Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunofluorescensavbildning av neutrofila extracellulära fällor i vävnader från människa och mus

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

Neutrofila extracellulära fällor (NET) är förknippade med olika sjukdomar, och immunofluorescens används ofta för att visualisera dem. Det finns dock olika färgningsprotokoll, och i många fall undersöks endast en typ av vävnad. Här etablerar vi ett allmänt tillämpligt protokoll för färgning av NET i mus- och mänsklig vävnad.

Abstract

Neutrofila extracellulära fällor (NET) frigörs av neutrofiler som svar på bakterieinfektion eller traumatisk vävnadsskada, men spelar också en roll vid autoimmuna sjukdomar och steril inflammation. De är nätliknande strukturer som består av dubbelsträngade DNA-filament, histoner och antimikrobiella proteiner. När NET väl har släppts ut kan de fånga och döda extracellulära patogener i blod och vävnad. Dessutom deltar NET i homeostatisk reglering genom att stimulera trombocytadhesion och koagulation. Men den dysreglerade produktionen av NET har också förknippats med olika sjukdomar, inklusive sepsis eller autoimmuna sjukdomar, vilket gör dem till ett lovande mål för terapeutisk intervention. Förutom elektronmikroskopi är visualisering av NET med hjälp av immunofluorescensavbildning för närvarande en av de enda kända metoderna för att påvisa NET-interaktioner i vävnad. Därför har olika färgningsmetoder för att visualisera NET använts. I litteraturen beskrivs olika färgningsprotokoll, och vi identifierade fyra nyckelkomponenter som visar hög variabilitet mellan protokollen: (1) de typer av antikroppar som används, (2) användningen av autofluorescensreducerande medel, (3) antigenhämtningsmetoder och (4) permeabilisering. Därför har in vitro immunofluorescensfärgningsprotokoll systematiskt anpassats och förbättrats i detta arbete för att göra dem tillämpliga för olika arter (mus, människa) och vävnader (hud, tarm, lunga, lever, hjärta, ryggskiva). Efter fixering och paraffininbäddning monterades 3 μm tjocka sektioner på objektglas. Dessa prover färgades med primära antikroppar för myeloperoxidas (MPO), citrullinerad histon H3 (H3cit) och neutrofil elastas (NE) enligt ett modifierat färgningsprotokoll. Objektglasen färgades med sekundära antikroppar och undersöktes med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Resultaten analyserades enligt ett utvärderingsformulär och skillnader registrerades semikvantitativt.

Här presenterar vi ett optimerat NET-färgningsprotokoll som lämpar sig för olika vävnader. Vi använde en ny primär antikropp för att färga för H3cit och minskade ospecifik färgning med ett autofluorescensreducerande medel. Vidare visade vi att NET-färgning kräver en konstant hög temperatur och noggrann hantering av prover.

Introduction

Neutrofila extracellulära fällor (NET) visualiserades först av Brinkmann et al. som en väg för celldöd som skiljer sig från apoptos och nekros 20041. I denna väg släpper neutrofiler ut sitt dekondenserade kromatin i det extracellulära utrymmet för att bilda stora nätliknande strukturer täckta av antimikrobiella proteiner som tidigare lagrades i granulerna eller cytosolen. Dessa antimikrobiella proteiner inkluderar neutrofilt elastas (NE), myeloperoxidas (MPO) och citrullinerad histon H3 (H3cit), som vanligtvis används för indirekt immunofluorescensdetektion av NET2. Denna metod identifierar inte bara den kvantitativa närvaron av dessa proteiner; Det har faktiskt fördelen att det specifikt detekterar NET-liknande strukturer. I NET samlokaliseras de nämnda proteinerna med extracellulärt DNA, vilket kan detekteras genom en överlappning av fluorescenssignalerna för varje färgat protein och det extracellulära DNA:t. Till skillnad från de överlappande signalerna på grund av extracellulärt DNA och proteinsamlokalisering i NET, visar intakta neutrofiler ingen samlokalisering. Här lagras NET-komponenterna vanligtvis separat i granuler, kärnor och cytosol3.

Sedan den första upptäckten har det visat sig att NET spelar en central roll i många sjukdomar, särskilt de som involverar inflammation. NET visar antimikrobiella funktioner under infektion genom att fånga och döda extracellulära patogener i blod och vävnad 4,5. Men NET har också kopplats till autoimmuna sjukdomar och hyperinflammatoriska svar, som systemisk lupus erythematosus, reumatisk artrit och allergisk astma 6,7,8. NET främjar vasoocklusion och inflammation vid åderförkalkning, trombocytvidhäftning och spekuleras spela en roll i metastaserande cancer 9,10,11. Ändå tros de ha antiinflammatoriska egenskaper genom att minska proinflammatoriska cytokinnivåer12. Även om NET blir allt mer intressant inom ett bredare forskningsområde, är en robust NET-detektionsmetod grundläggande för framtida forskning.

Även om visualisering av NET i olika vävnader med hjälp av immunofluorescensavbildning är komplex och kräver anpassning, förutom elektronmikroskopi, är det för närvarande en av de mest kända metoderna för att visualisera interaktionerna mellan NET och celler och används främst i formalinfixerade paraffininbäddade vävnader (FFPE)13,14. Det är dock svårt att jämföra NET-avbildning, eftersom olika laboratorier använder sina egna anpassade protokoll. Dessa protokoll skiljer sig åt i sin användning av antikroppar, antigenhämtning eller permeabiliseringsmetod och är ofta optimerade för en specifik typ av vävnad 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Efter att Brinkmann et al. publicerade den första metodiska studien med immunofluorescensvisualisering av NET i FFPE-vävnad, ville vi optimera detta protokoll för en bredare variation av vävnader och arter15. Dessutom, för att etablera ett brett tillämpligt immunofluorescensprotokoll, testade vi olika modifierade protokoll från studier som använde immunfluorescensmetoder i FFPE-vävnad för att detektera NET 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Dessutom provade vi en ny H3cit-antikropp för mer specifik extracellulär färgning28. Vår hypotes är att genom att systematiskt anpassa nuvarande färgningsprotokoll till olika arter och vävnader kan in vitro-avbildning förbättras, vilket resulterar i en bättre representation av interaktionen mellan neutrofiler och NET både lokalt och systemiskt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna studie inkluderade musvävnader som härrör från experiment som godkänts av Hamburg State Administration for Animal Research, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Tyskland (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Vävnaderna som användes var muslunga och tjocktarm från septisk modell samt bränd hud. Vi använde 8 veckor gamla han- och honmöss. Det europeiska direktivet 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål följdes för alla försök. De anonymiserade mänskliga proverna inkluderade vävnader från neonatal enterokolit, bränd hud, gallvägsatresi, spondylodiskit och myokardiet. Enligt den medicinska forskningsetiska kommittén i Hamburg behövde proverna inte informerat samtycke, men studien godkändes av kommittén (WF-026/21).

1. Fixering av prover

  1. Använd följande protokoll härlett från Abu Abed och Brinkmann för provfixering, dehydrering, paraffininbäddning, sektionering och montering 3,15.
    1. Bered 4 % formaldehydlösning genom att lösa upp 40 g paraformaldehyd (PFA) i 800 ml Tris-buffrad koksaltlösning, pH 7,4 (TBS).
    2. Rör om blandningen vid 60 °C under dragskåp tills PFA har lösts upp. Ta lösningen till rumstemperatur (RT) och justera volymen med TBS till 1 000 ml.
    3. Justera pH-värdet till 7,4. Förvaras vid 4 °C i 2-3 veckor eller vid −20 °C i upp till 1 år.
  2. För provfixering, placera färsk vävnad i TBS-buffert och dissekera i bitar som är mindre än 20 mm x 30 mm x 3 mm. Sänk ner vävnadssnitten i 4% paraformaldehydlösning i 12-24 timmar.
    OBS: Det ursprungliga protokollet använde en 2% PFA-lösning och en fixeringstid på 8-20 timmar. Med denna metod var vissa vävnadssnitt inte helt fixerade efter 20 timmar, så PFA-koncentrationen ökades till 4 % PFA.
  3. Överför proverna till märkta vävnadsbearbetningskassetter. Använd lösningsmedelsresistenta markörer eller pennor för märkning.
  4. Starta sample uttorkning genom att sänka ner sedan kassetter i 70% etanol i 1 timme. Sänk sedan ner i 80 % etanol, 90 % etanol, 96 % etanol och två gånger i 100 % etanol, där varje steg varar 1 timme.
  5. Sänk ner två gånger i 100 % xylen (dimetylbensen) och sedan två gånger i 60 °C paraffin i 1 timme varje gång.
  6. Använd inbäddningsformar för montering och låt paraffinet stelna innan du tar bort formen.
  7. Använd en mikrotom för att skära 3 μm tjocka vävnadssnitt.
  8. Använd en pincett för att lägga de skurna sektionerna i ett 37 °C vattenbad och låt dem flyta på ytan för att sträcka ut vävnadssnitten.
  9. Placera sektionerna på självhäftande glasskivor (materialtabell) och låt dem torka över natten i en 40 °C värmekammare.

2. Återfuktning av prover

  1. För avparaffinisering, stapla objektglasen i ett objektställ och sänk ner dem två gånger i 5 minuter vardera i xylenersättningsmediet limonen (materialtabell) och en gång i 5 minuter i en 1:1 limonen/etanolblandning.
    VARNING: Limonen är brandfarligt vid 50 °C och kan orsaka allergiska reaktioner. Använd under dragskåp med ögonskydd och handskar. Håll borta från öppen eld.
  2. Rehydrera proverna i en fallande etanolserie genom att sänka ner objektstället två gånger i 100 % etanol och en gång i 96 % etanol, 90 % etanol, 80 % etanol och 70 % etanol i 5 minuter vardera.
  3. Sänk ner glidstället i 5 minuter i avjoniserat vatten (DI-vatten) för att rensa bort eventuell kvarvarande etanol.

3. Autofluorescensblockering och antigenhämtning

  1. Bered pH 6 citrat target retrieval solution (TRS) (Materialförteckning) enligt databladet. Denna TRS är koncentrerad 10 gånger. Späd därför 1:10 med DI-vatten. Värm i en färgburk av plast till 96 °C.
    OBS: TRS bryter metylenbroarna som bildas under provfixering för att exponera antigenepitoperna. Detta gör det möjligt för de primära antikropparna att binda sitt målantigen. Förvara koncentrerad TRS vid 2-8 °C i 8 månader. Förbered alltid färsk TRS.
  2. Ta ut objektglasen ur rutschkanstället och placera dem i en våt kammare. Pipettera en till två droppar autofluorescensreducerande medel (materialtabell) på varje prov. Inkubera i 5 min.
    OBS: Det autofluorescensreducerande medlet blockerar den inneboende vävnadsautofluorescensen som orsakas av endogena fluoroforer och fixeringsmedel. Förvara det autofluorescensreducerande medlet vid RT i upp till 1 år.
    OBS: Arbeta endast med små delar av vävnader för att undvika uttorkning av samples eller överskrida inkubationstiden.
  3. Stapla tillbaka objektglasen i objektglasstället och skölj i 1 minut i 60 % etanol med en uppåt- och nedåtgående rörelse tills allt oanvänt autofluorescensreducerande reagens har tvättats bort.
  4. Sänk ner glidstället i 5 minuter i DI-vatten.
  5. För antigenhämtning, överför objektglasen till en färgningsburk med den förvärmda TRS. Inkubera i 10 minuter vid 96 °C i ett vattenbad.
    OBS: Vattenbadet på 96 °C kan ersättas med en mikrovågsugn eller ångkokare om TRS är förvärmd till 96 °C och 10 minuters inkubationstid vid 96 °C säkerställs.
  6. Ta ut färgburken och låt den svalna långsamt till RT i cirka 60-90 min.
    OBS: Protokollet kan pausas här i upp till 4 timmar och lämna bilderna i TRS.
  7. Ta bort TRS, men behåll objektglasen i burken. Skölj två gånger med Tris-buffrad koksaltlösning med 0,05 % Tween (TBST, pH 7,4) i 3 minuter vardera för att tvätta bort eventuella överblivna TRS-rester.
  8. För permeabilisering, förbered 0,2 % Triton i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), pH 7,4, och fyll den i färgningsburken för att permeabilisera proverna i 10 minuter.
    OBS: Permeabilisering förbättrar bindningen av de primära antikropparna med de intracellulära målproteinerna i de fasta proverna.
  9. Skölj objektglasen igen två gånger i TBST i 3 minuter varje gång.
  10. Förbered den våta kammaren och lägg ner objektglas. Torka av överflödigt vatten från objektglasen med pappersnäsdukar. Ringa in varje prov med en hydrofob barriärpenna för att förhindra att antikroppslösningen rinner av.
    OBS: Låt inte samples torka ut. Det är bäst att arbeta med små sektioner.

4. Blockering av icke-specifik antikroppsbindning

  1. Ta en bruksfärdig blockeringslösning med åsneserum (Materialförteckning) och pipettera en droppe på varje prov. Inkubera i 30 min vid RT.
    OBS: Detta blockeringssteg minimerar bindningen av den sekundära antikroppen till ospecifika bindningsställen på provet. Efter att ha blockerat dessa ospecifika epitoper och applicerat den primära antikroppen kommer den sekundära antikroppen att binda till den primära antikroppen och inte interagera med vävnadens yta. Detta färdiga blockerande reagens lagras vid 2-8 °C i 6 månader.
  2. Ta bort överflödig blockerande lösning från objektglasen genom att knacka kanten på objektglasen mot en hård yta. Skölj dem inte.

5. Primär antikropp

  1. Späd primära antikroppar i antikroppsutspädningsbuffert (Materialförteckning). Använd cirka 100 μl av den slutliga lösningen för varje prov. För NE- och H3cit-antikroppar och isokontroll, späd till en koncentration av 5 μg/ml. För MPO och motsvarande isokontroll, använd 10 μg/ml. Bered ett rör för varje primär antikropp och ett för varje isocontrol-antikropp.
    OBS: H3cit (R8)/MPO eller NE/MPO och deras isokontroller kan kombineras för NET-färgning. För kombinationen av H3cit (R8)/MPO, späd till en slutlig koncentration på 5 μg/ml för H3cit (R8) och 10 μg/ml för MPO till en slutlig volym på 100 μl per prov. För NE/MPO späds till en slutlig koncentration av 5 μg/ml för NE och 10 μg/ml för MPO till en slutlig volym av 100 μL per prov. För isokontroll, använd samma koncentration som för varje motsvarande antikropp. Använd alltid en ny pipettspets för varje antikropp som används. Primära antikroppar kan förvaras vid 4 °C i 1-2 veckor och vid −20 °C eller −80 °C i upp till 1 år.
  2. Med två prover på ett objektglas används ett för isocontrol-antikropparna och ett för utspädningen av MPO/H3cit- eller MPO/NE-antikroppar. Använd cirka 100 μl för varje prov och fördela antikroppslösningen jämnt.
    OBS: Låt inte samples torka ut. Var noga med att undvika att blanda ihop isocontrol och primära antikroppar.
  3. Förvaras i våtrum över natten vid 4 °C.
  4. Nästa dag, knacka bort överskottet av primär antikroppslösning från objektglasen och stapla objektglasen i en kyvett. Skölj tre gånger i 5 minuter varje gång med TBST för att tvätta bort den återstående primära antikroppslösningen.

6. Sekundär antikropp

  1. Bered den sekundära antikroppslösningen. Använd två olika fluorescerande sekundära antikroppar: åsna-anti-get för MPO och åsna-anti-kanin för H3cit-färgning. Späd var och en till en koncentration av 7,5 μg/ml med antikroppsutspädningsbuffert (Materialförteckning).
    OBS: För dubbelfärgning, använd två fluorescerande antikroppar med olika excitationsområden och minimal spektral överlappning. Kombinera båda sekundära antikropparna och späd till en slutlig koncentration av 7,5 μg/ml för varje antikropp för en slutlig volym på 100 μl per prov. Skydda antikropparna från ljus. De sekundära antikropparna kan förvaras vid 2-8 °C i 6-8 veckor eller vid −80 °C i upp till 1 år.
  2. Förvara glasen i våtkammaren och tillsätt 100 μl av den sekundära antikroppslösningen till varje prov. Låt dem ruva i 30 minuter vid RT och skyddade från ljus.
  3. Knacka bort överskottet av sekundär antikroppslösning och stapla objektglasen i objektglasstället. Sänk ner tre gånger i 5 minuter vardera i en färgningsburk fylld med PBS för att tvätta bort eventuella kvarvarande obundna antikroppar.
  4. Bered DAPI-lösning (4',6-diamidino-2-fenylindol) (Materialförteckning) och späd med DI-vatten till en koncentration av 1 μg/ml. Sänk ner glidstället i en färgburk med DAPI-lösning och inkubera i 5 minuter vid RT i mörkret.
    OBS: DAPI används som en fluorescerande färgning för dubbelsträngat DNA. Den förberedda DAPI-lösningen kan användas flera gånger. Förvara den förberedda DAPI-lösningen på RT. DAPI-koncentratet kan förvaras vid −20 °C i upp till 1 år.
  5. Sänk ner objektglasstället i 5 minuter i en färgningsburk med PBS för att tvätta bort överflödig DAPI-lösning.

7. Montering och förvaring av proverna, mikroskopisk analys

  1. Montera proverna med täckglas och monteringsmedium (Materialförteckning).
    OBS: Använd endast små mängder monteringsmedium och torka bort överflödigt medium med våta servetter. Använd handskar och undvik att av misstag torka bort något medium från täckglasen eller objektglasen. Undvik bubbelbildning och använd bomullspinnar för att trycka försiktigt på täckglasen för att ta bort eventuella bubblor från glasen.
  2. För avbildning, använd ett vidvinkelmikroskop eller ett konfokalmikroskop.
    OBS: Ta en bild av isocontrol först. Sänk exponeringstiden för fluorescensfiltren (förutom det blå filtret för DAPI) tills nästan ingen signal kan detekteras. Använd sedan den här inställningen för att undersöka motsvarande exempel. Leta efter områden där en fluorescerande signal kan detekteras i varje enskilt prov med hjälp av fluorescenskanalen. Efter att ha tagit en bild av området genererar programmet en sammansatt bild av alla kanaler och visar de olika fluorescenssignalerna som en överlappning av olika färger. Bilden kan sedan analyseras ytterligare för samlokalisering med bildbehandlingsprogram som ImageJ.
  3. Förvara objektglasen vid 4 °C i upp till 6 månader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Innan vi påbörjade vår protokolloptimering identifierade vi viktiga steg för framgångsrik färgning genom att söka i PubMed efter studier som använde FFPE-vävnad för immunfärgning av NET och jämförde deras protokoll. De mest lovande protokollskillnaderna identifierades som de viktigaste stegen för protokolloptimeringen, medan steg som till största delen överensstämde med varandra inte ändrades (Tabell 1).

Tabell 1: PubMed-forskning för FFPE-immunfärgning av NET. Denna tabell visar variablerna i immunfärgningsprotokollet i de undersökta studierna. Protokollen som användes delades in i sina väsentliga steg och jämfördes sedan med varandra. Stegen med de mest lovande skillnaderna togs sedan som de viktigaste stegen för optimering och anpassades för vårt protokoll. Steg som i stort sett överensstämde med varandra ändrades inte, som inkubationstiden för den primära antikroppen (över natten, 4 °C). Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Baserat på våra resultat drog vi slutsatsen att de antikroppar som valts för att rikta in sig på epitoperna var det första kritiska steget. I minst 10 olika protokoll användes antikroppen triH3cit (se tabell 1; Primär antikroppskolonn). Icke desto mindre fann Thålin et al. att H3cit-klonen (R8) uppvisade mindre korsreaktivitet utanför målet till icke-citrullinerade histoner och visade försumbar variation mellan partier. Därför bestämde vi oss för att jämföra triH3cit och H3cit (R8) färgningsresultat med varandra28.

I fyra studier användes MPO-antikroppen mot människa/mus. Dessutom tillämpades MPO (2D4) för musvävnad och MPO (2C7) för mänsklig vävnad (se tabell 1; Primär antikroppskolonn). Därför jämförde vi MPO (2C7) separat med MPO-antikroppar från människa/mus för mänskliga vävnader och MPO (2D4) med MPO-antikroppar från människa/mus för musvävnader. NE detekterades med hjälp av minst fem olika antikroppar, men endast tre av dem visade bra infärgningsresultat i de bilder som tillhandahölls. En antikropp fanns dock inte längre tillgänglig på marknaden, så vi jämförde NE-antikroppen från en kaninvärd med en från en musvärd för vår testserie i mänsklig vävnad. För musprover verkade det inte finnas något tillgängligt och tillförlitligt alternativ till NE-antikroppen som odlats i kaninvärd i början av denna studie. Eftersom en NE- och båda H3cit-antikropparna härstammar från samma kaninvärd kan de inte kombineras för dubbelfärgning med detta protokoll. Den sekundära antikroppen är specifik för den primära antikroppens konstanta region, som bestäms av den värd den odlades i. Om två primära antikroppar från samma värd används kan den sekundära antikroppen binda till båda primära antikropparna, och färgningen skulle vara ospecifik. Dubbelfärgning är dock att föredra framför enkelfärgning eftersom fler NET-komponenter kan upptäckas och samlokaliseras. Därför blir färgningsresultatet mer specifikt. Följaktligen dubbelfärgade vi för H3cit och MPO för att få ett mer robust detektionsprotokoll.

Trots likheterna i de antikroppar som användes varierade utspädningarna för antikropparna i nästan alla protokoll; För triH3cit var koncentrationsintervallet till exempel från 0,5 μg/ml till 20 μg/ml17,18. För varje antikropp som användes provade vi olika spädningar och fick tillfredsställande infärgningsresultat i hela det intervall som rapporterats i litteraturen.

Dessutom kunde många likheter hittas i inkubationstiden för den primära antikroppen (över natten vid 4 °C) och användningen och utspädningen av den sekundära antikroppen (se tabell 1; Inkubation av primär antikroppskolonn). Därför ändrade vi inte dessa steg i vår testserie och utförde dem enligt protokollet som beskrivs ovan.

Nästa kritiska steg som bestämdes från litteraturen var antigenhämtningen. Detta steg är viktigt eftersom epitoperna för antikropparna på grund av formalinfixering maskeras genom metylenbryggor, som kan vändas genom att värma vävnadssnittet i en lämplig buffert29. Citrat TRS vid pH 6 och EDTA TRS-buffert vid pH 9 användes lika ofta i litteraturen och gav liknande resultat (se tabell 1; TRS-buffertkolumn). Därför bestämde vi oss för pH 6-citrat TRS för vår testserie. För antigenhämtning testade vi två olika uppvärmningsmetoder: en mikrovågsugn (först 1 min vid 360 W och sedan efterföljande med 9 min vid 90 W) och ett vattenbad (60 °C i 90 min, 96 °C i 10 min).

Det sista steget som visade en viss variation i litteraturen var permeabiliseringen med Triton X-100. Detta steg krävde optimering eftersom cellmembranet med tvättmedelsbehandling blir permeabelt för antikroppar och intracellulära epitoper kan nås30. De tidigare protokollen använde olika Triton X-100-koncentrationer från 1 % till 0,1 % (se tabell 1; Permeabiliseringskolumnen). Därför provade vi två Triton X-100-koncentrationer (0,2 % och 0,5 %) och en serie utan Triton-permeabilisering.

Efter att ha identifierat dessa viktiga steg ändrade vi dem och försökte optimera protokollet. Därefter undersöktes bilderna enligt ett utvärderingsformulär och skillnaderna registrerades semikvantitativt och jämfördes (se tabell 2).

Tabell 2: Resultattabell för optimering av protokollstegen. Denna tabell visar resultaten för de anpassade stegen: autofluorescensreducerande medel, antigenhämtning och permeabilisering. Innan vi påbörjade denna testserie testade vi för den bästa antikroppskombinationen och koncentrationen. Objektglasen utvärderades i 10 olika områden, och sedan poängsattes ett representativt område från (-) för ett negativt resultat till (++) för ett positivt NET-innehållande resultat. De delvis positiva resultaten inkluderade en högre diffus bakgrundsfärgning av icke-neutrofila celler. Förkortningar: n/u = används inte. - = negativt resultat; +/- delvis positiv färgning; + = måttlig specifik färgning; + = bra färgning av NET och neutrofiler. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Primära antikroppar
Innan vi anpassade protokollet försökte vi hitta den bästa antikroppskombinationen. Här visade triH3cit mer intracellulär histonfärgning än H3cit (R8). För att detektera NET bestämde vi oss för att använda antikroppen H3cit (R8) för vår protokolloptimering. Denna antikropp band endast till det extracellulära H3cit och uppvisade ingen färgning av intracellulärt H3cit vid denna koncentration (se figur 1A,B).

För MPO-färgning jämförde vi MPO-antikroppar från människa/mus med MPO (2C7) för mänsklig vävnad (se figur 1C,D) och MPO (2D4) för musvävnad (se figur 1E,F). Antikropparna MPO (2D4) och MPO (2C7) kunde inte uppnå konsekvent färgning för flera vävnadstyper, medan MPO för människa/mus resulterade i tillförlitlig, bra färgning för MPO. Därför valde vi MPO för människa/mus för vårt färgningsprotokoll.

För NE provade vi en NE-antikropp från en musvärd på mänsklig vävnad, som visade NE-färgning endast i ett av fem prover jämfört med den tillförlitliga färgningen av NE-antikroppen från en kaninvärd. Dessutom är NE-antikroppen från en kaninvärd tillämplig på vävnad från människa och mus. (se figur 1G,H).

Figure 1
Figur 1: Jämförelse av primära antikroppar i olika vävnader. A) Vävnad av human neonatal enterokolit (NEC) färgad med H3cit (R8) (röd). Här kan endast en extracellulär signal detekteras. (B) Samma vävnad färgad med triH3cit (R2,8,17) (röd). Denna antikropp skapar en bredare signal med intensiv intracellulär färgning av citrullinerade histoner (gula pilar). (C,E) Humant NEC-vävnad (C) och musvolvulusvävnad (E) med god färgning för H3cit (R8) (röd) och mus/människa-MPO (grön). Samlokaliseringen av H3cit-, MPO- och DAPI-signalerna (blå) indikerar NET-bildning (vita pilar). (D,F) Som jämförelse kunde (D) med MPO (2C7) för human NEC-vävnad och (F)MPO (2D4) (grön) för volvulusvävnad från möss ingen MPO-signal erhållas. g) Bränt humant hudprov med mycket stark infärgning för NE-antikroppen från en kaninvärd (magenta) jämfört med det (H) negativa infärgningsresultatet för NE-antikroppen från en musvärd. För isotypkontroll, se tilläggsfigur Isokontroll 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Avparaffinisering
Här ersattes xylen med limonen, vilket visade sig vara likvärdigt med bättre avparaffinisering av vävnadsproverna jämfört med xylen, med mindre autofluorescens i bakgrunden (se figur 2A,B).

Autofluorescensreducerande medel
Det färdiga autofluorescensreducerande medlet baserat på Sudan Black kan appliceras i 2-20 minuter. Här applicerade vi den i 0 min, 5 min och 10 min. När ingen blockering användes visade vissa musprover mer ospecifik färgning, och partiell positiv färgning kunde uppnås (se figur 2C). Blockeringstiden på 5 minuter visade goda resultat i alla vävnadstyper utom H3cit och MPO i muslunga och hudvävnad (se tabell 2). Vid 10 minuters blockeringstid i vissa prover började färgningen bli mindre ljus, så tidsramen på 5 minuter är det bästa valet för att blockera autofluorescens (se figur 2D,E).

Figure 2
Figur 2: Deparaffiniseringsmetoder och användning av ett autofluorescensreducerande medel. (A) Vävnad från human spondylodiskit avparaffiniserad med limonen och färgad för H3cit (röd) och MPO (grön). Den strandade bildningen av signalerna och den partiella samlokaliseringen indikerar närvaron av NET (vit pil). (B) Samma vävnadsprov avparaffiniseras med xylen, vilket resulterar i liknande färgningsresultat, vilket indikerar att den allmänt använda xylen kan ersättas med ett ersättningsmedium. (C-E) Mus lungvävnad efter inducerad sepsis uppvisar olika NE-färgningsmönster (magenta) när olika inkubationstider för det autofluorescensreducerande medlet används. Eftersom ingen autofluorescensreducerare används, visar bild C fortfarande en liten bakgrundsfärgning av erytrocyter (röd pil). Däremot visar bild D att efter 5 minuters inkubation med ett autofluorescensreducerande medel avges en tydlig signal. Efter 10 minuter försämras färgningskvaliteten i bild E och signalen blir mindre ljusstark. För isotypkontroll, se tilläggsfigur Isocontrol 2. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Metoder för att hämta antigen
För NE-färgning värmde vi proverna i pH 6 citratbuffert i 10 min i mikrovågsugn (först i 1 min vid 360 W och sedan i 9 min vid 90 W), i 10 min i ett vattenbad vid 96 °C, eller i 90 min i ett vattenbad vid 60 °C. Här visade de högre temperaturerna i mikrovågs- och vattenbadet genomgående måttlig till god antigenhämtning (se figur 3A). Ingen signifikant skillnad hittades mellan mikrovågsugnen och vattenbadet med 96 °C (se tabell 2). Dessutom visade det sig att i ett 60 °C vattenbad var det endast delvis positivt eller ingen färgning alls (se figur 3B). Endast humant ileum och humant myokardium visade goda specifika resultat. Eftersom ingen lämplig infärgning för NE kunde uppnås med 60 °C vattenbad, förkastades 60 °C vattenbadstestserien för H3cit och MPO.

För dubbelfärgning med MPO och H3cit värmde vi proverna i pH 6 citratbuffert i mikrovågsugnen i 10 min (först i 1 min vid 360 W och sedan i 9 min vid 90 W) eller i ett vattenbad vid 96 °C i 10 min. Här visade båda metoderna goda specifika resultat, med något mer gynnsamma resultat för 96 °C vattenbad (se figur 3C). Endast lung- och hudvävnad från möss kunde uppnå en måttlig total rangordning (se tabell 2).

Överskridande av inkubationstiden på 40 minuter vid 96 °C resulterade dock i mindre intensiv antikroppsfärgning, medan betydligt mer bakgrundsfärgning kunde observeras (se figur 3D).

Figure 3
Figur 3: Metoder för att hämta antigener. A) Vävnad från musens volvulus som färgats för NE (magenta) med en inkubationstid på 10 minuter vid 96 °C för värmeuttag visar en betydligt starkare signal än (B) vid inkubation av provet i 90 minuter i ett vattenbad vid 60 °C. (C) Dessutom resulterar 10 minuters inkubation i 96 °C antigenhämtning också i en stark signal för H3cit (röd) och MPO (grön) med kombinerad NET-färgning (vita pilar). D: Kokning av proverna i mer än 40 minuter resulterar dock i mindre specifik extracellulär H3cit-färgning och ingen MPO-färgning. För isotypkontroll, se tilläggsfigur Isocontrol 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Permeabilisering
Vi provade att permeabilisera proverna med Triton X-100 i två spädningar (0,2 % och 0,5 %) i 10 minuter och jämförde detta med 10 minuter i avjoniserat vatten. Här uppnådde 10 minuter med Triton 0,2 % goda resultat för alla vävnadstyper, även om skillnaderna var små jämfört med 0,5 % Triton och avjoniserat vatten (se tabell 2).

Kompletterande figur Isokontroll 1: Isotypkontroller för figur 1. Alla bilder visar bra DAPI-färgning (blå) men ingen signal för den fluorescerande antikroppen. Detta bekräftar att bindningen av primära antikroppar i figur 1 är specifik för målantigenet och inte ett resultat av icke-specifik bindning eller proteininteraktioner. A) Vävnad av human neonatal enterokolit (NEC) färgad med isocontrol-antikroppen för H3cit (R8) (röd). B) NEC-vävnad färgad med isocontrol-antikroppen för H3cit (R2,8,17) (röd). C) NEC-vävnad (E) och volvulusvävnad från möss färgade med isokontrollantikroppar för H3cit (R8) (röd) och MPO från mus/människa (grön). D) NEC-vävnad färgad med isokontrollantikroppar för H3cit (R8) (röd) och MPO (2C7) (grön). F) Vävnad från tarmvred hos möss som färgats med isocontrol-antikroppar för H3cit (R8) (röd) och MPO 2D4 (grön). G: Bränt hudprov från människa färgat med isocontrol-antikroppen för NE-antikroppen från en kaninvärd (magenta). H) Samma vävnad färgad med isocontrol-antikroppen för NE-antikroppen från en musvärd (magenta). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur Isocontrol 2: Isotypskontroller för figur 2. Alla bilder visar bra DAPI-färgning (blå) men ingen signal för den fluorescerande antikroppen. Detta bekräftar den specifika bindningen av de primära antikropparna i figur 2. Bilderna C-E visar fortfarande en viss bakgrundsfärgning i magenta på grund av de långa exponeringstiderna. NE-signalen i figur 2 kan dock särskiljas från bakgrundsfärgningen. (A) Vävnad från human spondylodiskit avparaffiniserad med limonen och färgad med isocontrol-antikroppar för H3cit (R8) (röd) och mus/human MPO (grön). (B) Samma vävnadsprov avparaffiniseras med xylen och färgas med isocontrol-antikropparna för H3cit (röd) och MPO (grön). (C) Lungvävnad från mus färgad med isocontrol-antikroppen för NE (magenta), utan användning av autofluorescensreducerande medel. (D) Samma vävnad färgad med isocontrol-antikroppen för NE (magenta) och 5 minuters inkubation med ett autofluorescensreducerande medel. E) Samma vävnad färgas med isocontrol-antikroppen för NE (magenta) och 10 minuters inkubation med ett autofluorescensreducerande medel. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur Isocontrol 3: Isotypkontroller för figur 3. Alla bilder visar bra DAPI-färgning (blå) men ingen specifik signal för den fluorescerande antikroppen. Detta bekräftar den specifika bindningen av de primära antikropparna i figur 3. A) Vävnad från tarmvred hos möss som färgats med isocontrol-antikroppen för NE (magenta) med en inkubationstid på 10 minuter vid 96 °C för värmeupptagning. B) Samma vävnad färgas med isocontrol-antikroppen för NE (magenta) och värmeupptagning i 90 minuter i ett 60 °C vattenbad. C) Samma vävnad färgad med isocontrol-antikroppar för H3cit (röd) och MPO (grön) och med identiska värmeupptagningsbetingelser som i A. Den gröna pricken visar en färgningsartefakt av aggregerade sekundära antikroppar. D) Samma vävnad färgas med isokontrollantikroppar för H3cit (röd) och MPO (grön) och med en inkubationstid på 40 minuter vid 96 °C för värmeuttag. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur Isocontrol 4: Isotypskontroller för figur 4. Alla följande isokontroller är från samma bild som motsvarande "misslyckade" experiment. De misslyckade försöken gjordes inte avsiktligt, så vissa isokontroller verkar användbara, medan provet inte var det. (A) NEC-vävnad färgad med isokontrollantikroppen för H3cit (röd) och MPO (grön). Detta prov bearbetades snabbare utan att torka ut. Därför syns inga överdrivna bakgrundsfläckar. De gröna och röda strukturerna är sekundära antikroppsaggregat. (B) Spondylodiskitvävnad färgad med isocontrol-antikroppen för NE (magenta). Här var deparaffiniseringen framgångsrik, så inga paraffinrester kan ses. (C) NEC-vävnad färgad med isocontrol-antikroppen för H3cit (röd) och MPO (grön). Även om samma felaktigt lagrade sekundära antikroppar användes, kan ingen färgning förväntas för denna isokontrollbild. Därför kan den här bilden inte användas för att utvärdera motsvarande bilds specifika bindning. (D) Bränd mänsklig hud färgad med isocontrol-antikroppen för H3cit (röd) och MPO (grön). Här gjordes monteringen mer noggrant och inget ljus som sprids genom luftbubblor kan ses. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete syftade vi till att anpassa och optimera de befintliga protokollen för avbildning av NET till fler vävnadstyper, med början i själva färgningsprocessen. Det första kritiska steget för denna metod är valet av de mest lämpliga antikropparna. För NE provade vi en NE-antikropp från en musvärd på mänsklig vävnad, som inte visade någon tillförlitlig färgning jämfört med NE från en kaninvärd. Vidare föreslog Thålin et al. H3cit (R8) som en mer specifik antikropp för extracellulär färgning. Vi jämförde denna antikropp med den allmänt använda triH3cit (R2, R8, R17). Vår studie visade att H3cit (R8)-antikroppen endast färgades för en extracellulär signal vid de använda koncentrationerna, vilket gjorde det lättare att känna igen NET på objektglasen. Detta fynd stöder påståendena från Thålin et al. att H3cit-klonen (R8) kan ge en bra NET-signal med minskad korsreaktivitet utanför målet till icke-citrullinerade histoner28. Vi jämförde också MPO-antikroppar för human- och musvävnad för MPO-färgning. Våra resultat visar att MPO-antikroppen från mus och människa visade mer tillförlitlig färgning och kan användas samtidigt på human- och musprover, vilket förenklar användningen i laboratoriet. Följaktligen rekommenderar vi att du använder denna antikroppskombination, H3cit (R8) och MPO för mus/människa, för framtida forskning och implementerar den i vårt protokoll.

Det finns dock en begränsning för flera färgningsförsök med detta antikroppsurval. Detta protokoll modifierades för att använda primära antikroppar från olika värdar. Annars skulle en sekundär antikropp kunna binda till båda primärantikropparna. H3cit-antikroppen kommer från samma värd som NE-antikroppen, så vi kunde inte färga NE och H3cit tillsammans. Även om ingen trippelfärgning (NE, H3cit, MPO) gjordes i denna studie, kan detta protokoll fungera som en grund för trippelfärgningsexperiment i framtiden. Ett möjligt alternativ för trippelfärgning eller dubbelfärgning av NE och H3cit skulle kunna vara att byta ut en av dessa antikroppar mot en pålitlig antikropp från en annan värd. I det här fallet skulle en möjlig kombinationspartner kunna vara NE-antikroppen (Santa Cruz; sc-55549) från får som används av Knackstedt et al.24. Ett annat alternativ av Duler et al. publicerades 2021, där de använde en konsekutiv dubbelfärgningsmetod och kombinerade NE och H3cit från en kaninvärd26. En annan lovande tillämpning av en multipelfärgningsmetod är för att skilja mellan intra- och extravaskulär NET-bildning. Istället för trippelfärgning för NET-markörer kan dubbel NET-färgning kombineras med ytterligare vaskulär färgning. Dessutom har ett ökande antal studier undersökt den intra- och extravaskulära fördelningen av NET för att få mer kunskap om patogenmekanismerna för specifika sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom. Smyth et al.31 beskrev ett lovande och djupgående protokoll som liknar vårt för att skilja mellan de två möjliga lokaliseringarna. De modifierade sitt befintliga NET-färgningsprotokoll genom att lägga till ett biotinylerat lektin för att märka endotelceller och använde ett fluoroforkonjugerat streptavidin för immunofluorescensfärgning av lektin. Genom att undersöka samlokaliseringen av lektin- och NET-markörer i samma bild kunde de identifiera intravaskulära NET31. I detta sammanhang behövs ytterligare studier för att utöka tillämpningen av vårt protokoll.

Efter att ha hittat den lämpligaste antikroppskombinationen är nästa kritiska steg att introducera ett autofluorescensreducerande medel. Exogena faktorer som provfixering med formaldehydfixeringsmedel och endogena faktorer som erytrocyter kan resultera i hög autofluorescens, vilket gör det svårt att bestämma samlokalisering32. Detta problem uppstår främst i blått (excitationsområde: 430-480 nm) och grönt fluorescensspektra (excitationsområde: 500-550 nm) och kan resultera i ofullständiga färgningsresultat när en fluorescensantikropp med samma excitationsområde används3. Litteraturen rapporterar att Sudan Black är ett effektivt medel för att minska inneboende vävnadsautofluorescens33. Sudan Black gör det möjligt att få klarare färgningsresultat med hjälp av de blå eller gröna fluorescenskanalerna. Detta excitationsområde kommer att vara nödvändigt för framtida multipla färgningsförsök eftersom de blå och gröna kanalerna behövs när man använder ett fjärde fluorescerande färgämne. Vår studie visar att den optimala inkubationstiden beror på vilken typ av vävnad och antikropp som används i färgningsprocessen. Icke desto mindre, i detta arbete, gav 5 min autofluorescensreducerande medel i allmänhet goda resultat på alla vävnadstyper och hade fördelen att färga provet svart, vilket gjorde det lättare att se på objektglasen. Detta förhindrade att delar av vävnaderna saknades i färgningsprocessen, särskilt med små prover.

En annan viktig faktor för framgången med detta protokoll är en konstant hög temperatur för antigenhämtningssteget. Vår forskning visade att 10 av de 15 tidigare studierna använde temperaturer över 96 °C för antigenhämtning 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27. Detta stämde överens med våra resultat, där inkubation av proverna i ett 96 °C vattenbad eller mikrovågsugn gav goda resultat utan signifikanta skillnader. Vi rekommenderar dock att du använder ett vattenbad för jämn värmefördelning. När vi använde mikrovågsugnen hittade vi en temperaturgradient i bufferten på upp till 5 °C mellan toppen och botten av färgningsburken. Dessutom är vattenbadet lättare att använda och har en lägre risk för att bufferten kokar över. För permeabilisering fann vi att Triton X-100 hade en mindre effekt på färgningen. Så det är möjligt att hoppa över detta steg i protokollet utan att påverka resultatet negativt. Generellt gav humana prover bättre resultat än musprover. En orsak till detta kan vara att människor har en högre andel neutrofiler än möss34,35. Dessutom visade lungprover från möss ingen synlig makroskopisk inflammation och färre neutrofiler, medan mustarmprover var makroskopiskt inflammerade och visade goda infärgningsresultat. De lägre poängen i vår studie kan alltså ha berott på den låga inflammationen och inte på att protokollet inte fungerade optimalt.

För felsökning kan mindre fel i protokollet eller att inte hantera proverna försiktigt ha stora effekter på färgningsresultatet. Ett stort problem som vi identifierade var uttorkning av prover. Här fann vi att det var viktigt att hantera mer än 10-15 glas samtidigt eftersom varje steg är tidskrävande och kan resultera i uttorkning av proverna. Dehydratiserade prover är inte längre användbara på grund av hög bakgrundsfärgning och ingen detekterbar specifik fluorescenssignal (se figur 4A). Dessutom bör proverna avparaffiniseras helt innan färgningsprotokollet påbörjas. Paraffinrester resulterade i en stark bakgrundssignal, och skärlinjerna kunde ses i det färgade paraffinet (se figur 4B). Efter mer än 20 frys-upptiningscykler kunde dessutom ingen signal för den sekundära antikroppen mot MPO detekteras (se figur 4C). Ett annat viktigt steg som har stor inverkan på bildkvaliteten är hanteringen av det sista monteringssteget. I detta arbete resulterade luftbubblor under täckglaset i spridning av den fluorescerande signalen och därmed en suddig bild (se figur 4D).

Figure 4
Bild 4: Felsökningstips . (A) Denna panel visar konsekvensen av ett uttorkat prov. Den solida röda bakgrundsfärgningen hindrar all utvärdering av provet. (B) Här visar den röda pilen paraffinrester, kännetecknade av det korrugerade utseendet, efter en otillräcklig deparaffinisering. Dessa rester resulterar i en hög bakgrundssignal och bilder av lägre kvalitet. (C) Otillräcklig lagring av antikroppar eller mer än 20 frys- och upptiningscykler leder till aggregering av den sekundära antikroppen (gröna pilar) och ingen bindning till MPO. (D) Montering som inte görs noggrant kan resultera i luftbubblor och därmed spridning av lysröret (blå pil). Detta kan påverka bildkvaliteten avsevärt, särskilt när spridningen gör målet suddigt. För isotypkontroll, se tilläggsfigur Isocontrol 4. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Även om NET blir allt populärare inom vetenskaplig forskning finns det fortfarande inte tillräckligt med studier som fokuserar på metoderna för NET-detektion 3,13,17,26. Såvitt vi vet presenterar vi den första studien som jämför protokoll från olika studier för immunofluorescensavbildning av NET i FFPE-vävnad. De tidigare publicerade anpassade protokollen skilde sig åt i sina antikropps- eller antigenhämtningsmetoder och var ofta utformade för endast en vävnadstyp, vilket gjorde det svårare att jämföra resultaten från NET-avbildningen. Därför identifierade vi i denna studie kritiska steg och etablerade ett protokoll som är lämpligt för olika mus- och mänskliga vävnader. Vi uppnådde detta genom att använda en ny primär antikropp för H3cit-färgning och reducera bakgrundsfärgningen med ett autofluorescensreducerande medel. Vidare visade vi att en konstant hög temperatur är avgörande, och noggrann hantering av prover är grundläggande för framgångsrik NET-färgning. Därför ger denna studie de viktigaste stegen för att utveckla ett allmänt tillämpligt protokoll för färgning av NET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning grundades av det tyska forskningssällskapet (BO5534). Vi tackar Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer och PD Dr. Ingo Königs för att de försett oss med prover. Dessutom tackar författarna teamet vid UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) för stöd med immunofluorescensmikroskopin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Tags

Immunofluorescensavbildning neutrofila extracellulära fällor NET bakteriell infektion traumatisk vävnadsskada autoimmuna sjukdomar steril inflammation dubbelsträngade DNA-filament histoner antimikrobiella proteiner patogener homeostatisk reglering trombocytvidhäftning koagulation sepsis autoimmuna sjukdomar terapeutisk intervention elektronmikroskopi färgningsmetoder antikroppar autofluorescensreducerande medel antigenhämtningsmetoder permeabilisering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Immunofluorescensavbildning av neutrofila extracellulära fällor i vävnader från människa och mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter