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Immunology and Infection

मानव और माउस ऊतकों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) विभिन्न बीमारियों से जुड़े होते हैं, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग अक्सर उनके विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया जाता है। हालांकि, विभिन्न धुंधला प्रोटोकॉल हैं, और, कई मामलों में, केवल एक प्रकार के ऊतक की जांच की जाती है। यहां, हम माउस और मानव ऊतक में एनईटी को धुंधला करने के लिए आम तौर पर लागू प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं।

Abstract

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) बैक्टीरिया के संक्रमण या दर्दनाक ऊतक क्षति की प्रतिक्रिया के रूप में न्यूट्रोफिल द्वारा जारी किए जाते हैं, लेकिन ऑटोइम्यून बीमारियों और बाँझ सूजन में भी भूमिका निभाते हैं। वे डबल-फंसे हुए डीएनए फिलामेंट्स, हिस्टोन और रोगाणुरोधी प्रोटीन से बने वेब जैसी संरचनाएं हैं। एक बार जारी होने के बाद, एनईटी रक्त और ऊतक में बाह्य रोगजनकों को फंसा और मार सकता है। इसके अलावा, एनईटी प्लेटलेट आसंजन और जमावट को उत्तेजित करके होमियोस्टैटिक विनियमन में भाग लेते हैं। हालांकि, एनईटी का अनियमित उत्पादन सेप्सिस या ऑटोइम्यून विकारों सहित विभिन्न बीमारियों से भी जुड़ा हुआ है, जो उन्हें चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक आशाजनक लक्ष्य बनाता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके एनईटी की कल्पना करना वर्तमान में ऊतक में नेट इंटरैक्शन को प्रदर्शित करने के लिए एकमात्र ज्ञात तरीकों में से एक है। इसलिए, एनईटी की कल्पना करने के लिए विभिन्न धुंधला तरीकों का उपयोग किया गया है। साहित्य में, विभिन्न धुंधला प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, और हमने प्रोटोकॉल के बीच उच्च परिवर्तनशीलता दिखाने वाले चार प्रमुख घटकों की पहचान की: (1) उपयोग किए गए एंटीबॉडी के प्रकार, (2) ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंटों का उपयोग, (3) एंटीजन पुनर्प्राप्ति विधियां, और (4) परमेबिलाइजेशन। इसलिए, इन विट्रो इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रजातियों (माउस, मानव) और ऊतकों (त्वचा, आंत, फेफड़े, यकृत, हृदय, रीढ़ की हड्डी की डिस्क) के लिए लागू करने के लिए इस काम में व्यवस्थित रूप से अनुकूलित और सुधार किया गया था। निर्धारण और पैराफिन-एम्बेडिंग के बाद, 3 μm मोटे वर्गों को स्लाइड पर लगाया गया था। इन नमूनों को एक संशोधित धुंधला प्रोटोकॉल के अनुसार मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ), सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 (एच 3 सिट), और न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी से दाग दिया गया था। स्लाइड्स को द्वितीयक एंटीबॉडी से दाग दिया गया था और वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जांच की गई थी। परिणामों का विश्लेषण एक मूल्यांकन शीट के अनुसार किया गया था, और अंतर अर्ध-मात्रात्मक रूप से दर्ज किए गए थे।

यहां, हम विभिन्न ऊतकों के लिए उपयुक्त एक अनुकूलित नेट स्टेनिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमने एच 3 सीआईटी के लिए दाग लगाने के लिए एक नए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया और ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट के साथ गैर-विशिष्ट धुंधलापन कम कर दिया। इसके अलावा, हमने दिखाया कि नेट धुंधला होने के लिए निरंतर उच्च तापमान और नमूनों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है।

Introduction

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) को पहली बार ब्रिंकमैन एट अल द्वारा 2004 में एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस से अलग सेलुलर मृत्यु के मार्ग के रूप में देखा गयाथा। इस मार्ग में, न्यूट्रोफिल अपने डीकन्डेन्स्ड क्रोमैटिन को बाह्य अंतरिक्ष में छोड़ते हैं ताकि रोगाणुरोधी प्रोटीन में कवर की गई बड़ी वेब जैसी संरचनाएं बनाई जा सकें जो पहले कणिकाओं या साइटोसोल में संग्रहीत थीं। इन रोगाणुरोधी प्रोटीन ों में न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई), मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ), और सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 (एच 3 सीआईटी) शामिल हैं, जो आमतौर पर एनईटी2 के अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाते हैं। यह विधि न केवल इन प्रोटीनों की मात्रात्मक उपस्थिति की पहचान करती है; वास्तव में, इसमें विशेष रूप से नेट जैसी संरचनाओं का पता लगाने का लाभ है। एनईटी में, उल्लिखित प्रोटीन बाह्य डीएनए के साथ सह-स्थानीयकरण करते हैं, जिसे प्रत्येक दाग वाले प्रोटीन और बाह्य डीएनए के प्रतिदीप्ति संकेतों के ओवरलैप द्वारा पता लगाया जा सकता है। एनईटी में बाह्य डीएनए और प्रोटीन सह-स्थानीयकरण के कारण अतिव्यापी संकेतों के विपरीत, बरकरार न्यूट्रोफिल कोई सह-स्थानीयकरण नहीं दिखाते हैं। यहां, नेट घटक ों को आमतौर पर कणिकाओं, नाभिक और साइटोसोल3 में अलग से संग्रहीत किया जाता है।

उनकी पहली खोज के बाद से, यह दिखाया गया है कि एनईटी कई बीमारियों में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से सूजन से जुड़े। एनईटी रक्त और ऊतक 4,5 में बाह्य रोगजनकों को फंसाने और मारने के माध्यम से संक्रमण के दौरान रोगाणुरोधी कार्य दिखाते हैं। हालांकि, एनईटी को ऑटोइम्यून बीमारियों और हाइपरइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं से भी जोड़ा गया है, जैसे प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस, आमवाती गठिया, और एलर्जी अस्थमा 6,7,8। एनईटी एथेरोस्क्लेरोसिस, प्लेटलेट आसंजन में वासो-रोड़ा और सूजन को बढ़ावा देते हैं, और मेटास्टैटिक कैंसर 9,10,11 में भूमिका निभाने का अनुमान लगाया जाता है। फिर भी, उन्हें प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन के स्तरको कम करके विरोधी भड़काऊ गुण माना जाता है। जबकि एनईटी अनुसंधान के व्यापक क्षेत्र में अधिक रुचि प्राप्त कर रहे हैं, भविष्य के अनुसंधान के लिए एक मजबूत नेट डिटेक्शन विधि मौलिक है।

भले ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके विभिन्न ऊतकों में एनईटी का विज़ुअलाइज़ेशन जटिल है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के अलावा अनुकूलन की आवश्यकता होती है, यह वर्तमान में एनईटी और कोशिकाओं के बीच बातचीत को देखने के लिए सबसे प्रसिद्ध तरीकों में से एक है और मुख्य रूप से फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों (एफएफपीई) 13,14 में उपयोग किया जाता है।. हालांकि, नेट इमेजिंग की तुलना करना मुश्किल है, क्योंकि विभिन्न प्रयोगशालाएं अपने स्वयं के अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करती हैं। ये प्रोटोकॉल एंटीबॉडी, एंटीजन पुनर्प्राप्ति, या परमेबिलाइजेशन विधि के उनके उपयोग में भिन्न होते हैं और अक्सर एक विशिष्ट प्रकार के ऊतक 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 के लिए अनुकूलित होते हैं।, 27.

ब्रिंकमैन एट अल ने एफएफपीई ऊतक में एनईटी के इम्यूनोफ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग करके पहला मेथोडिक अध्ययन प्रकाशित करने के बाद, हम इस प्रोटोकॉल को ऊतकों और प्रजातियोंकी एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित करना चाहते थे। इसके अतिरिक्त, एक व्यापक रूप से लागू इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए, हमने अध्ययनों से विभिन्न संशोधित प्रोटोकॉल का परीक्षण किया, जिन्होंने एनईटी 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 का पता लगाने के लिए एफएफपीई ऊतक में इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधियों का उपयोग किया। 26,27. इसके अलावा, हमने अधिक विशिष्ट बाह्य धुंधला28 के लिए एक नए एच 3 सीआईटी एंटीबॉडी की कोशिश की। हम अनुमान लगाते हैं कि विभिन्न प्रजातियों और ऊतकों के लिए वर्तमान धुंधला प्रोटोकॉल को व्यवस्थित रूप से अनुकूलित करके, इन विट्रो इमेजिंग में सुधार किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय और व्यवस्थित रूप से न्यूट्रोफिल और एनईटी के बीच बातचीत का बेहतर प्रतिनिधित्व होता है।

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Protocol

इस अध्ययन में हैम्बर्ग स्टेट एडमिनिस्ट्रेशन फॉर एनिमल रिसर्च द्वारा अनुमोदित प्रयोगों से प्राप्त माउस ऊतक शामिल थे, बेहोर्डे फर जस्टिज़ एंड वर्ब्राउचेर्सचुट्ज़, हैम्बर्ग, जर्मनी (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16)। इस्तेमाल किए गए ऊतक एक सेप्टिक मॉडल से माउस फेफड़े और बृहदान्त्र थे और जली हुई त्वचा थी। हमने 8 सप्ताह के नर और मादा चूहों का इस्तेमाल किया। वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर यूरोपीय निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ सभी प्रयोगों के लिए पालन किया गया था। अनाम मानव नमूनों में नवजात एंटरोकोलाइटिस, जली हुई त्वचा, पित्त एट्रेसिया, स्पोंडिलोडिस्काइटिस और मायोकार्डियम के ऊतक शामिल थे। हैम्बर्ग की मेडिकल रिसर्च एथिक्स कमेटी के अनुसार, नमूनों को सूचित सहमति की आवश्यकता नहीं थी, लेकिन अध्ययन को समिति (डब्ल्यूएफ -026/21) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. नमूना निर्धारण

  1. नमूना निर्धारण, निर्जलीकरण, पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और माउंटिंग 3,15 के लिए अबू अबेद और ब्रिंकमैन से प्राप्त निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
    1. 40 ग्राम पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) को 800 मिलीलीटर ट्रिस-बफर्ड खारा, पीएच 7.4 (टीबीएस) में घोलकर 4% फॉर्मलाडेहाइड समाधान तैयार करें।
    2. मिश्रण को फ्यूम हुड के नीचे 60 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं जब तक कि पीएफए घुल न जाए। समाधान को कमरे के तापमान (आरटी) पर लाएं, और टीबीएस के साथ मात्रा को 1,000 एमएल तक समायोजित करें।
    3. पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। 2-3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. नमूना निर्धारण के लिए, टीबीएस बफर में ताजा ऊतक रखें, और 20 मिमी x 30 मिमी x 3 मिमी से छोटे टुकड़ों में विच्छेदन करें। ऊतक वर्गों को 12-24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में डुबोएं।
    नोट: मूल प्रोटोकॉल ने 2% पीएफए समाधान और 8-20 घंटे के निर्धारण समय का उपयोग किया। इस विधि के साथ, कुछ ऊतक वर्गों को 20 घंटे के बाद पूरी तरह से नहीं लगाया गया था, इसलिए पीएफए एकाग्रता को 4% पीएफए तक बढ़ा दिया गया था।
  3. नमूने को लेबल ऊतक प्रसंस्करण कैसेट में स्थानांतरित करें। लेबलिंग के लिए विलायक-प्रतिरोधी मार्कर या पेंसिल का उपयोग करें।
  4. नमूना निर्जलीकरण शुरू करके 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में कैसेट डालें। फिर, 80% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, 96% इथेनॉल, और 100% इथेनॉल में दो बार, प्रत्येक चरण 1 घंटे तक चलता है।
  5. 100% जाइलीन (डाइमिथाइलबेंजीन) में दो बार और फिर हर बार 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पैराफिन में दो बार डुबोएं।
  6. माउंटिंग के लिए मोल्ड एम्बेड करने का उपयोग करें, और मोल्ड को हटाने से पहले पैराफिन को जमने दें।
  7. 3 μm मोटे ऊतक वर्गों को काटने के लिए एक माइक्रोटोम का उपयोग करें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कटे हुए वर्गों को बिछाने के लिए चिमटी का उपयोग करें, और ऊतक कटौती को फैलाने के लिए उन्हें सतह पर तैरने दें।
  9. अनुभागों को चिपकने वाली ग्लास स्लाइड (सामग्री की तालिका) पर रखें, और उन्हें 40 डिग्री सेल्सियस गर्मी कक्ष में रात भर सूखने दें।

2. नमूना पुनर्जलीकरण

  1. डिपैराफिनाइजेशन के लिए, स्लाइड को स्लाइड रैक में ढेर करें, और जाइलीन प्रतिस्थापन मध्यम लिमोनेन (सामग्री की तालिका) में 5 मिनट के लिए दो बार और 1: 1 लिमोनेन / इथेनॉल मिश्रण में 5 मिनट के लिए एक बार डुबोएं।
    सावधानी: लिमोनेन 50 डिग्री सेल्सियस पर ज्वलनशील है और एलर्जी का कारण बन सकता है। आंखों की सुरक्षा और दस्ताने के साथ फ्यूम हुड के नीचे उपयोग करें। खुली आग से दूर रहें।
  2. स्लाइड रैक को 100% इथेनॉल में दो बार और एक बार 96% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, 80% इथेनॉल और 70% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए डुबोकर अवरोही इथेनॉल श्रृंखला में नमूनों को फिर से हाइड्रेट करें।
  3. किसी भी शेष इथेनॉल को साफ करने के लिए विआयनीकृत पानी (डीआई पानी) में स्लाइड रैक को 5 मिनट के लिए डुबोएं।

3. ऑटोफ्लोरेसेंस ब्लॉकिंग और एंटीजन रिट्रीवल

  1. डेटाशीट के अनुसार पीएच 6 साइट्रेट लक्ष्य पुनर्प्राप्ति समाधान (टीआरएस) (सामग्री की तालिका) तैयार करें। यह टीआरएस 10 गुना केंद्रित है। इसलिए, डीआई पानी के साथ 1: 10 पतला करें। एक प्लास्टिक स्टेनिंग जार में 96 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
    नोट: टीआरएस एंटीजन एपिटोप्स को उजागर करने के लिए नमूना निर्धारण के दौरान बने मेथिलीन पुलों को तोड़ता है। यह प्राथमिक एंटीबॉडी को अपने लक्ष्य एंटीजन को बांधने की अनुमति देता है। 8 महीने के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर टीआरएस को स्टोर करें। हमेशा नए सिरे से टीआरएस तैयार करें।
  2. स्लाइड रैक से स्लाइड ्स को बाहर निकालें, और उन्हें गीले कक्ष में रखें। प्रत्येक नमूने पर ऑटोफ्लोरेसेंस-रिड्यूसिंग एजेंट (सामग्री की तालिका) की एक से दो बूंदें पिपेट। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाला एजेंट अंतर्जात फ्लोरोफोरेस और फिक्सेटिव के कारण अंतर्निहित ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को अवरुद्ध करता है। 1 वर्ष तक आरटी पर ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट को स्टोर करें।
    नोट: नमूनों के सूखने या इनक्यूबेशन समय से अधिक होने से बचने के लिए केवल ऊतकों के छोटे वर्गों के साथ काम करें।
  3. स्लाइड को स्लाइड रैक में वापस स्टैक करें, और ऊपर और नीचे की गति का उपयोग करके 60% इथेनॉल में 1 मिनट के लिए कुल्ला करें जब तक कि सभी अप्रयुक्त ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले अभिकर्मक को धोया न जाए।
  4. डीआई पानी में 5 मिनट के लिए स्लाइड रैक को डुबोएं।
  5. एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए, स्लाइड को पहले से गर्म टीआरएस के साथ एक धुंधला जार में स्थानांतरित करें। पानी के स्नान में 96 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: 96 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान को माइक्रोवेव या स्टीम कुकर के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है यदि टीआरएस को 96 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है और 96 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन समय के 10 मिनट सुनिश्चित किए जाते हैं।
  6. धुंधला जार बाहर निकालें, और इसे लगभग 60-90 मिनट के लिए आरटी में धीरे-धीरे ठंडा होने दें।
    नोट: प्रोटोकॉल को टीआरएस में स्लाइड छोड़ते हुए 4 घंटे तक यहां रोका जा सकता है।
  7. टीआरएस को हटा दें, लेकिन जार में स्लाइड रखें। किसी भी बचे हुए टीआरएस अवशेषों को धोने के लिए प्रत्येक 3 मिनट के लिए 0.05% ट्वीन (टीबीएसटी, पीएच 7.4) के साथ ट्रिस-बफर्ड सेलाइन के साथ दो बार कुल्ला करें।
  8. परमेबिलाइजेशन के लिए, फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस), पीएच 7.4 में 0.2% ट्राइटन तैयार करें, और इसे 10 मिनट के लिए नमूनों को स्थिर करने के लिए धुंधला जार में भरें।
    नोट: परमेबिलाइजेशन निश्चित नमूनों में इंट्रासेल्युलर लक्ष्य प्रोटीन के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के बंधन को बढ़ाता है।
  9. हर बार 3 मिनट के लिए टीबीएसटी में दो बार स्लाइड को फिर से धोएं।
  10. गीला कक्ष तैयार करें, और स्लाइड बिछाएं। कागज के ऊतकों के साथ स्लाइड से अतिरिक्त पानी पोंछें। एंटीबॉडी समाधान को चलने से रोकने के लिए हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन के साथ हर नमूने को सर्कल करें।
    नोट: नमूने को सूखने न दें। छोटे वर्गों के साथ काम करना सबसे अच्छा है।

4. निरर्थक एंटीबॉडी बाइंडिंग को अवरुद्ध करना।

  1. गधे सीरम (सामग्री की तालिका) के साथ उपयोग के लिए तैयार ब्लॉकिंग समाधान लें, और प्रत्येक नमूने पर एक बूंद डालें। आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह अवरुद्ध कदम नमूने पर गैर-बाध्यकारी बाध्यकारी साइटों के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के बंधन को कम करता है। इन निरर्थक एपिटोप्स को अवरुद्ध करने और प्राथमिक एंटीबॉडी को लागू करने के बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी से बंध जाएगा और ऊतक की सतह के साथ बातचीत नहीं करेगा। यह रेडी-टू-यूज़ ब्लॉकिंग अभिकर्मक 6 महीने के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
  2. हार्ड सतह के खिलाफ स्लाइड्स के किनारे पर टैप करके स्लाइड्स से अतिरिक्त ब्लॉकिंग समाधान निकालें। उन्हें कुल्ला न करें।

5. प्राथमिक एंटीबॉडी

  1. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर (सामग्री की तालिका) में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। प्रत्येक नमूने के लिए अंतिम समाधान के लगभग 100 μL का उपयोग करें। एनई और एच 3 सिट (आर 8) एंटीबॉडी और आइसोकंट्रोल के लिए, 5 μg / mL की एकाग्रता तक पतला करें। एमपीओ और संबंधित आइसोकंट्रोल के लिए, 10 μg / mL का उपयोग करें। प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक ट्यूब और प्रत्येक आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के लिए एक ट्यूब तैयार करें।
    नोट: H3cit (R8)/MPO या NE/MPO और उनके आइसोकंट्रोल को NETs धुंधला करने के लिए जोड़ा जा सकता है। H3cit (R8)/MPO के संयोजन के लिए, H3cit (R8) के लिए 5 μg/mL और MPO के लिए 10 μg/mL की अंतिम सांद्रता को प्रति नमूना 100 μL की अंतिम मात्रा तक पतला करें। एनई / एमपीओ के लिए, एनई के लिए 5 μg / mL और MPO के लिए 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता को प्रति नमूना 100 μL की अंतिम मात्रा में पतला करें। आइसोकंट्रोल के लिए, प्रत्येक संबंधित एंटीबॉडी के लिए समान एकाग्रता का उपयोग करें। उपयोग किए गए प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए हमेशा एक नया पिपेट टिप का उपयोग करें। प्राथमिक एंटीबॉडी को 1-2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 वर्ष तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. एक स्लाइड पर दो नमूनों के साथ, एक का उपयोग आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के लिए और एक का उपयोग एमपीओ / एच 3 सिट या एमपीओ / एनई एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए करें। प्रत्येक नमूने के लिए लगभग 100 μL का उपयोग करें, और एंटीबॉडी समाधान को समान रूप से फैलाएं।
    नोट: नमूने को सूखने न दें। आइसोकंट्रोल और प्राथमिक एंटीबॉडी को मिलाने से बचने के लिए सावधान रहें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गीले कक्ष में स्टोर करें।
  4. अगले दिन, स्लाइड से अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को टैप करें, और स्लाइड को एक क्यूवेट में स्टैक करें। शेष प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को धोने के लिए टीबीएसटी के साथ हर बार 5 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला करें।

6. द्वितीयक एंटीबॉडी

  1. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। दो अलग-अलग फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करें: एमपीओ के लिए गधा-विरोधी बकरी और एच 3 सिट धुंधला होने के लिए गधा-विरोधी खरगोश। एंटीबॉडी तनुकरण बफर (सामग्री की तालिका) के साथ प्रत्येक को 7.5 μg / mL की एकाग्रता तक पतला करें।
    नोट: डबल-स्टेनिंग के लिए, विभिन्न उत्तेजना क्षेत्रों और न्यूनतम वर्णक्रमीय ओवरलैप के साथ दो फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग करें। दोनों द्वितीयक एंटीबॉडी को मिलाएं, और प्रति नमूना 100 μL की अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए 7.5 μg / mL की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। प्रकाश से एंटीबॉडी की रक्षा करें। द्वितीयक एंटीबॉडी को 6-8 सप्ताह के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस या 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. स्लाइड को गीले कक्ष में रखें, और प्रत्येक नमूने पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 100 μL जोड़ें। उन्हें आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने दें और प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  3. अतिरिक्त द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को टैप करें, और स्लाइड रैक में स्लाइड को स्टैक करें। किसी भी शेष अनबाउंड एंटीबॉडी को धोने के लिए पीबीएस से भरे एक धुंधला जार में 5 मिनट के लिए तीन बार डुबोएं।
  4. DAPI (4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल) समाधान (सामग्री की तालिका) तैयार करें, और डीआई पानी के साथ 1 μg / mL की एकाग्रता तक पतला करें। स्लाइड रैक को DAPI घोल के साथ एक धुंधला जार में डुबोएं, और अंधेरे में RT पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: DAPI का उपयोग डबल-फंसे डीएनए के लिए फ्लोरोसेंट दाग के रूप में किया जाता है। तैयार DAPI समाधान का उपयोग कई बार किया जा सकता है। तैयार DAPI समाधान को RT पर स्टोर करें। DAPI एकाग्रता को 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. अतिरिक्त DAPI घोल को धोने के लिए पीबीएस के साथ एक धुंधला जार में स्लाइड रैक को 5 मिनट के लिए डुबोएं।

7. नमूनों को माउंट करना और संग्रहीत करना, सूक्ष्म विश्लेषण

  1. नमूने को कवरलिप्स और माउंटिंग माध्यम (सामग्री की तालिका) के साथ माउंट करें।
    नोट: केवल माउंटिंग माध्यम की थोड़ी मात्रा का उपयोग करें, और गीले ऊतकों के साथ अतिरिक्त माध्यम को मिटा दें। दस्ताने पहनें, और कवरलिप्स या स्लाइड से गलती से किसी भी माध्यम को पोंछने से बचें। बुलबुला गठन से बचें, और स्लाइड से किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए कवरलिप्स पर धीरे से दबाने के लिए कपास के स्वैब का उपयोग करें।
  2. इमेजिंग के लिए, एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप या एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: पहले आइसोकंट्रोल की एक छवि लें। प्रतिदीप्ति फिल्टर (DAPI के लिए नीले फिल्टर को छोड़कर) के लिए एक्सपोजर समय कम करें जब तक कि लगभग कोई संकेत नहीं पाया जा सके। उसके बाद, संबंधित नमूने की जाँच करने के लिए इस सेटिंग का उपयोग करें। उन क्षेत्रों की तलाश करें जहां प्रतिदीप्ति चैनल का उपयोग करके प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने में एक फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता लगाया जा सकता है। क्षेत्र की एक छवि लेने के बाद, कार्यक्रम सभी चैनलों की एक यौगिक छवि उत्पन्न करता है और विभिन्न प्रतिदीप्ति संकेतों को विभिन्न रंगों के ओवरलैप के रूप में दिखाता है। छवि को इमेजजे जैसे इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ सह-स्थानीयकरण के लिए आगे विश्लेषण किया जा सकता है।
  3. स्लाइड्स को 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

हमारे प्रोटोकॉल अनुकूलन शुरू करने से पहले, हमने एनईटी के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एफएफपीई ऊतक का उपयोग करने वाले अध्ययनों के लिए पबमेड की खोज करके सफल धुंधला होने के लिए महत्वपूर्ण चरणों की पहचान की और उनके प्रोटोकॉल की तुलना की। प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए सबसे आशाजनक प्रोटोकॉल मतभेदों को प्रमुख चरणों के रूप में पहचाना गया था, जबकि ज्यादातर एक-दूसरे से मेल खाने वाले चरणों को नहीं बदला गया था (तालिका 1)।

तालिका 1: एनईटी के एफएफपीई इम्यूनोस्टेनिंग के लिए पबमेड रिसर्च। यह तालिका जांच किए गए अध्ययनों में इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल में चर दिखाती है। उपयोग किए गए प्रोटोकॉल को उनके आवश्यक चरणों में विभाजित किया गया था और फिर एक दूसरे के साथ तुलना की गई थी। सबसे आशाजनक अंतर वाले कदम तब अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण कदम के रूप में लिए गए थे और हमारे प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किए गए थे। ज्यादातर एक-दूसरे के अनुरूप कदम नहीं बदले गए थे, जैसे प्राथमिक एंटीबॉडी (रात भर, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए इनक्यूबेशन समय। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

हमारे निष्कर्षों के आधार पर, हमने निष्कर्ष निकाला कि एपिटोप्स को लक्षित करने के लिए चुने गए एंटीबॉडी पहला महत्वपूर्ण कदम था। कम से कम 10 अलग-अलग प्रोटोकॉल ने ट्राइएच 3 सिट एंटीबॉडी का उपयोग किया ( तालिका 1 देखें; प्राथमिक एंटीबॉडी कॉलम)। बहरहाल, थालिन एट अल ने पाया कि एच 3 सिट (आर 8) क्लोन ने गैर-सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन के लिए कम ऑफ-टारगेट क्रॉस-रिएक्टिविटी प्रदर्शित की और नगण्य अंतर-लॉट परिवर्तनशीलता दिखाई। इस प्रकार, हमनेएक दूसरे के साथ ट्राईएच 3 सीआईटी और एच 3 सीआईटी (आर 8) धुंधला परिणामों की तुलना करने का फैसला किया।

चार अध्ययनों ने मानव / माउस एमपीओ एंटीबॉडी का उपयोग किया। इसके अलावा, दो अन्य प्रोटोकॉल माउस ऊतक के लिए एमपीओ (2 डी 4) और मानव ऊतक के लिए एमपीओ (2 सी 7) लागू करते हैं ( तालिका 1 देखें; प्राथमिक एंटीबॉडी कॉलम)। इसलिए, हमने अलग से एमपीओ (2 सी 7) की तुलना मानव ऊतकों के लिए मानव / माउस एमपीओ एंटीबॉडी के साथ और माउस ऊतकों के लिए मानव / माउस एमपीओ एंटीबॉडी के साथ एमपीओ (2 डी 4) के साथ की। एनई का पता कम से कम पांच अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके लगाया गया था, लेकिन उनमें से केवल तीन ने प्रदान की गई छवियों में अच्छे धुंधला परिणाम दिखाए। हालांकि, एक एंटीबॉडी अब बाजार में उपलब्ध नहीं था, इसलिए हमने मानव ऊतकों में हमारी परीक्षण श्रृंखला के लिए एक माउस होस्ट से खरगोश मेजबान से एनई एंटीबॉडी की तुलना की। माउस के नमूनों के लिए, इस अध्ययन की शुरुआत में खरगोश मेजबान में उठाए गए एनई एंटीबॉडी का कोई उपलब्ध और विश्वसनीय विकल्प नहीं था। चूंकि एक एनई और दोनों एच 3 सीआईटी एंटीबॉडी एक ही खरगोश मेजबान से प्राप्त होते हैं, इसलिए उन्हें इस प्रोटोकॉल के साथ डबल स्टेनिंग के लिए जोड़ा नहीं जा सकता है। द्वितीयक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी के निरंतर क्षेत्र के लिए विशिष्ट है, जो उस मेजबान द्वारा निर्धारित किया जाता है जिसमें इसे उठाया गया था। यदि एक ही मेजबान से प्राप्त दो प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, तो द्वितीयक एंटीबॉडी दोनों प्राथमिक एंटीबॉडी से बंध सकता है, और धुंधलापन अस्पष्ट होगा। हालांकि, सिंगल स्टेनिंग की तुलना में डबल स्टेनिंग को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि अधिक नेट घटकों का पता लगाया जा सकता है और सह-स्थानीयकृत किया जा सकता है। इसलिए, धुंधला परिणाम अधिक विशिष्ट होगा। नतीजतन, हम अधिक मजबूत पहचान प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए एच 3 सीआईटी और एमपीओ के लिए डबल-सना हुआ है।

उपयोग किए गए एंटीबॉडी में समानता के बावजूद, एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने लगभग सभी प्रोटोकॉल में भिन्न होते हैं; उदाहरण के लिए, triH3cit के लिए, एकाग्रता सीमा 0.5 μg / mL से 20 μg / mL17,18 तक थी। उपयोग किए गए प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, हमने अलग-अलग कमजोर पड़ने की कोशिश की और साहित्य में रिपोर्ट की गई पूरी श्रृंखला में संतोषजनक धुंधला परिणाम प्राप्त किया।

इसके अलावा, प्राथमिक एंटीबॉडी (4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर) और द्वितीयक एंटीबॉडी के उपयोग और कमजोर पड़ने के लिए इनक्यूबेशन समय में कई समानताएं पाई जा सकती हैं ( तालिका 1 देखें; इनक्यूबेशन प्राथमिक एंटीबॉडी कॉलम)। इसलिए, हमने अपनी टेस्ट श्रृंखला में इन चरणों को नहीं बदला और उन्हें ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया।

साहित्य से निर्धारित अगला महत्वपूर्ण कदम एंटीजन पुनर्प्राप्ति था। यह कदम आवश्यक है क्योंकि, फॉर्मेलिन निर्धारण के कारण, एंटीबॉडी के लिए एपिटोप्स को मेथिलीन पुलों के माध्यम से मुखौटा किया जाता है, जिसे उपयुक्त बफर29 में ऊतक अनुभाग को गर्म करके उलट दिया जा सकता है। पीएच 6 पर साइट्रेट टीआरएस और पीएच 9 पर ईडीटीए टीआरएस बफर का उपयोग साहित्य में समान रूप से किया गया था और समान परिणाम दिए गए थे ( तालिका 1 देखें; टीआरएस बफर कॉलम)। इस प्रकार, हमने अपनी परीक्षण श्रृंखला के लिए पीएच 6 साइट्रेट टीआरएस पर फैसला किया। एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए, हमने दो अलग-अलग हीटिंग विधियों का परीक्षण किया: एक माइक्रोवेव (पहले 360 डब्ल्यू पर 1 मिनट और फिर 90 डब्ल्यू पर 9 मिनट के साथ बाद) और एक पानी का स्नान (90 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 96 डिग्री सेल्सियस)।

साहित्य में कुछ परिवर्तनशीलता दिखाने वाला अंतिम चरण ट्राइटन एक्स -100 के साथ परमेबिलाइजेशन था। इस कदम के लिए अनुकूलन की आवश्यकता थी क्योंकि डिटर्जेंट उपचार के साथ, कोशिका झिल्ली एंटीबॉडी के लिए पारगम्य हो जाती है, और इंट्रासेल्युलर एपिटोप्स30 तक पहुंच सकते हैं। पिछले प्रोटोकॉल में 1% से 0.1% तक की विभिन्न ट्राइटन एक्स -100 सांद्रता का उपयोग किया गया था ( तालिका 1 देखें; परमेबिलाइजेशन कॉलम)। इसलिए, हमने दो ट्राइटन एक्स -100 सांद्रता (0.2% और 0.5%) और एक श्रृंखला की कोशिश की जिसमें कोई ट्राइटन परमेबिलाइजेशन नहीं था।

इन प्रमुख चरणों की पहचान करने के बाद, हमने उन्हें संशोधित किया और प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की कोशिश की। फिर छवियों की जांच एक मूल्यांकन शीट के अनुसार की गई, और मतभेदों को अर्ध-मात्रात्मक रूप से दर्ज किया गया और तुलना की गई ( तालिका 2 देखें)।

तालिका 2: प्रोटोकॉल चरणों को अनुकूलित करने के लिए परिणामों की तालिका। यह तालिका अनुकूलित चरणों के लिए परिणाम दिखाती है: ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाला एजेंट, एंटीजन पुनर्प्राप्ति, और परमेबिलाइजेशन। इस परीक्षण श्रृंखला को शुरू करने से पहले, हमने सर्वोत्तम एंटीबॉडी संयोजन और एकाग्रता के लिए परीक्षण किया। स्लाइडों का मूल्यांकन 10 अलग-अलग क्षेत्रों में किया गया था, और फिर एक प्रतिनिधि क्षेत्र को नकारात्मक परिणाम के लिए (-) से सकारात्मक नेट युक्त परिणाम के लिए (++) तक स्कोर किया गया था। आंशिक रूप से सकारात्मक परिणामों में गैर-न्यूट्रोफिल कोशिकाओं की एक उच्च प्रसार पृष्ठभूमि धुंधला पन शामिल था। संक्षेप: n/u = उपयोग नहीं किया जाता है; - = नकारात्मक परिणाम; +/-आंशिक रूप से सकारात्मक धुंधलापन; + = मध्यम विशिष्ट धुंधलापन; + = एनईटी और न्यूट्रोफिल का अच्छा धुंधलापन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

प्राथमिक एंटीबॉडी
प्रोटोकॉल को अपनाने से पहले, हमने सबसे अच्छा एंटीबॉडी संयोजन खोजने की कोशिश की। यहां, ट्राइएच 3 सिट ने एच 3 सिट (आर 8) की तुलना में अधिक इंट्रासेल्युलर हिस्टोन धुंधला दिखाया। एनईटी का पता लगाने के लिए, हमने अपने प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए एच 3 सीआईटी (आर 8) एंटीबॉडी का उपयोग करने का निर्णय लिया। यह एंटीबॉडी केवल बाह्य एच 3 सीआईटी से बंधी हुई है और इस एकाग्रता पर इंट्रासेल्युलर एच 3 सिट का कोई धुंधलापन नहीं दिखाया गया है ( चित्रा 1 ए, बी देखें)।

एमपीओ धुंधला करने के लिए, हमने मानव ऊतक के लिए एमपीओ (2 सी 7) के साथ मानव / माउस एमपीओ एंटीबॉडी की तुलना की (चित्रा 1 सी, डी देखें) और माउस ऊतक के लिए एमपीओ (2 डी 4) (चित्रा 1 ई, एफ देखें)। एमपीओ (2 डी 4) और एमपीओ (2 सी 7) एंटीबॉडी कई ऊतक प्रकारों के लिए लगातार धुंधलापन प्राप्त नहीं कर सके, जबकि मानव / माउस एमपीओ के परिणामस्वरूप एमपीओ के लिए विश्वसनीय, अच्छा धुंधलापन हुआ। इस प्रकार, हमने अपने धुंधला प्रोटोकॉल के लिए मानव / माउस एमपीओ का चयन किया।

एनई के लिए, हमने मानव ऊतक पर एक माउस होस्ट से एनई एंटीबॉडी की कोशिश की, जिसने खरगोश मेजबान से एनई एंटीबॉडी के विश्वसनीय धुंधलापन की तुलना में पांच नमूनों में से केवल एक में एनई धुंधला दिखाया। इसके अतिरिक्त, खरगोश मेजबान से एनई एंटीबॉडी मानव और माउस ऊतक पर लागू होता है। ( चित्र 1 जी, एच देखें)।

Figure 1
चित्रा 1: विभिन्न ऊतकों में प्राथमिक एंटीबॉडी तुलना। (ए) मानव नवजात एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) ऊतक एच 3 सीआईटी (आर 8) (लाल) से सना हुआ है। यहां, केवल एक बाह्य संकेत का पता लगाया जा सकता है। (बी) ट्राइएच 3 सिट (आर 2,8,17) (लाल) से सना हुआ एक ही ऊतक। यह एंटीबॉडी सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन (पीले तीर) के तीव्र इंट्रासेल्युलर धुंधलापन के साथ एक व्यापक संकेत बनाता है। (C, E) मानव एनईसी ऊतक (सी) और माउस वॉल्वुलस ऊतक (ई) एच 3 सिट (आर 8) (लाल) और माउस / मानव एमपीओ (हरे) के लिए अच्छा धुंधलापन है। H3cit, MPO, और DAPI (नीला) सिग्नल सह-स्थानीयकरण NET गठन (सफेद तीर) को इंगित करता है। (D, F) इसकी तुलना में, (डी) मानव एनईसी ऊतक के लिए एमपीओ (2 सी 7) और माउस वॉल्वुलस ऊतक के लिए (एफ) एमपीओ (2 डी 4) (हरा) का उपयोग करके, कोई एमपीओ सिग्नल प्राप्त नहीं किया जा सका। (G) माउस होस्ट से एनई एंटीबॉडी के लिए (एच) नकारात्मक धुंधला परिणाम की तुलना में खरगोश मेजबान (मैजेंटा) से एनई एंटीबॉडी के लिए बहुत मजबूत धुंधलापन के साथ जले हुए मानव त्वचा का नमूना। आइसोटाइप नियंत्रण के लिए, पूरक चित्र आइसोकंट्रोल 1 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डिपैराफिनाइजेशन
यहां, जाइलीन को लिमोनेन के साथ बदल दिया गया था, जिसने पृष्ठभूमि में कम ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ जाइलीन की तुलना में ऊतक के नमूनों के बेहतर डिपैराफिनाइजेशन के बराबर दिखाया ( चित्रा 2 ए, बी देखें)।

ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाला एजेंट
सूडान ब्लैक पर आधारित रेडी-टू-यूज़ ऑटोफ्लोरेसेंस-रिड्यूसिंग एजेंट को 2-20 मिनट के लिए लागू किया जा सकता है। यहां, हमने इसे 0 मिनट, 5 मिनट और 10 मिनट के लिए लागू किया। जब कोई ब्लॉकिंग का उपयोग नहीं किया गया था, तो कुछ माउस नमूनों ने अधिक गैर-विशिष्ट धुंधलापन दिखाया, और आंशिक सकारात्मक धुंधलापन तक पहुंचा जा सकता है ( चित्रा 2 सी देखें)। 5 मिनट के ब्लॉकिंग समय ने माउस फेफड़े और त्वचा के ऊतकों में एच 3 सीआईटी और एमपीओ को छोड़कर सभी ऊतक प्रकारों में अच्छे परिणाम दिखाए ( तालिका 2 देखें)। कुछ नमूनों में 10 मिनट के ब्लॉकिंग समय पर, धुंधलापन कम उज्ज्वल होने लगा, इसलिए 5 मिनट की समय सीमा ऑटोफ्लोरेसेंस को अवरुद्ध करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प है ( चित्रा 2 डी, ई देखें)।

Figure 2
चित्रा 2: डिपैराफिनाइजेशन विधियां और ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट का उपयोग। (ए) मानव स्पोंडिलोडिस्काइटिस ऊतक को लिमोनेन के साथ अलग किया गया और एच 3 सिट (लाल) और एमपीओ (हरे) के लिए दाग दिया गया। संकेतों के फंसे हुए गठन और आंशिक सह-स्थानीयकरण एनईटी (सफेद तीर) की उपस्थिति का संकेत देते हैं। (B) एक ही ऊतक का नमूना जाइलीन के साथ डिपैराफिनाइज्ड होता है, जिसके परिणामस्वरूप समान धुंधला परिणाम होते हैं, यह दर्शाता है कि व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले जाइलीन को प्रतिस्थापन माध्यम के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। (C-E) प्रेरित सेप्सिस के बाद माउस फेफड़े के ऊतक अलग-अलग एनई धुंधला पैटर्न (मैजेंटा) दिखाते हैं जब ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट के लिए अलग-अलग इनक्यूबेशन समय का उपयोग किया जाता है। कोई ऑटोफ्लोरेसेंस रिड्यूसर का उपयोग नहीं किया गया है, छवि सी अभी भी एरिथ्रोसाइट्स (लाल तीर) की थोड़ी पृष्ठभूमि धुंधला दिखाती है। इसके विपरीत, छवि डी से पता चलता है कि ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट के साथ 5 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, एक स्पष्ट संकेत उत्सर्जित होता है। 10 मिनट के बाद, छवि ई में धुंधला गुणवत्ता कम हो जाती है, और सिग्नल कम उज्ज्वल हो जाता है। आइसोटाइप नियंत्रण के लिए, पूरक चित्र आइसोकंट्रोल 2 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एंटीजन पुनर्प्राप्ति के तरीके
एनई धुंधला करने के लिए, हमने माइक्रोवेव में 10 मिनट के लिए पीएच 6 साइट्रेट बफर में नमूने गर्म किए (पहले 360 डब्ल्यू पर 1 मिनट के लिए और फिर 90 डब्ल्यू पर 9 मिनट के लिए), 96 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए, या 60 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 90 मिनट के लिए। यहां, माइक्रोवेव और पानी के स्नान में उच्च तापमान ने लगातार मध्यम से अच्छे एंटीजन पुनर्प्राप्ति को दिखाया ( चित्रा 3 ए देखें)। माइक्रोवेव और 96 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया ( तालिका 2 देखें)। इसके अलावा, यह दिखाया गया था कि 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में, केवल आंशिक रूप से सकारात्मक से कोई धुंधलापन नहीं था ( चित्रा 3 बी देखें)। केवल मानव इलियम और मानव मायोकार्डियम ने अच्छे विशिष्ट परिणाम दिखाए। चूंकि 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के साथ एनई के लिए कोई पर्याप्त धुंधलापन हासिल नहीं किया जा सकता था, इसलिए एच 3 सीआईटी और एमपीओ के लिए 60 डिग्री सेल्सियस जल स्नान परीक्षण श्रृंखला को छोड़ दिया गया था।

एमपीओ और एच 3 सीआईटी के साथ डबल-धुंधला करने के लिए, हमने माइक्रोवेव में पीएच 6 साइट्रेट बफर में नमूने को 10 मिनट के लिए गर्म किया (पहले 360 डब्ल्यू पर 1 मिनट के लिए और फिर 90 डब्ल्यू पर 9 मिनट के लिए) या 10 मिनट के लिए 96 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में। यहां, दोनों विधियों ने 96 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के लिए थोड़ा अधिक अनुकूल परिणाम दिखाते हुए अच्छे विशिष्ट परिणाम दिखाए ( चित्रा 3 सी देखें)। केवल माउस फेफड़े और त्वचा ऊतक एक मध्यम समग्र रैंकिंग प्राप्त कर सकते हैं ( तालिका 2 देखें)।

हालांकि, 96 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के इनक्यूबेशन समय से अधिक होने के परिणामस्वरूप कम तीव्र एंटीबॉडी धुंधलापन हुआ, जबकि काफी अधिक पृष्ठभूमि धुंधलापन देखा जा सकता है ( चित्रा 3 डी देखें)।

Figure 3
चित्रा 3: एंटीजन पुनर्प्राप्ति विधियां। (ए) गर्मी पुनर्प्राप्ति के लिए 96 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट इनक्यूबेशन समय का उपयोग करके एनई (मैजेंटा) के लिए सना माउस वॉल्वुलस ऊतक 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 90 मिनट के लिए नमूने को इंजेक्ट करते समय (बी) की तुलना में काफी मजबूत संकेत दिखाता है। (सी) इसके अलावा, 96 डिग्री सेल्सियस एंटीजन पुनर्प्राप्ति में 10 मिनट इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप संयुक्त नेट स्टेनिंग (सफेद तीर) के साथ एच 3 सीआईटी (लाल) और एमपीओ (हरा) के लिए एक मजबूत संकेत भी होता है। D: हालांकि, 40 मिनट से अधिक समय तक नमूनों को उबालने से कम विशिष्ट बाह्य एच 3 सीट धुंधलापन होता है और कोई एमपीओ धुंधला नहीं होता है। आइसोटाइप नियंत्रण के लिए, पूरक चित्र आइसोकंट्रोल 3 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

परमेबिलाइजेशन
हमने 10 मिनट के लिए ट्राइटन एक्स -100 के साथ दो कमजोर पड़ने (0.2% और 0.5%) में नमूनों को प्रतिस्थापित करने की कोशिश की और इसकी तुलना विआयनीकृत पानी में 10 मिनट से की। यहां, ट्राइटन 0.2% के साथ 10 मिनट ने सभी ऊतक प्रकारों में अच्छे परिणाम प्राप्त किए, भले ही अंतर 0.5% ट्राइटन और विआयनीकृत पानी की स्थिति की तुलना में छोटे थे ( तालिका 2 देखें)।

पूरक चित्र आइसोकंट्रोल 1: चित्रा 1 के लिए आइसोटाइप नियंत्रण। सभी छवियां अच्छी डीएपीआई (नीली) धुंधलापन दिखाती हैं लेकिन फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के लिए कोई संकेत नहीं है। यह पुष्टि करता है कि चित्रा 1 में प्राथमिक एंटीबॉडी का बंधन लक्ष्य एंटीजन के लिए विशिष्ट है और गैर-विशिष्ट बाध्यकारी या प्रोटीन इंटरैक्शन का परिणाम नहीं है। (ए) मानव नवजात एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) ऊतक एच 3 सीआईटी (आर 8) (लाल) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी से सना हुआ है। (बी) एच 3 सीआईटी (आर 2,8,17) (लाल) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ सना हुआ एनईसी ऊतक। (सी) एनईसी ऊतक (ई) और माउस वॉल्वुलस ऊतक एच 3 सीआईटी (आर 8) (लाल) और माउस / मानव एमपीओ (हरे) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी से सना हुआ है। (डी) एच 3 सीआईटी (आर 8) (लाल) और एमपीओ (2 सी 7) (हरा) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी से सना एनईसी ऊतक। (एफ) माउस वॉल्वुलस ऊतक एच 3 सीआईटी (आर 8) (लाल) और एमपीओ 2 डी 4 (हरे) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी से सना हुआ है। G: खरगोश मेजबान (मैजेंटा) से एनई एंटीबॉडी के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ जले हुए मानव त्वचा का नमूना। (एच) एक माउस होस्ट (मैजेंटा) से एनई एंटीबॉडी के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ सना हुआ एक ही ऊतक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र आइसोकंट्रोल 2: चित्रा 2 के लिए आइसोटाइप नियंत्रण। सभी छवियां अच्छी डीएपीआई (नीली) धुंधलापन दिखाती हैं लेकिन फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के लिए कोई संकेत नहीं है। यह चित्रा 2 में प्राथमिक एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन की पुष्टि करता है। छवियां सी-ई अभी भी लंबे एक्सपोजर समय के कारण मैजेंटा में कुछ पृष्ठभूमि धुंधला दिखाती हैं। हालांकि, चित्रा 2 में एनई सिग्नल पृष्ठभूमि धुंधला होने से अलग है। (A) मानव स्पोंडिलोडिस्काइटिस ऊतक को लिमोनेन के साथ डिपैराफिन किया गया और एच 3 सिट (आर 8) (लाल) और माउस / मानव एमपीओ (हरे) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। (B) एक ही ऊतक का नमूना जाइलीन के साथ डिपैराफिन किया गया और एच 3 सिट (लाल) और एमपीओ (हरे) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। (C) माउस फेफड़े के ऊतक एनई (मैजेंटा) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ सना हुआ है, जिसमें कोई ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट का उपयोग नहीं किया गया है। (D) एनई (मैजेंटा) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी और ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट के साथ 5 मिनट इनक्यूबेशन से सना हुआ एक ही ऊतक। (ई) एनई (मैजेंटा) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी और ऑटोफ्लोरेसेंस-रिड्यूसिंग एजेंट के साथ 10 मिनट इनक्यूबेशन से सना हुआ एक ही ऊतक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र आइसोकंट्रोल 3: चित्रा 3 के लिए आइसोटाइप नियंत्रण। सभी छवियां अच्छी डीएपीआई (नीली) धुंधला दिखाती हैं लेकिन फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के लिए कोई विशिष्ट संकेत नहीं है। यह चित्रा 3 में प्राथमिक एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन की पुष्टि करता है। (ए) माउस वॉल्वुलस ऊतक गर्मी पुनर्प्राप्ति के लिए 96 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट इनक्यूबेशन समय का उपयोग करके एनई (मैजेंटा) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ सना हुआ है। (बी) एनई (मैजेंटा) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ सना हुआ एक ही ऊतक और 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 90 मिनट के लिए गर्मी पुनर्प्राप्ति। (सी) एच 3 सीआईटी (लाल) और एमपीओ (हरे) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ सना हुआ एक ही ऊतक और ए के समान गर्मी पुनर्प्राप्ति स्थितियों के साथ। हरा बिंदु समेकित द्वितीयक एंटीबॉडी की एक धुंधला कलाकृति दिखाता है। (डी) एच 3 सिट (लाल) और एमपीओ (हरे) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के साथ सना हुआ एक ही ऊतक और गर्मी पुनर्प्राप्ति के लिए 96 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट इनक्यूबेशन समय का उपयोग करना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र आइसोकंट्रोल 4: चित्रा 4 के लिए आइसोटाइप नियंत्रण। निम्नलिखित सभी आइसोकंट्रोल संबंधित "असफल" प्रयोग के समान स्लाइड से हैं। असफल प्रयास जानबूझकर नहीं किए गए थे, इसलिए कुछ आइसोकंट्रोल उपयोग करने योग्य दिखाई देते हैं, जबकि नमूना नहीं था। (ए) एनईसी ऊतक एच 3 सिट (लाल) और एमपीओ (हरा) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी से सना हुआ था। इस नमूने को सूखने के बिना तेजी से संसाधित किया गया था। इसलिए, कोई अत्यधिक पृष्ठभूमि धुंधला दिखाई नहीं देता है। हरे और लाल रंग की संरचनाएं द्वितीयक एंटीबॉडी समुच्चय हैं। (B) स्पोंडिलोडिस्काइटिस ऊतक एनई (मैजेंटा) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी से सना हुआ है। यहां, डिपैराफिनाइजेशन सफल रहा, इसलिए कोई पैराफिन अवशेष नहीं देखा जा सकता है। (C) एनईसी ऊतक एच 3 सीआईटी (लाल) और एमपीओ (हरे) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी से सना हुआ है। भले ही उसी अनुचित रूप से संग्रहीत द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था, लेकिन इस आइसोकंट्रोल छवि के लिए कोई धुंधलापन अपेक्षित नहीं होगा। इसलिए, इस छवि का उपयोग संबंधित छवि के विशिष्ट बाइंडिंग का मूल्यांकन करने के लिए नहीं किया जा सकता है। (D) जली हुई मानव त्वचा H3cit (लाल) और MPO (हरा) के लिए आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी से सना हुआ है। यहां, माउंटिंग को अधिक सावधानी से किया गया था, और हवा के बुलबुले के माध्यम से कोई प्रकाश प्रकीर्णन नहीं देखा जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस काम में, हमने वास्तविक धुंधला प्रक्रिया से शुरू होने वाले अधिक ऊतक प्रकारों के लिए इमेजिंग एनईटी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल को अनुकूलित और अनुकूलित करने का लक्ष्य रखा। इस विधि के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम सबसे उपयुक्त एंटीबॉडी का चयन है। एनई के लिए, हमने मानव ऊतक पर एक माउस होस्ट से एनई एंटीबॉडी की कोशिश की, जिसने खरगोश मेजबान से एनई की तुलना में कोई विश्वसनीय धुंधलापन नहीं दिखाया। इसके अलावा, थैलिन एट अल ने एच 3 सिट (आर 8) को बाह्य धुंधला होने के लिए एक अधिक विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में प्रस्तावित किया। हमने इस एंटीबॉडी की तुलना व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले ट्राइएच 3 सिट (आर 2, आर 8, आर 17) के साथ की। हमारे अध्ययन से पता चला है कि H3cit (R8) एंटीबॉडी केवल उपयोग की गई सांद्रता पर एक बाह्य संकेत के लिए दाग लगाता है, जिससे स्लाइड पर NETs की आसानी से पहचान हो सकती है। यह खोज थैलिन एट अल के दावों का समर्थन करती है कि एच 3 सिट (आर 8) क्लोन गैर-सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन28 के लिए ऑफ-टारगेट क्रॉस-रिएक्टिविटी में कमी के साथ एक अच्छा नेट सिग्नल प्रदान कर सकता है। हमने एमपीओ धुंधला करने के लिए मानव और माउस ऊतक के लिए एमपीओ एंटीबॉडी की तुलना भी की। हमारे परिणाम बताते हैं कि माउस / मानव एमपीओ एंटीबॉडी ने अधिक विश्वसनीय धुंधलापन दिखाया और प्रयोगशाला में इसके उपयोग को सरल बनाते हुए मानव और माउस के नमूनों पर एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। नतीजतन, हम भविष्य के शोध के लिए इस एंटीबॉडी संयोजन, एच 3 सीआईटी (आर 8) और माउस / मानव एमपीओ का उपयोग करने की सलाह देते हैं और इसे हमारे प्रोटोकॉल में लागू करते हैं।

हालांकि, इस एंटीबॉडी चयन के साथ कई धुंधला प्रयासों के लिए एक सीमा है। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न मेजबानों से प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए संशोधित किया गया था। अन्यथा, एक द्वितीयक एंटीबॉडी दोनों प्राथमिक एंटीबॉडी से बंध सकता है। H3cit एंटीबॉडी एनई एंटीबॉडी के समान मेजबान से आता है, इसलिए हम NE और H3cit को एक साथ दाग नहीं सकते हैं। भले ही इस अध्ययन में कोई ट्रिपल स्टेनिंग (एनई, एच 3 सीआईटी, एमपीओ) नहीं किया गया था, यह प्रोटोकॉल भविष्य में ट्रिपल-स्टेनिंग प्रयोगों के लिए एक नींव के रूप में काम कर सकता है। ट्रिपल-स्टेनिंग या एनई और एच 3 सिट डबल-स्टेनिंग के लिए एक संभावित विकल्प इन एंटीबॉडी में से एक को एक अलग मेजबान से विश्वसनीय एंटीबॉडी के साथ आदान-प्रदान करना हो सकता है। इस मामले में, एक संभावित संयोजन भागीदार एनई एंटीबॉडी (सांता क्रूज़; एससी -55549) हो सकता है जो टेकस्टेड एट अल .24 द्वारा उपयोग की जाने वाली भेड़ से होता है। डुलर एट अल द्वारा एक और विकल्प 2021 में प्रकाशित किया गया था, जहां उन्होंने लगातार डबल-स्टेनिंग विधि का उपयोग किया और खरगोश मेजबान26 से एनई और एच 3 सिट को जोड़ा। मल्टीपल-स्टेनिंग विधि का एक अतिरिक्त आशाजनक अनुप्रयोग इंट्रा- और एक्स्ट्रावास्कुलर नेट गठन के बीच भेदभाव के लिए है। नेट मार्करों के लिए ट्रिपल स्टेनिंग के बजाय, डबल नेट स्टेनिंग को अतिरिक्त संवहनी धुंधलापन के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने अल्जाइमर रोग जैसे विशिष्ट रोगों के पैथोमैकेनिज्म पर अधिक ज्ञान प्राप्त करने के लिए एनईटी के इंट्रा-और एक्स्ट्रावास्कुलर वितरण की जांच की है। स्मिथ एट अल .31 ने दो संभावित स्थानीयकरणों के बीच अंतर करने के लिए हमारे समान एक आशाजनक और गहन प्रोटोकॉल का वर्णन किया। उन्होंने एंडोथेलियल कोशिकाओं को लेबल करने के लिए एक बायोटिनीलेटेड लेक्टिन जोड़कर अपने मौजूदा नेट स्टेनिंग प्रोटोकॉल को संशोधित किया और लेक्टिन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के लिए फ्लोरोफोरे-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग किया। एक ही छवि में लेक्टिन और नेट मार्करों के सह-स्थानीयकरण की जांच करके, वे इंट्रावस्कुलर एनईटी31 की पहचान करने में सक्षम थे। इस संदर्भ में, हमारे प्रोटोकॉल के आवेदन का विस्तार करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

सबसे उपयुक्त एंटीबॉडी संयोजन खोजने के बाद, अगला महत्वपूर्ण कदम एक ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट को पेश कर रहा है। एक्सोजेनस कारक जैसे कि फॉर्मलाडेहाइड फिक्सेटिव ्स और एरिथ्रोसाइट्स जैसे अंतर्जात कारकों का उपयोग करके नमूना निर्धारण के परिणामस्वरूप उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस हो सकता है, जो सह-स्थानीयकरणको मुश्किल बनाता है। यह समस्या मुख्य रूप से नीले (उत्तेजना क्षेत्र: 430-480 एनएम) और हरे फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा (उत्तेजना क्षेत्र: 500-550 एनएम) में होती है और इसके परिणामस्वरूप अनिर्णायक धुंधला परिणाम हो सकता है जब एक ही उत्तेजना क्षेत्र के साथ प्रतिदीप्तिएंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। साहित्य सूडान ब्लैक को अंतर्निहित ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस33 को कम करने के लिए एक प्रभावी एजेंट होने की रिपोर्ट करता है। सूडान ब्लैक नीले या हरे रंग के प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग करके स्पष्ट धुंधला परिणाम प्राप्त करना संभव बनाता है। यह उत्तेजना क्षेत्र भविष्य के कई धुंधला प्रयासों के लिए आवश्यक होगा क्योंकि चौथे फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करते समय नीले और हरे रंग के चैनलों की आवश्यकता होती है। हमारे अध्ययन से पता चलता है कि इष्टतम इनक्यूबेशन समय धुंधला प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले ऊतक और एंटीबॉडी के प्रकार पर निर्भर करता है। फिर भी, इस काम में, ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट के 5 मिनट ने आम तौर पर सभी ऊतक प्रकारों पर अच्छे परिणाम दिए और नमूने को काला करने का लाभ मिला, इस प्रकार स्लाइड पर देखना आसान हो गया। इसने धुंधला प्रक्रिया में ऊतकों के लापता हिस्सों को रोका, खासकर छोटे नमूनों के साथ।

इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक और आवश्यक कारक एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण के लिए एक निरंतर उच्च तापमान है। हमारे शोध से पता चला है कि पिछले 15 अध्ययनों में से 10 ने एंटीजन पुनर्प्राप्तिके लिए 96 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान का उपयोग किया 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27। यह हमारे परिणामों के अनुरूप था, जहां 96 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान या माइक्रोवेव में नमूनों को शामिल करने से बिना किसी महत्वपूर्ण अंतर के अच्छे परिणाम मिले। बहरहाल, हम गर्मी वितरण के लिए भी पानी के स्नान का उपयोग करने की सलाह देते हैं। माइक्रोवेव का उपयोग करते समय, हमें धुंधला जार के ऊपर और नीचे के बीच 5 डिग्री सेल्सियस तक के बफर में तापमान ढाल मिला। इसके अतिरिक्त, पानी के स्नान का उपयोग करना आसान है और बफर उबलने का खतरा कम है। परमेबिलाइजेशन के लिए, हमने पाया कि ट्राइटन एक्स -100 का धुंधलापन पर कम प्रभाव पड़ा। इसलिए, प्रोटोकॉल में इस कदम को छोड़ना परिणाम पर प्रतिकूल प्रभाव डाले बिना संभव है। आम तौर पर, मानव नमूने माउस के नमूनों की तुलना में बेहतर परिणाम देते हैं। इसका एक कारण यह हो सकता है कि मनुष्यों में चूहों 34,35 की तुलना में न्यूट्रोफिल का प्रतिशतअधिक होता है। इसके अतिरिक्त, माउस फेफड़ों के नमूनों ने कोई दिखाई देने वाली मैक्रोस्कोपिक सूजन और कम न्यूट्रोफिल नहीं दिखाए, जबकि माउस आंत के नमूने मैक्रोस्कोपिक रूप से सूजन थे और अच्छे धुंधला परिणाम दिखाए गए थे। इस प्रकार, हमारे अध्ययन में कम स्कोर कम सूजन के परिणामस्वरूप हो सकता है और प्रोटोकॉल के बेहतर तरीके से काम नहीं करने के कारण नहीं हो सकता है।

समस्या निवारण के लिए, प्रोटोकॉल में मामूली त्रुटियां या नमूनों को ध्यान से नहीं संभालने से धुंधला परिणामों पर भारी प्रभाव पड़ सकता है। एक बड़ी समस्या जिसे हमने पहचाना वह नमूना निर्जलीकरण था। यहां, हमने पाया कि एक बार में 10-15 से अधिक स्लाइडों को संभालना महत्वपूर्ण था क्योंकि हर कदम समय लेने वाला है और इसके परिणामस्वरूप नमूनों का निर्जलीकरण हो सकता है। उच्च पृष्ठभूमि धुंधला होने और कोई पता लगाने योग्य विशिष्ट प्रतिदीप्ति संकेत नहीं होने के कारण निर्जलित नमूने अब उपयोग करने योग्य नहीं हैं (चित्रा 4 ए देखें)। इसके अतिरिक्त, धुंधला प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले नमूने को पूरी तरह से डिपैराफिनाइज्ड किया जाना चाहिए। पैराफिन अवशेषों के परिणामस्वरूप एक मजबूत पृष्ठभूमि संकेत हुआ, और काटने की रेखाओं को दाग वाले पैराफिन में देखा जा सकता है (चित्रा 4 बी देखें)। इसके अलावा, 20 से अधिक फ्रीज-पिघलाव चक्रों के बाद, एमपीओ के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए कोई संकेत नहीं पाया जा सका (चित्रा 4 सी देखें)। छवि की गुणवत्ता पर बहुत प्रभाव डालने वाला एक और महत्वपूर्ण कदम अंतिम माउंटिंग चरण की हैंडलिंग है। इस काम में, कवरस्लिप के नीचे हवा के बुलबुले के परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट सिग्नल का बिखराव हुआ और इस प्रकार, एक धुंधली छवि (चित्रा 4 डी देखें)।

Figure 4
चित्रा 4: समस्या निवारण युक्तियाँ. (ए) यह पैनल सूखे हुए नमूने के परिणाम को दर्शाता है। ठोस लाल पृष्ठभूमि धुंधला नमूने के किसी भी मूल्यांकन में बाधा डालता है। (B) यहां, लाल तीर पैराफिन अवशेष दिखाता है, जो नालीदार उपस्थिति की विशेषता है, एक अपर्याप्त डिपैराफिनाइजेशन के बाद। इन अवशेषों के परिणामस्वरूप एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत और कम गुणवत्ता वाली छवियां होती हैं। (C) अपर्याप्त एंटीबॉडी भंडारण या 20 से अधिक फ्रीज-पिघलने चक्रों के परिणामस्वरूप द्वितीयक एंटीबॉडी (हरे तीर) का एकत्रीकरण होता है और एमपीओ के लिए कोई बंधन नहीं होता है। (D) इसे सावधानी से नहीं किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप हवा के बुलबुले हो सकते हैं और इसलिए, फ्लोरोसेंट लाइट (नीला तीर) का प्रकीर्णन हो सकता है। यह छवि की गुणवत्ता को काफी प्रभावित कर सकता है, खासकर जब प्रकीर्णन लक्ष्य को धुंधला कर देता है। आइसोटाइप नियंत्रण के लिए, पूरक चित्र आइसोकंट्रोल 4 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

भले ही एनईटी वैज्ञानिक अनुसंधान में अधिक लोकप्रियता प्राप्त कर रहे हैं, फिर भी नेट का पता लगाने के तरीकों पर ध्यान केंद्रित करने वाले पर्याप्त अध्ययन नहीं हैं 3,13,17,26। हमारे ज्ञान के लिए, हम एफएफपीई ऊतक में एनईटी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए विभिन्न अध्ययनों से प्रोटोकॉल की तुलना करने वाला पहला अध्ययन प्रस्तुत करते हैं। पहले प्रकाशित अनुकूलित प्रोटोकॉल उनके एंटीबॉडी या एंटीजन पुनर्प्राप्ति विधियों में भिन्न थे और अक्सर केवल एक ऊतक प्रकार के लिए डिज़ाइन किए गए थे, जिससे नेट इमेजिंग परिणामों की तुलना करना अधिक कठिन हो जाता है। इसलिए, इस अध्ययन में, हमने महत्वपूर्ण चरणों की पहचान की और विभिन्न माउस और मानव ऊतकों के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल स्थापित किया। हमने एच 3 सीआईटी धुंधला होने के लिए एक नए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके और एक ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट के साथ पृष्ठभूमि धुंधला पन को कम करके इसे हासिल किया। इसके अलावा, हमने दिखाया कि एक निरंतर उच्च तापमान महत्वपूर्ण है, और नमूनों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग सफल नेट धुंधला होने के लिए मौलिक है। इसलिए, यह अध्ययन एनईटी को धुंधला करने के लिए आम तौर पर लागू प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए आवश्यक कदम प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध की स्थापना जर्मन रिसर्च सोसाइटी (बीओ 5534) द्वारा की गई थी। हम एंटोनिया किविट, मोरिट्ज़ लेनज़, जोहाना हेगेंस, डॉ अन्निका ह्यूर, और पीडी डॉ इंगो कोनिग्स को हमें नमूने प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इसके अतिरिक्त, लेखक इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ समर्थन के लिए यूकेई माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा (कोर सुविधा, यूकेई मेडिकल स्कूल) की टीम को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

मानव और माउस ऊतकों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग
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Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

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