en 2% PFA-opløsning og en fikseringstid på 8-20 timer. Med denne metode blev nogle vævssektioner ikke fuldstændigt fikseret efter 20 timer, så PFA-koncentrationen blev øget til 4% PFA.
  3. Overfør prøverne til mærkede vævsbehandlingskassetter. Brug opløsningsmiddelresistente markører eller blyanter til mærkning.
  4. Start prøvetørringen ved at nedsænke kassetterne i 70% ethanol i 1 time. Derefter nedsænkes i 80% ethanol, 90% ethanol, 96% ethanol og to gange i 100% ethanol, hvor hvert trin varer 1 time.
  5. Der nedsænkes to gange i 100 % xylen (dimethylbenzen) og derefter to gange i 60 °C-paraffin i 1 time hver gang.
  6. Brug indstøbningsforme til montering, og lad paraffinen størkne, inden du fjerner formen.
  7. Brug et mikrotomt til at skære 3 μm tykke vævssektioner.
  8. Brug en pincet til at lægge de afskårne sektioner i et 37 °C vandbad, og lad dem flyde på overfladen for at strække vævssnittene.
  9. Placer sektionerne på selvklæbende glasskinner (materialetabel), og lad dem tørre natten over i et varmekammer på 40 °C.

2. Prøve rehydrering

  1. Til afparaffinisering stables diasene i et diasstativ og nedsænkes to gange i 5 minutter hver i xylenerstatningsmediet limonen (materialetabel) og en gang i 5 minutter i en 1: 1 limonen / ethanolblanding.
    FORSIGTIG: Limonen er brandfarligt ved 50 °C og kan forårsage allergiske reaktioner. Brug under en stinkhætte med øjenbeskyttelse og handsker. Holdes væk fra åben ild.
  2. Rehydrer prøverne i en faldende ethanolserie ved at nedsænke glidestativet to gange i 100% ethanol og en gang i 96% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol og 70% ethanol i 5 minutter hver.
  3. Nedsænk glidestativet i 5 minutter i deioniseret vand (DI-vand) for at rense eventuel resterende ethanol.

3. Autofluorescensblokering og antigenudtagning

  1. Forbered pH 6 citratmålhentningsopløsning (TRS) (materialetabel) i henhold til databladet. Denne TRS er koncentreret 10 gange. Fortynd derfor 1:10 med DI-vand. Forvarm i et plastfarveglas til 96 °C.
    BEMÆRK: TRS bryder methylenbroerne dannet under prøvefiksering for at udsætte antigenepitoperne. Dette gør det muligt for de primære antistoffer at binde deres målantigen. Opbevar koncentreret TRS ved 2-8 °C i 8 måneder. Tilbered altid frisk TRS.
  2. Tag diasene ud af diasstativet, og læg dem i et vådt kammer. Der pipetteres en til to dråber autofluorescensreducerende middel (materialetabel) på hver prøve. Inkuber i 5 min.
    BEMÆRK: Det autofluorescensreducerende middel blokerer den iboende vævsautofluorescens forårsaget af endogene fluoroforer og fikseringsmidler. Opbevar det autofluorescensreducerende middel hos RT i op til 1 år.
    BEMÆRK: Arbejd kun med små dele af væv for at undgå udtørring af prøverne eller overskridelse af inkubationstiden.
  3. Stak gliderne tilbage i glidestativet, og skyl i 1 min i 60% ethanol ved hjælp af en opadgående og nedadgående bevægelse, indtil alt det ubrugte autofluorescensreducerende reagens er vasket af.
  4. Nedsænk glidestativet i 5 min i DI-vand.
  5. Til antigenhentning overføres diasene til en farvningsbeholder med den forvarmede TRS. Der inkuberes i 10 minutter ved 96 °C i vandbad.
    BEMÆRK: 96 °C vandbadet kan erstattes med en mikrobølgeovn eller dampkoger, hvis TRS forvarmes til 96 °C, og der sikres 10 minutters inkubationstid ved 96 °C.
  6. Tag farveglasset ud, og lad det køle langsomt af til RT i ca. 60-90 min.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her i op til 4 timer, hvilket efterlader diasene i TRS.
  7. Fjern TRS, men opbevar diasene i krukken. Skyl to gange med Tris-bufret saltvand med 0,05% Tween (TBST, pH 7,4) i 3 minutter hver for at vaske eventuelle rester af TRS af.
  8. Til permeabilisering fremstilles 0,2% Triton i fosfatbufret saltvand (PBS), pH 7,4, og fyldes i farvningsglasset for at permeabilisere prøverne i 10 minutter.
    BEMÆRK: Permeabilisering forbedrer bindingen af de primære antistoffer med de intracellulære målproteiner i de faste prøver.
  9. Skyl lysbillederne igen to gange i TBST i 3 minutter hver gang.
  10. Forbered det våde kammer, og læg dias. Tør overskydende vand fra dias med papirservietter. Sæt en cirkel om hver prøve med en hydrofob barrierepen for at forhindre, at antistofopløsningen løber af.
    BEMÆRK: Lad ikke prøverne tørre ud. Det er bedst at arbejde med små sektioner.

4. Blokering af uspecifik antistofbinding

  1. Tag brugsklar blokeringsopløsning med æselserum (Table of Materials), og pipette en dråbe på hver prøve. Inkuber i 30 minutter ved RT.
    BEMÆRK: Dette blokeringstrin minimerer bindingen af det sekundære antistof til uspecifikke bindingssteder på prøven. Efter blokering af disse uspecifikke epitoper og påføring af det primære antistof vil det sekundære antistof binde til det primære antistof og ikke interagere med vævets overflade. Dette brugsklare blokerende reagens opbevares ved 2-8 °C i 6 måneder.
  2. Fjern overskydende blokeringsopløsning fra dias ved at banke kanten af diasene mod en hård overflade. Skyl dem ikke.

5. Primært antistof

  1. Fortyndede primære antistoffer i antistoffortyndingsbuffer (materialetabel). Der anvendes ca. 100 μL af den endelige opløsning til hver prøve. For NE og H3cit (R8) antistof og isokontrol fortyndes til en koncentration på 5 μg/ml. Til MPO og tilsvarende isokontrol anvendes 10 μg/ml. Forbered et rør til hvert primært antistof og et til hvert isocontrol-antistof.
    BEMÆRK: H3cit (R8) / MPO eller NE / MPO og deres isokontroller kan kombineres til NETs farvning. Ved kombinationen af H3cit (R8)/MPO fortyndes til en slutkoncentration på 5 μg/ml for H3cit (R8) og 10 μg/ml for MPO til et slutvolumen på 100 μL pr. prøve. For NE/MPO fortyndes til en slutkoncentration på 5 μg/ml for NE og 10 μg/ml for MPO til et slutvolumen på 100 μL pr. prøve. Til isokontrol anvendes samme koncentration som for hvert tilsvarende antistof. Brug altid en ny pipettespids for hvert antistof, der anvendes. Primære antistoffer kan opbevares ved 4 °C i 1-2 uger og ved -20 °C eller -80 °C i op til 1 år.
  2. Med to prøver på et objektglas skal du bruge en til isocontrol-antistofferne og en til MPO/H3cit- eller MPO/NE-antistoffortyndingen. Brug ca. 100 μL til hver prøve, og fordel antistofopløsningen jævnt.
    BEMÆRK: Lad ikke prøverne tørre ud. Pas på at undgå at blande isocontrol og primære antistoffer.
  3. Opbevares i et vådt kammer natten over ved 4 °C.
  4. Den næste dag skal du tappe den overskydende primære antistofopløsning fra diasene og stable diasene i en kuvette. Skyl tre gange i 5 minutter hver gang med TBST for at vaske den resterende primære antistofopløsning af.

6. Sekundært antistof

  1. Forbered den sekundære antistofopløsning. Brug to forskellige fluorescerende sekundære antistoffer: æsel-anti-ged til MPO og æsel-anti-kanin til H3cit-farvning. Hver enkelt fortyndes til en koncentration på 7,5 μg/ml med antistoffortyndingsbuffer (materialetabel).
    BEMÆRK: Til dobbeltfarvning skal du bruge to fluorescerende antistoffer med forskellige excitationsområder og minimal spektral overlapning. Begge sekundære antistoffer kombineres, og der fortyndes til en slutkoncentration på 7,5 μg/ml for hvert antistof til et slutvolumen på 100 μL pr. prøve. Beskyt antistofferne mod lys. De sekundære antistoffer kan opbevares ved 2-8 °C i 6-8 uger eller ved -80 °C i op til 1 år.
  2. Opbevar objektglassene i det våde kammer, og tilsæt 100 μL af den sekundære antistofopløsning på hver prøve. Lad dem inkubere i 30 min ved RT og beskyttet mod lys.
  3. Bank den overskydende sekundære antistofopløsning af, og stak diasene i diasstativet. Nedsænk tre gange i 5 minutter hver i en farveglas fyldt med PBS for at vaske eventuelle resterende ubundne antistoffer af.
  4. Der fremstilles DAPI-opløsning (4',6-diamidino-2-phenylindol) (materialetabel), og der fortyndes til en koncentration på 1 μg/ml med DI-vand. Nedsænk diasstativet i et farveglas med DAPI-opløsning, og inkuber i 5 minutter ved RT i mørke.
    BEMÆRK: DAPI bruges som en fluorescerende plet til dobbeltstrenget DNA. Den forberedte DAPI-opløsning kan bruges flere gange. Opbevar den forberedte DAPI-opløsning hos RT. DAPI-koncentratet kan opbevares ved -20 °C i op til 1 år.
  5. Nedsænk glidestativet i 5 minutter i en farvningsbeholder med PBS for at vaske den overskydende DAPI-opløsning af.

7. Montering og opbevaring af prøverne, mikroskopisk analyse

  1. Monter prøverne med dæksedler og monteringsmedium (materialetabel).
    BEMÆRK: Brug kun små mængder monteringsmedium, og tør det overskydende medium af med vådt væv. Brug handsker, og undgå ved et uheld at tørre noget medium af dækslerne eller gliderne. Undgå bobledannelse, og brug vatpinde til at trykke forsigtigt på dæksedlerne for at fjerne eventuelle bobler fra diasene.
  2. Til billeddannelse skal du bruge et widefield-mikroskop eller et konfokalmikroskop.
    BEMÆRK: Tag først et billede af isokontrollen. Sænk eksponeringstiden for fluorescensfiltrene (undtagen det blå filter til DAPI), indtil næsten intet signal kan detekteres. Brug derefter denne indstilling til at undersøge de tilsvarende prøver. Se efter områder, hvor et fluorescerende signal kan detekteres i hver enkelt prøve ved hjælp af fluorescenskanalen. Efter at have taget et billede af området genererer programmet et sammensat billede af alle kanalerne og viser de forskellige fluorescenssignaler som en overlapning af forskellige farver. Billedet kan derefter analyseres yderligere for co-lokalisering med billedbehandlingssoftware som ImageJ.
  3. Opbevar diasene ved 4 °C i op til 6 måneder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før vi startede vores protokoloptimering, identificerede vi vigtige trin for vellykket farvning ved at søge PubMed efter undersøgelser, der brugte FFPE-væv til immunfarvning af NET'er og sammenlignede deres protokoller. De mest lovende protokolforskelle blev identificeret som de vigtigste trin for protokoloptimeringen, mens trin, der for det meste svarede til hinanden, ikke blev ændret (tabel 1).

Tabel 1: PubMed-forskning for FFPE-immunfarvning af NET'er. Denne tabel viser variablerne i immunfarvningsprotokollen i de undersøgte undersøgelser. De anvendte protokoller blev opdelt i deres væsentlige trin og derefter sammenlignet med hinanden. Trinene med de mest lovende forskelle blev derefter taget som de vigtigste trin til optimering og tilpasset vores protokol. Trin, der for det meste svarede til hinanden, blev ikke ændret, ligesom inkubationstiden for det primære antistof (natten over, 4 °C). Klik her for at downloade denne tabel.

Baseret på vores resultater konkluderede vi, at de antistoffer, der blev valgt til at målrette epitoperne, var det første kritiske skridt. Mindst 10 forskellige protokoller anvendte triH3cit-antistoffet (se tabel 1; Primær antistofkolonne). Ikke desto mindre fandt Thålin et al., at H3cit (R8) klonen viste mindre krydsreaktivitet uden for målet over for ikke-citrullinerede histoner og viste ubetydelig variation mellem partierne. Således besluttede vi at sammenligne triH3cit og H3cit (R8) farvningsresultater med hinanden28.

Fire undersøgelser anvendte MPO-antistoffet fra mennesker/mus. Desuden anvendte to andre protokoller MPO (2D4) for musevæv og MPO (2C7) for humant væv (se tabel 1; Primær antistofkolonne). Derfor sammenlignede vi separat MPO (2C7) med MPO-antistof fra mennesker/mus til humant væv og MPO (2D4) med MPO-antistof mod mennesker/mus til musevæv. NE blev påvist ved hjælp af mindst fem forskellige antistoffer, men kun tre af dem viste gode farvningsresultater i de leverede billeder. Et antistof var imidlertid ikke længere tilgængeligt på markedet, så vi sammenlignede NE-antistoffet fra en kaninvært med et fra en musevært til vores testserie i humant væv. For museprøver syntes der ikke at være noget tilgængeligt og pålideligt alternativ til det NE-antistof, der blev rejst i kaninværten ved starten af denne undersøgelse. Da et NE og begge H3cit-antistoffer stammer fra den samme kaninvært, kan de ikke kombineres til dobbeltfarvning med denne protokol. Det sekundære antistof er specifikt for det konstante område af det primære antistof, som bestemmes af værten, det blev rejst i. Hvis der anvendes to primære antistoffer afledt af den samme vært, kan det sekundære antistof binde til begge primære antistoffer, og farvningen vil være uspecifik. Dobbeltfarvning foretrækkes dog frem for enkeltfarvning, fordi flere NET-komponenter kan detekteres og samlokaliseres. Derfor vil farvningsresultatet være mere specifikt. Derfor dobbeltbejdsede vi for H3cit og MPO for at opnå en mere robust detektionsprotokol.

På trods af lighederne i de anvendte antistoffer varierede fortyndingerne for antistofferne i næsten alle protokollerne; for triH3cit var koncentrationsområdet f.eks. fra 0,5 μg/ml til 20 μg/ml17,18. For hvert anvendt antistof prøvede vi forskellige fortyndinger og opnåede tilfredsstillende farvningsresultater i hele det område, der er rapporteret i litteraturen.

Desuden kunne der findes mange ligheder i inkubationstiden for det primære antistof (natten over ved 4 °C) og brugen og fortyndingen af det sekundære antistof (se tabel 1; Inkubation primær antistofkolonne). Derfor ændrede vi ikke disse trin i vores testserie og udførte dem i henhold til protokollen beskrevet ovenfor.

Det næste kritiske trin bestemt ud fra litteraturen var antigenhentningen. Dette trin er vigtigt, fordi epitoperne for antistofferne på grund af formalinfiksering maskeres gennem methylenbroer, som kan vendes ved opvarmning af vævssektionen i en passende buffer29. Citrat TRS ved pH 6 og EDTA TRS buffer ved pH 9 blev anvendt lige ofte i litteraturen og gav lignende resultater (se tabel 1; TRS-bufferkolonne). Således besluttede vi os for pH 6 citrat TRS til vores testserie. Til antigenudtagning testede vi to forskellige opvarmningsmetoder: en mikrobølgeovn (først 1 min ved 360 W og derefter derefter med 9 min ved 90 W) og et vandbad (60 °C i 90 min, 96 °C i 10 min).

Det sidste trin, der viste en vis variation i litteraturen, var permeabiliseringen med Triton X-100. Dette trin krævede optimering, fordi cellemembranen med vaskemiddelbehandling bliver gennemtrængelig for antistoffer, og intracellulære epitoper kan nås30. De tidligere protokoller anvendte forskellige Triton X-100-koncentrationer fra 1% til 0,1% (se tabel 1; Kolonne med permeabilisering). Derfor prøvede vi to Triton X-100 koncentrationer (0,2% og 0,5%) og en serie uden Triton permeabilisering.

Efter at have identificeret disse vigtige trin ændrede vi dem og forsøgte at optimere protokollen. Derefter blev billederne undersøgt i henhold til et evalueringsark, og forskellene blev registreret halvkvantitativt og sammenlignet ( se tabel 2).

Tabel 2: Tabel over resultater til optimering af protokoltrinnene. Denne tabel viser resultaterne for de tilpassede trin: autofluorescensreducerende middel, antigenhentning og permeabilisering. Før vi begyndte denne testserie, testede vi for den bedste antistofkombination og koncentration. Slides blev evalueret i 10 forskellige områder, og derefter blev et repræsentativt område scoret fra (-) for et negativt resultat til (++) for et positivt NET-holdigt resultat. De delvist positive resultater omfattede en højere diffus baggrundsfarvning af ikke-neutrofile celler. Forkortelser: n/u = åben; - = negativt resultat +/-delvist positiv farvning; + = moderat specifik farvning; + = god farvning af NETs og neutrofiler. Klik her for at downloade denne tabel.

Primære antistoffer
Før vi tilpassede protokollen, forsøgte vi at finde den bedste antistofkombination. Her viste triH3cit mere intracellulær histonfarvning end H3cit (R8). Til påvisning af NETs besluttede vi at bruge H3cit (R8) antistoffet til vores protokoloptimering. Dette antistof bandt kun til det ekstracellulære H3cit og viste ingen farvning af intracellulær H3cit ved denne koncentration (se figur 1A,B).

For MPO-farvning sammenlignede vi MPO-antistof fra mennesker/mus med MPO (2C7) for humant væv (se figur 1C,D) og MPO (2D4) for musevæv (se figur 1E,F). MPO (2D4) og MPO (2C7) antistofferne kunne ikke opnå ensartet farvning for flere vævstyper, mens MPO for mennesker / mus resulterede i pålidelig, god farvning for MPO. Derfor valgte vi MPO for mennesker / mus til vores farvningsprotokol.

For NE prøvede vi et NE-antistof fra en musevært på humant væv, som kun viste NE-farvning i en ud af fem prøver sammenlignet med den pålidelige farvning af NØ-antistoffet fra en kaninvært. Derudover er NØ-antistoffet fra en kaninvært anvendeligt på humant væv og musevæv. (se figur 1G,H).

Figure 1
Figur 1: Primær antistofsammenligning i forskellige væv. (A) Human neonatal enterocolitis (NEC) væv farvet med H3cit (R8) (rød). Her kan kun et ekstracellulært signal detekteres. B) Samme væv farvet med triH3cit (R2,8,17) (rødt). Dette antistof skaber et bredere signal med intens intracellulær farvning af citrullinerede histoner (gule pile). (C,E) Humant NEC-væv (C) og volvulusvæv fra mus (E) med god farvning for H3cit (R8) (rød) og MPO med mus/human MPO (grøn). H3cit-, MPO- og DAPI-signallokaliseringen (blå) angiver NET-dannelse (hvide pile). (D,F) Til sammenligning kunne (D) ved anvendelse af MPO (2C7) til humant NEC-væv og (F)MPO (2D4) (grøn) til voluminvæv hos mus ikke opnås noget MPO-signal. g) Brændt menneskelig hudprøve med meget stærk farvning for NE-antistoffet fra en kaninvært (magenta) sammenlignet med det (H) negative farvningsresultat for NE-antistoffet fra en musevært. For isotypekontrol, se Supplerende figur isokontrol 1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Afparaffinisering
Her blev xylen erstattet med limonen, hvilket viste ækvivalent med bedre afparaffinisering af vævsprøverne sammenlignet med xylen, med mindre autofluorescens i baggrunden (se figur 2A,B).

Autofluorescensreducerende middel
Det brugsklare autofluorescensreducerende middel baseret på Sudan Black kan påføres i 2-20 minutter. Her anvendte vi det i 0 min, 5 min og 10 min. Når der ikke blev anvendt blokering, viste nogle museprøver mere uspecifik farvning, og delvis positiv farvning kunne nås (se figur 2C). Blokeringstiden på 5 minutter viste gode resultater i alle vævstyper undtagen H3cit og MPO i muselunge- og hudvæv (se tabel 2). Efter 10 minutters blokeringstid i nogle prøver begyndte farvningen at være mindre lys, så tidsrammen på 5 minutter er det bedste valg til blokering af autofluorescens (se figur 2D, E).

Figure 2
Figur 2: Afparaffiniseringsmetoder og anvendelse af et autofluorescensreducerende middel. (A) Humant spondylodiscitisvæv afparaffineret med limonen og farvet for H3cit (rød) og MPO (grøn). Den strandede dannelse af signalerne og delvis co-lokalisering indikerer tilstedeværelsen af NET'er (hvid pil). (B) Samme vævsprøve afparaffineret med xylen, hvilket resulterer i lignende farvningsresultater, hvilket indikerer, at den udbredte xylen kan erstattes med et erstatningsmedium. (C-E) Muselungevæv efter induceret sepsis, der viser forskellige NØ-farvningsmønstre (magenta), når der anvendes forskellige inkubationstider for det autofluorescensreducerende middel. Uden anvendt autofluorescensreduktion viser billede C stadig en lille baggrundsfarvning af erytrocytter (rød pil). I modsætning hertil viser billede D, at der efter 5 minutters inkubation med et autofluorescensreducerende middel udsendes et klart signal. Efter 10 minutter falder farvningskvaliteten i billede E, og signalet bliver mindre lyst. For isotypekontrollen, se Supplerende figur Isocontrol 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Metoder til hentning af antigen
Til NØ-farvning opvarmede vi prøverne i pH 6 citratbuffer i 10 minutter i mikrobølgeovnen (først i 1 min ved 360 W og derefter i 9 min ved 90 W), i 10 min i et vandbad ved 96 °C eller i 90 minutter i et vandbad ved 60 °C. Her viste de højere temperaturer i mikrobølge og vandbad konsekvent moderat til god antigenhentning (se figur 3A). Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel mellem mikrobølgeovnen og 96 °C vandbadet (se tabel 2). Desuden blev det vist, at der i et 60 °C vandbad kun var delvis positiv eller ingen farvning (se figur 3B). Kun det humane ileum og det humane myokardium viste gode specifikke resultater. Da der ikke kunne opnås tilstrækkelig farvning for NE med 60 °C vandbad, blev 60 °C vandbadstestserien for H3cit og MPO kasseret.

Til dobbeltfarvning med MPO og H3cit opvarmede vi prøverne i pH 6 citratbuffer i mikrobølgeovnen i 10 min (først i 1 min ved 360 W og derefter i 9 min ved 90 W) eller i et vandbad ved 96 °C i 10 min. Her viste begge metoder gode specifikke resultater med lidt gunstigere resultater for 96 °C vandbadet (se figur 3C). Kun muse-, lunge- og hudvæv kunne opnå en moderat samlet placering (se tabel 2).

Overskridelse af inkubationstiden på 40 minutter ved 96 °C resulterede imidlertid i mindre intens antistoffarvning, mens der kunne observeres betydeligt mere baggrundsfarvning (se figur 3D).

Figure 3
Figur 3: Metoder til antigenudtagning. A) Volvulusvæv fra mus, der er farvet for NE (magenta) med en inkubationstid på 10 minutter ved 96 °C til varmeudtagning, viser et signifikant stærkere signal end (B) ved inkubation af prøven i 90 minutter i et 60 °C-vandbad. (C) Desuden resulterer 10 minutters inkubation i 96 °C antigenudtagning også i et stærkt signal for H3cit (rød) og MPO (grøn) med kombineret NET-farvning (hvide pile). D: Kogning af prøverne i mere end 40 minutter resulterer dog i mindre specifik ekstracellulær H3cit-farvning og ingen MPO-farvning. For isotypekontrol, se Supplerende figur isokontrol 3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Permeabilisering
Vi prøvede at permeabilisere prøverne med Triton X-100 i to fortyndinger (0,2% og 0,5%) i 10 minutter og sammenlignede dette med 10 minutter i deioniseret vand. Her opnåede 10 min med Triton 0,2% gode resultater på tværs af alle vævstyper, selvom forskellene var små sammenlignet med 0,5% Triton og deioniserede vandforhold (se tabel 2).

Supplerende figur Isokontrol 1: Isotypekontrol til figur 1. Alle billeder viser god DAPI (blå) farvning, men intet signal for det fluorescerende antistof. Dette bekræfter, at bindingen af primære antistoffer i figur 1 er specifik for målantigenet og ikke et resultat af ikke-specifik binding eller proteininteraktioner. A) Humant neonatal enterocolitis (NEC)-væv farvet med isocontrol-antistoffet mod H3cit (R8) (rød). B) NEC-væv farvet med isocontrolantistoffet mod H3cit (R2,8,17) (rødt). C) NEC-væv (E) og volvulusvæv fra mus farvet med isocontrol-antistoffer mod H3cit (R8) (rød) og MPO med mus/human mus (grøn). D) NEC-væv farvet med isokontrolantistoffer mod H3cit (R8) (rød) og MPO (2C7) (grøn). F) Volvulusvæv med mus farvet med isocontrol-antistoffer mod H3cit (R8) (rød) og MPO 2D4 (grøn). G: Brændt menneskelig hudprøve farvet med isocontrol-antistoffet mod NØ-antistoffet fra en kaninvært (magenta). (H) Samme væv farvet med isocontrol-antistoffet mod NØ-antistoffet fra en musevært (magenta). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur Isokontrol 2: Isotypekontroller til figur 2. Alle billeder viser god DAPI (blå) farvning, men intet signal for det fluorescerende antistof. Dette bekræfter den specifikke binding af de primære antistoffer i figur 2. Billeder C-E viser stadig nogle baggrundsfarvninger i magenta på grund af de lange eksponeringstider. NE-signalet i figur 2 kan dog skelnes fra baggrundsfarvningen. a) Humant spondylodiscitisvæv afparaffineret med limonen og farvet med isocontrol-antistofferne mod H3cit (R8) (rød) og mus / human MPO (grøn). (B) Samme vævsprøve afparaffineret med xylen og farvet med isocontrol-antistofferne for H3cit (rød) og MPO (grøn). c) Muselungevæv farvet med isocontrol-antistoffet mod NE (magenta), uden anvendelse af autofluorescensreducerende middel. d) Samme væv farvet med isocontrol-antistoffet for NE (magenta) og 5 minutters inkubation med et autofluorescensreducerende middel. E) Samme væv farvet med isokontrolantistoffet for NE (magenta) og 10 minutters inkubation med et autofluorescensreducerende middel. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur Isokontrol 3: Isotypekontroller til figur 3. Alle billeder viser god DAPI (blå) farvning, men intet specifikt signal for det fluorescerende antistof. Dette bekræfter den specifikke binding af de primære antistoffer i figur 3. A) Volvulusvæv med mus farvet med isocontrol-antistoffet mod NE (magenta) med en inkubationstid på 10 minutter ved 96 °C til varmeudtagning. B) Samme væv farvet med isocontrol-antistoffet mod NE (magenta) og varmeudtagning i 90 minutter i et 60 °C-vandbad. C) Samme væv farvet med isocontrol-antistoffet for H3cit (rød) og MPO (grøn) og med samme varmeudtagningsbetingelser som i A. Den grønne prik viser en farvningsartefakt af aggregerede sekundære antistoffer. D) Samme væv farvet med isocontrol-antistoffet for H3cit (rød) og MPO (grøn) og med en inkubationstid på 40 minutter ved 96 °C til varmeudtagning. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur Isokontrol 4: Isotypekontroller til figur 4. Alle følgende isokontroller er fra samme dias som det tilsvarende "mislykkede" eksperiment. De mislykkede forsøg blev ikke gjort med vilje, så nogle isokontroller synes brugbare, mens prøven ikke var. (A) NEC-væv farvet med isocontrol-antistoffet for H3cit (rød) og MPO (grøn). Denne prøve blev behandlet hurtigere uden udtørring. Derfor er der ingen overdreven baggrundsfarvning synlig. De grønne og røde strukturer er sekundære antistofaggregater. (B) Spondylodiscitisvæv farvet med isocontrol-antistoffet mod NE (magenta). Her var afparaffiniseringen vellykket, så ingen paraffinrester kan ses. c) NEC-væv farvet med isocontrol-antistoffet for H3cit (rød) og MPO (grøn). Selvom de samme forkert lagrede sekundære antistoffer blev brugt, ville der ikke forventes farvning for dette isokontrolbillede. Derfor kan dette billede ikke bruges til at evaluere det tilsvarende billedes specifikke binding. d) Brændt menneskehud farvet med isocontrol-antistoffet til H3cit (rød) og MPO (grøn). Her blev monteringen udført mere omhyggeligt, og der kan ikke ses lysspredning gennem luftbobler. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde havde vi til formål at tilpasse og optimere de eksisterende protokoller til billeddannelse af NET'er til flere vævstyper, begyndende med den faktiske farvningsproces. Det første kritiske trin for denne metode er udvælgelsen af de mest egnede antistoffer. For NE prøvede vi et NE-antistof fra en musevært på humant væv, som ikke viste nogen pålidelig farvning sammenlignet med NE fra en kaninvært. Desuden foreslog Thålin et al. H3cit (R8) som et mere specifikt antistof til ekstracellulær farvning. Vi sammenlignede dette antistof med det meget anvendte triH3cit (R2, R8, R17). Vores undersøgelse viste, at H3cit (R8) antistoffet kun farvede for et ekstracellulært signal ved de anvendte koncentrationer, hvilket muliggjorde lettere genkendelse af NETs på diasene. Dette fund understøtter påstandene fra Thålin et al. om, at H3cit (R8) klonen kan give et godt NET-signal med nedsat krydsreaktivitet uden for målet over for ikke-citrullinerede histoner28. Vi sammenlignede også MPO-antistoffer til humant væv og musevæv til MPO-farvning. Vores resultater viser, at MPO-antistoffet fra mus / human viste mere pålidelig farvning og kan bruges samtidigt på humane prøver og museprøver, hvilket forenkler dets anvendelse i laboratoriet. Derfor anbefaler vi at bruge denne antistofkombination, H3cit (R8) og mus / human MPO, til fremtidig forskning og implementeret den i vores protokol.

Der er dog en begrænsning for flere farvningsforsøg med dette antistofvalg. Denne protokol blev ændret til at anvende primære antistoffer fra forskellige værter. Ellers kunne et sekundært antistof binde til begge primære antistoffer. H3cit-antistoffet kommer fra samme vært som NE-antistoffet, så vi kunne ikke plette NE og H3cit sammen. Selvom der ikke blev udført tredobbelt farvning (NE, H3cit, MPO) i denne undersøgelse, kunne denne protokol tjene som grundlag for tredobbelt farvningseksperimenter i fremtiden. En mulig mulighed for tredobbelt farvning eller NE og H3cit dobbeltfarvning kunne være at udveksle et af disse antistoffer med et pålideligt antistof fra en anden vært. I dette tilfælde kunne en mulig kombinationspartner være NØ-antistoffet (Santa Cruz; sc-55549) fra får anvendt af Knackstedt et al.24. En anden mulighed af Duler et al. blev offentliggjort i 2021, hvor de brugte en fortløbende dobbeltfarvningsmetode og kombinerede NE og H3cit fra en kaninvært26. En yderligere lovende anvendelse af en flerfarvningsmetode er til diskrimination mellem intra- og ekstravaskulær NET-dannelse. I stedet for tredobbelt farvning til NET-markører kunne dobbelt NET-farvning kombineres med yderligere vaskulær farvning. Desuden har et stigende antal undersøgelser undersøgt den intra- og ekstravaskulære fordeling af NETs for at få mere viden om patomekanismerne for specifikke sygdomme, såsom Alzheimers sygdom. Smyth et al.31 beskrev en lovende og dybdegående protokol svarende til vores for at skelne mellem de to mulige lokaliseringer. De ændrede deres eksisterende NET-farvningsprotokol ved at tilføje et biotinyleret lektin til mærkning af endotelceller og brugte en fluoroforkonjugeret streptavidin til immunofluorescensfarvning af lektin. Ved at undersøge co-lokaliseringen af lektin- og NET-markører i samme billede var de i stand til at identificere intravaskulære NETs31. I denne forbindelse er der behov for yderligere undersøgelser for at udvide anvendelsen af vores protokol.

Efter at have fundet den mest egnede antistofkombination er det næste kritiske trin at introducere et autofluorescensreducerende middel. Eksogene faktorer såsom prøvefiksering ved hjælp af formaldehydfikseringsmidler og endogene faktorer såsom erytrocytter kan resultere i høj autofluorescens, hvilket gør bestemmelse af co-lokalisering vanskelig32. Dette problem opstår hovedsageligt i det blå (excitationsområde: 430-480 nm) og grønne fluorescensspektre (excitationsområde: 500-550 nm) og kan resultere i inkonklusive farvningsresultater, når der anvendes et fluorescensantistof med samme excitationsområde3. Litteraturen rapporterer, at Sudan Black er et effektivt middel til at reducere iboende vævsautofluorescens33. Sudan Black gør det muligt at opnå klarere farvningsresultater ved hjælp af de blå eller grønne fluorescenskanaler. Dette excitationsområde vil være nødvendigt for fremtidige flere farvningsforsøg, fordi de blå og grønne kanaler er nødvendige, når man bruger et fjerde fluorescerende farvestof. Vores undersøgelse viser, at den optimale inkubationstid afhænger af den type væv og antistof, der anvendes i farvningsprocessen. Ikke desto mindre gav 5 minutters autofluorescensreducerende middel i dette arbejde generelt gode resultater på alle vævstyper og havde fordelen ved at farve prøven sort, hvilket gjorde det lettere at se på diasene. Dette forhindrede manglende dele af vævene i farvningsprocessen, især med små prøver.

En anden væsentlig faktor for succesen med denne protokol er en konstant høj temperatur for antigenhentningstrinnet. Vores forskning viste, at 10 af de 15 tidligere undersøgelser brugte temperaturer over 96 °C til antigenudtagning 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27. Dette var i overensstemmelse med vores resultater, hvor inkubation af prøverne i et 96 °C vandbad eller mikrobølgeovn gav gode resultater uden signifikante forskelle. Ikke desto mindre anbefaler vi at bruge et vandbad til jævn varmefordeling. Ved brug af mikrobølgeovnen fandt vi en temperaturgradient i bufferen på op til 5 °C mellem toppen og bunden af farveglasset. Derudover er vandbadet lettere at bruge og har en lavere risiko for, at bufferen koger over. Til permeabilisering fandt vi, at Triton X-100 havde en mindre effekt på farvningen. Så det er muligt at springe dette trin i protokollen over uden at påvirke resultatet negativt. Generelt gav humane prøver bedre resultater end museprøver. En årsag til dette kan være, at mennesker har en højere procentdel af neutrofiler end mus34,35. Derudover viste muselungeprøver ingen synlig makroskopisk inflammation og færre neutrofiler, mens musetarmprøver var makroskopisk betændte og viste gode farvningsresultater. Således kunne den lavere score i vores undersøgelse have været resultatet af den lave inflammation og ikke på grund af, at protokollen ikke fungerede optimalt.

Ved fejlfinding kan mindre fejl i protokollen eller manglende håndtering af prøverne omhyggeligt have enorme effekter på farvningsresultaterne. Et stort problem, som vi identificerede, var prøvedehydrering. Her fandt vi, at håndtering af mere end 10-15 dias på én gang var kritisk, fordi hvert trin er tidskrævende og kan resultere i dehydrering af prøverne. Dehydrerede prøver kan ikke længere bruges på grund af høj baggrundsfarvning og intet detekterbart specifikt fluorescenssignal (se figur 4A). Derudover skal prøverne afparaffiniseres fuldstændigt, inden farvningsprotokollen startes. Paraffinrester resulterede i et stærkt baggrundssignal, og skærelinjerne kunne ses i den farvede paraffin (se figur 4B). Efter mere end 20 fryse-optøningscyklusser kunne der desuden ikke påvises noget signal for det sekundære antistof mod MPO (se figur 4C). Et andet vigtigt trin med stor indflydelse på billedkvaliteten er håndteringen af det sidste monteringstrin. I dette arbejde resulterede luftbobler under dækselen i spredning af det fluorescerende signal og dermed et sløret billede (se figur 4D).

Figure 4
Figur 4: Tips til fejlfinding . (A) Dette panel viser konsekvensen af en udtørret prøve. Den ensfarvede røde baggrundsfarvning hindrer enhver evaluering af prøven. (B) Her viser den røde pil paraffinrester, der er kendetegnet ved det bølgede udseende, efter en utilstrækkelig afparaffinisering. Disse rester resulterer i et højt baggrundssignal og billeder af lavere kvalitet. c) Utilstrækkelig antistoflagring eller mere end 20 fryse-optøningscyklusser resulterer i aggregering af det sekundære antistof (grønne pile) og ingen binding til MPO. d) Montering, der ikke udføres omhyggeligt, kan resultere i luftbobler og derfor spredning af det fluorescerende lys (blå pil). Dette kan påvirke billedkvaliteten betydeligt, især når spredningen slører målet. For isotypekontrollen, se Supplerende figur Isocontrol 4. Klik her for at se en større version af denne figur.

Selvom NETs vinder mere popularitet i videnskabelig forskning, er der stadig ikke nok undersøgelser, der fokuserer på metoderne til NET-detektion 3,13,17,26. Så vidt vi ved, præsenterer vi den første undersøgelse, der sammenligner protokoller fra forskellige undersøgelser til immunfluorescensbilleddannelse af NET'er i FFPE-væv. De tidligere offentliggjorte tilpassede protokoller adskilte sig i deres antistof- eller antigenhentningsmetoder og var ofte designet til kun en vævstype, hvilket gjorde det vanskeligere at sammenligne NET-billeddannelsesresultaterne. Derfor identificerede vi i denne undersøgelse kritiske trin og etablerede en protokol, der var egnet til forskellige muse- og humane væv. Vi opnåede dette ved at bruge et nyt primært antistof til H3cit-farvning og reducere baggrundsfarvningen med et autofluorescensreducerende middel. Desuden viste vi, at en konstant høj temperatur er afgørende, og omhyggelig håndtering af prøver er grundlæggende for vellykket NET-farvning. Derfor giver denne undersøgelse de væsentlige trin til udvikling af en generelt anvendelig protokol til farvning af NET'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev grundlagt af det tyske forskningsselskab (BO5534). Vi takker Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer og PD Dr. Ingo Königs for at give os prøver. Derudover takker forfatterne teamet fra UKE Microscopy Imaging Facility (Core facilitet, UKE Medical School) for støtte med immunfluorescensmikroskopi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Tags

Immunfluorescensbilleddannelse Neutrofile ekstracellulære fælder NETs bakteriel infektion traumatisk vævsskade autoimmune sygdomme steril inflammation dobbeltstrengede DNA-filamenter histoner antimikrobielle proteiner patogener homeostatisk regulering blodpladeadhæsion koagulation sepsis autoimmune lidelser terapeutisk intervention elektronmikroskopi farvningsmetoder antistoffer autofluorescensreducerende midler antigenhentningsmetoder permeabilisering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Immunofluorescensbilleddannelse af neutrofile ekstracellulære fælder i væv fra mennesker og mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter