Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) worden in verband gebracht met verschillende ziekten en immunofluorescentie wordt vaak gebruikt voor hun visualisatie. Er zijn echter verschillende kleuringsprotocollen en in veel gevallen wordt slechts één type weefsel onderzocht. Hier stellen we een algemeen toepasbaar protocol op voor het kleuren van NET in muizen en menselijk weefsel.

Abstract

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) worden vrijgegeven door neutrofielen als reactie op bacteriële infectie of traumatische weefselschade, maar spelen ook een rol bij auto-immuunziekten en steriele ontstekingen. Het zijn webachtige structuren die zijn samengesteld uit dubbelstrengs DNA-filamenten, histonen en antimicrobiële eiwitten. Eenmaal vrijgegeven, kunnen NET's extracellulaire ziekteverwekkers in bloed en weefsel vangen en doden. Bovendien nemen NET's deel aan homeostatische regulatie door de adhesie en coagulatie van bloedplaatjes te stimuleren. De ontregelde productie van NET is echter ook in verband gebracht met verschillende ziekten, waaronder sepsis of auto-immuunziekten, waardoor ze een veelbelovend doelwit zijn voor therapeutische interventie. Afgezien van elektronenmicroscopie is het visualiseren van NET's met behulp van immunofluorescentiebeeldvorming momenteel een van de weinige bekende methoden om NET-interacties in weefsel aan te tonen. Daarom zijn er verschillende kleuringsmethoden gebruikt om NET te visualiseren. In de literatuur worden verschillende kleuringsprotocollen beschreven en we hebben vier belangrijke componenten geïdentificeerd die een hoge variabiliteit tussen protocollen vertonen: (1) de gebruikte soorten antilichamen, (2) het gebruik van autofluorescentieverminderende middelen, (3) antigeenextractiemethoden en (4) permeabilisatie. Daarom werden in vitro immunofluorescentiekleuringsprotocollen in dit werk systemisch aangepast en verbeterd om ze toepasbaar te maken voor verschillende soorten (muis, mens) en weefsels (huid, darm, long, lever, hart, tussenwervelschijf). Na fixatie en paraffine-inbedding werden 3 μm dikke secties op objectglaasjes gemonteerd. Deze monsters werden gekleurd met primaire antilichamen voor myeloperoxidase (MPO), gecitrullineerd histon H3 (H3cit) en neutrofiele elastase (NE) volgens een gewijzigd kleuringsprotocol. De objectglaasjes werden gekleurd met secundaire antilichamen en onderzocht met behulp van een breedveldfluorescentiemicroscoop. De resultaten werden geanalyseerd volgens een evaluatieblad en de verschillen werden semi-kwantitatief geregistreerd.

Hier presenteren we een geoptimaliseerd NET-kleuringsprotocol dat geschikt is voor verschillende weefsels. We gebruikten een nieuw primair antilichaam om H3cit te kleuren en verminderden niet-specifieke kleuring met een autofluorescentieverlagend middel. Bovendien hebben we aangetoond dat NET-kleuring een constante hoge temperatuur en een zorgvuldige behandeling van monsters vereist.

Introduction

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) werden voor het eerst gevisualiseerd door Brinkmann et al. als een route van cellulaire dood die verschilt van apoptose en necrose in 20041. In deze route geven neutrofielen hun gedecondenseerde chromatine af in de extracellulaire ruimte om grote webachtige structuren te vormen die bedekt zijn met antimicrobiële eiwitten die voorheen in de korrels of cytosolen waren opgeslagen. Deze antimicrobiële eiwitten omvatten neutrofiele elastase (NE), myeloperoxidase (MPO) en gecitrullineerd histon H3 (H3cit), die vaak worden gebruikt voor indirecte immunofluorescentiedetectie van NET's2. Deze methode identificeert niet alleen de kwantitatieve aanwezigheid van deze eiwitten; het heeft inderdaad het voordeel dat het specifiek NET-achtige structuren detecteert. In de NET's co-lokaliseren de genoemde eiwitten samen met extracellulair DNA, wat kan worden gedetecteerd door een overlapping van de fluorescentiesignalen van elk gekleurd eiwit en het extracellulaire DNA. In tegenstelling tot de overlappende signalen als gevolg van extracellulaire co-lokalisatie van DNA en eiwitten in NET's, vertonen intacte neutrofielen geen co-lokalisatie. Hier worden de NET-componenten meestal apart opgeslagen in de korrels, kernen en cytosol3.

Sinds hun eerste ontdekking is aangetoond dat NET een centrale rol spelen bij tal van ziekten, met name die waarbij ontstekingen betrokken zijn. NET's vertonen antimicrobiële functies tijdens infectie door extracellulaire pathogenen in bloed en weefsel op te vangen en te doden 4,5. NET is echter ook in verband gebracht met auto-immuunziekten en hyperinflammatoire reacties, zoals systemische lupus erythematosus, reumatische artritis en allergisch astma 6,7,8. NET bevorderen vaso-occlusie en ontsteking bij atherosclerose, bloedplaatjeshechting en er wordt gespeculeerd dat ze een rol spelen bij uitgezaaide kanker 9,10,11. Desalniettemin wordt aangenomen dat ze ontstekingsremmende eigenschappen hebben door de pro-inflammatoire cytokineniveaus te verlagen12. Terwijl NET steeds meer belangstelling krijgt in een breder onderzoeksgebied, is een robuuste NET-detectiemethode van fundamenteel belang voor toekomstig onderzoek.

Hoewel de visualisatie van NET's in verschillende weefsels met behulp van immunofluorescentiebeeldvorming complex is en maatwerk vereist, afgezien van elektronenmicroscopie, is het momenteel een van de meest gerenommeerde methoden voor het visualiseren van de interacties tussen NET's en cellen en wordt het voornamelijk gebruikt in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels (FFPE)13,14. Het vergelijken van NET-beeldvorming is echter moeilijk, omdat verschillende laboratoria hun eigen aangepaste protocollen gebruiken. Deze protocollen verschillen in het gebruik van antilichamen, antigeenextractie of permeabilisatiemethode en zijn vaak geoptimaliseerd voor een specifiek type weefsel 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Nadat Brinkmann et al. de eerste methodische studie publiceerden met behulp van immunofluorescerende visualisatie van NET's in FFPE-weefsel, wilden we dit protocol optimaliseren voor een grotere verscheidenheid aan weefsels en soorten15. Om een breed toepasbaar immunofluorescentieprotocol vast te stellen, hebben we bovendien verschillende aangepaste protocollen getest uit onderzoeken die immunofluorescentiemethoden in FFPE-weefsel gebruikten om NET's te detecteren 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Verder hebben we een nieuw H3cit-antilichaam geprobeerd voor meer specifieke extracellulaire kleuring28. Onze hypothese is dat door het systematisch aanpassen van de huidige kleuringsprotocollen aan verschillende soorten en weefsels, in vitro beeldvorming kan worden verbeterd, wat resulteert in een betere weergave van de interactie tussen neutrofielen en NET's, zowel lokaal als systemisch.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze studie omvatte muizenweefsels die waren afgeleid van experimenten die waren goedgekeurd door de Hamburgse Staatsadministratie voor Dieronderzoek, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Duitsland (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). De gebruikte weefsels waren muizenlong en dikke darm van een septisch model en verbrande huid. We gebruikten mannelijke en vrouwelijke muizen van 8 weken oud. Voor alle experimenten werd de Europese Richtlijn 2010/63/EU betreffende de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden gevolgd. De geanonimiseerde menselijke monsters omvatten weefsels van neonatale enterocolitis, verbrande huid, galwegatresie, spondylodiscitis en myocardium. Volgens de Medical Research Ethics Committee van Hamburg was voor de monsters geen geïnformeerde toestemming nodig, maar de studie werd goedgekeurd door de commissie (WF-026/21).

1. Sample fixatie

  1. Gebruik het volgende protocol dat is afgeleid van Abu Abed en Brinkmann voor monsterfixatie, dehydratie, paraffine-inbedding, secties en montage 3,15.
    1. Bereid 4% formaldehyde-oplossing door 40 g paraformaldehyde (PFA) op te lossen in 800 ml Tris-gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (TBS).
    2. Roer het mengsel op 60 °C onder een zuurkast tot de PFA is opgelost. Breng de oplossing op kamertemperatuur (RT) en pas het volume met TBS aan tot 1.000 ml.
    3. Stel de pH in op 7,4. Bewaren bij 4 °C gedurende 2-3 weken of bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
  2. Voor monsterfixatie plaatst u vers weefsel in de TBS-buffer en ontleedt u het in stukken kleiner dan 20 mm x 30 mm x 3 mm. Dompel de weefselsecties gedurende 12-24 uur onder in 4% paraformaldehyde-oplossing.
    OPMERKING: Het oorspronkelijke protocol gebruikte een 2% PFA-oplossing en een fixatietijd van 8-20 uur. Bij deze methode waren sommige weefselcoupes na 20 uur nog niet volledig gefixeerd, waardoor de PFA-concentratie werd verhoogd tot 4% PFA.
  3. Breng de monsters over in gelabelde weefselverwerkingscassettes. Gebruik oplosmiddelbestendige stiften of potloden voor het etiketteren.
  4. Start de uitdroging van het monster door de cassettes gedurende 1 uur onder te dompelen in 70% ethanol. Dompel vervolgens onder in 80% ethanol, 90% ethanol, 96% ethanol en twee keer in 100% ethanol, waarbij elke stap 1 uur duurt.
  5. Dompel tweemaal onder in 100% xyleen (dimethylbenzeen) en vervolgens tweemaal in paraffine van 60 °C gedurende telkens 1 uur.
  6. Gebruik inbeddingsmallen voor de montage en laat de paraffine stollen voordat u de mal verwijdert.
  7. Gebruik een microtoom voor het snijden van weefselsecties van 3 μm dik.
  8. Gebruik een pincet om de gesneden delen in een waterbad van 37 °C te leggen en laat ze op het oppervlak drijven om de weefselsneden uit te rekken.
  9. Plaats de secties op zelfklevende glasplaatjes (materiaaltabel) en laat ze een nacht drogen in een warmtekamer van 40 °C.

2. Monster rehydratatie

  1. Voor deparaffinisatie stapelt u de objectglaasjes in een glaasjesrek en dompelt u ze twee keer gedurende 5 minuten onder in het xyleenvervangingsmedium limoneen (materiaaltabel) en één keer gedurende 5 minuten in een 1:1 limoneen/ethanolmengsel.
    LET OP: Limoneen is ontvlambaar bij 50 °C en kan allergische reacties veroorzaken. Gebruik onder een zuurkast met oogbescherming en handschoenen. Blijf uit de buurt van open vuur.
  2. Rehydrateer de monsters in een aflopende ethanolreeks door het glaasjesrek twee keer onder te dompelen in 100% ethanol en één keer in 96% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol en 70% ethanol gedurende elk 5 minuten.
  3. Dompel het glaasjesrek 5 minuten onder in gedeïoniseerd water (DI-water) om eventuele resterende ethanol te verwijderen.

3. Autofluorescentieblokkering en antigeenterugwinning

  1. Bereid pH 6 citraat target retrieval solution (TRS) (Tabel met materialen) volgens het gegevensblad. Deze TRS wordt 10 keer geconcentreerd. Verdun daarom 1:10 met DI water. Verwarm voor in een plastic kleurpot op 96 °C.
    OPMERKING: TRS verbreekt de methyleenbruggen die tijdens de monsterfixatie zijn gevormd om de antigeenepitopen bloot te leggen. Hierdoor kunnen de primaire antilichamen hun doelantigeen binden. Bewaar geconcentreerde TRS gedurende 8 maanden bij 2-8 °C. Bereid altijd verse TRS.
  2. Haal de glaasjes uit het glaasjesrek en plaats ze in een natte kamer. Pipetteer één tot twee druppels autofluorescentiereducerend middel (Materiaaltabel) op elk monster. Incubeer gedurende 5 min.
    OPMERKING: Het autofluorescentiereducerende middel blokkeert de inherente weefselautofluorescentie veroorzaakt door endogene fluoroforen en fixeermiddelen. Bewaar het autofluorescentiereducerende middel maximaal 1 jaar bij RT.
    OPMERKING: Werk alleen met kleine delen van weefsels om uitdroging van de monsters of overschrijding van de incubatietijd te voorkomen.
  3. Stapel de objectglaasjes terug in het glaasjesrek en spoel ze gedurende 1 minuut in 60% ethanol met een opwaartse en neerwaartse beweging totdat al het ongebruikte autofluorescentiereducerende reagens is afgewassen.
  4. Dompel het glaasjesrek 5 minuten onder in DI-water.
  5. Voor het ophalen van antigeen brengt u de objectglaasjes over in een kleurpot met de voorverwarmde TRS. Incubeer gedurende 10 minuten bij 96 °C in een waterbad.
    OPMERKING: Het waterbad van 96 °C kan worden vervangen door een magnetron of stoomkoker als de TRS is voorverwarmd tot 96 °C en een incubatietijd van 10 minuten bij 96 °C is gegarandeerd.
  6. Haal de kleurpot eruit en laat deze ongeveer 60-90 minuten langzaam afkoelen tot RT.
    OPMERKING: Het protocol kan hier maximaal 4 uur worden gepauzeerd, waarbij de dia's in de TRS blijven.
  7. Verwijder de TRS, maar bewaar de glaasjes in de pot. Spoel tweemaal met Tris-gebufferde zoutoplossing met 0.05% Tween (TBST, pH 7.4) gedurende 3 minuten om eventuele overgebleven TRS-resten weg te spoelen.
  8. Voor permeabilisatie bereidt u 0,2% Triton in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, en vult u dit in de kleurpot om de monsters gedurende 10 minuten te permeabiliseren.
    OPMERKING: Permeabilisatie verbetert de binding van de primaire antilichamen met de intracellulaire doeleiwitten in de vaste monsters.
  9. Spoel de glaasjes opnieuw twee keer in TBST gedurende 3 minuten per keer.
  10. Bereid de natte kamer voor en leg dia's neer. Veeg overtollig water van de dia's met papieren zakdoekjes. Omcirkel elk monster met een hydrofobe barrièrepen om te voorkomen dat de antilichaamoplossing wegloopt.
    NOTITIE: Laat de monsters niet uitdrogen. Het is het beste om met kleine secties te werken.

4. Blokkeren van niet-specifieke antilichaambinding

  1. Neem een kant-en-klare blokkeringsoplossing met ezelserum (materiaaltabel) en pipetteer één druppel op elk monster. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    OPMERKING: Deze blokkeringsstap minimaliseert de binding van het secundaire antilichaam aan niet-specifieke bindingsplaatsen op het monster. Na het blokkeren van deze niet-specifieke epitopen en het aanbrengen van het primaire antilichaam, zal het secundaire antilichaam zich binden aan het primaire antilichaam en geen interactie hebben met het oppervlak van het weefsel. Dit kant-en-klare blokkerende reagens wordt 6 maanden bewaard bij 2-8 °C.
  2. Verwijder overtollige blokkeervloeistof van objectglaasjes door met de rand van de glaasjes tegen een hard oppervlak te tikken. Spoel ze niet af.

5. Primair antilichaam

  1. Verdun primaire antilichamen in de antilichaamverdunningsbuffer (Tabel met materialen). Gebruik ongeveer 100 μl van de uiteindelijke oplossing voor elk monster. Voor het NE- en H3cit (R8)-antilichaam en de isocontrole verdunnen tot een concentratie van 5 μg/ml. Gebruik voor MPO en bijbehorende isocontrole 10 μg/ml. Maak één buisje klaar voor elk primair antilichaam en één voor elk isocontrole-antilichaam.
    OPMERKING: H3cit (R8)/MPO of NE/MPO en hun isocontrols kunnen worden gecombineerd voor NET-kleuring. Voor de combinatie van H3cit (R8)/MPO, verdunnen tot een eindconcentratie van 5 μg/ml voor H3cit (R8) en 10 μg/ml voor MPO tot een eindvolume van 100 μl per monster. Voor NE/MPO, verdunnen tot een eindconcentratie van 5 μg/ml voor NE en 10 μg/ml voor MPO tot een eindvolume van 100 μl per monster. Gebruik voor isocontrole dezelfde concentratie als voor elk corresponderend antilichaam. Gebruik altijd een nieuwe pipetpunt voor elk gebruikt antilichaam. Primaire antilichamen kunnen gedurende 1-2 weken bij 4 °C en maximaal 1 jaar bij −20 °C of -80 °C worden bewaard.
  2. Gebruik met twee monsters op één objectglaasje één voor de isocontrole-antilichamen en één voor de MPO/H3cit- of MPO/NE-antilichaamverdunning. Gebruik ongeveer 100 μL voor elk monster en verdeel de antilichaamoplossing gelijkmatig.
    NOTITIE: Laat monsters niet uitdrogen. Zorg ervoor dat u de isocontrole en primaire antilichamen niet door elkaar haalt.
  3. Bewaar een nacht in een natte kamer bij 4 °C.
  4. Tik de volgende dag de overtollige primaire antilichaamoplossing van de objectglaasjes en stapel de objectglaasjes in een cuvet. Spoel drie keer gedurende 5 minuten elke keer met TBST om de resterende primaire antilichaamoplossing af te wassen.

6. Secundair antilichaam

  1. Bereid de secundaire antilichaamoplossing voor. Gebruik twee verschillende fluorescerende secundaire antilichamen: ezel-anti-geit voor MPO en ezel-anti-konijn voor H3cit-kleuring. Verdun elk tot een concentratie van 7,5 μg/ml met antilichaamverdunningsbuffer (materiaaltabel).
    OPMERKING: Gebruik voor dubbele kleuring twee fluorescerende antilichamen met verschillende excitatiegebieden en minimale spectrale overlapping. Combineer beide secundaire antilichamen en verdun tot een eindconcentratie van 7,5 μg/ml voor elk antilichaam voor een eindvolume van 100 μl per monster. Bescherm de antilichamen tegen licht. De secundaire antilichamen kunnen worden bewaard bij 2-8 °C gedurende 6-8 weken of bij -80 °C gedurende maximaal 1 jaar.
  2. Bewaar de objectglaasjes in de natte kamer en voeg 100 μL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan elk monster. Laat ze 30 minuten incuberen bij RT en beschermd tegen licht.
  3. Tik de overtollige secundaire antilichaamoplossing af en stapel de objectglaasjes in het objectglaasjesrek. Dompel drie keer gedurende 5 minuten onder in een kleurpot gevuld met PBS om eventuele resterende ongebonden antilichamen af te wassen.
  4. Bereid DAPI-oplossing (4',6-diamidino-2-fenylindol) (materiaaltabel) en verdun met DI-water tot een concentratie van 1 μg/ml. Dompel het glaasjesrek onder in een kleurpot met DAPI-oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij RT in het donker.
    OPMERKING: DAPI wordt gebruikt als fluorescerende kleuring voor dubbelstrengs DNA. De bereide DAPI-oplossing kan meerdere keren worden gebruikt. Bewaar de bereide DAPI-oplossing bij RT. Het DAPI-concentraat kan maximaal 1 jaar worden bewaard bij -20 °C.
  5. Dompel het glaasjesrek 5 minuten onder in een kleurpot met PBS om de overtollige DAPI-oplossing af te wassen.

7. Montage en opslag van de monsters, microscopische analyse

  1. Monteer de monsters met dekglaasjes en montagemedium (Materiaaltabel).
    NOTITIE: Gebruik slechts kleine hoeveelheden montagemedium en veeg het overtollige medium weg met natte tissues. Draag handschoenen en veeg niet per ongeluk een medium van de dekglaasjes of glaasjes. Voorkom luchtbelvorming en gebruik wattenstaafjes om zachtjes op de dekglaasjes te drukken om eventuele luchtbellen van de glaasjes te verwijderen.
  2. Gebruik voor beeldvorming een breedveldmicroscoop of een confocale microscoop.
    OPMERKING: Maak eerst een foto van de isocontrol. Verlaag de belichtingstijd voor de fluorescentiefilters (behalve het blauwe filter voor DAPI) totdat er bijna geen signaal meer kan worden gedetecteerd. Gebruik vervolgens deze instelling om de bijbehorende monsters te onderzoeken. Zoek naar gebieden waar een fluorescerend signaal kan worden gedetecteerd in elk afzonderlijk monster met behulp van het fluorescentiekanaal. Na het maken van een afbeelding van het gebied, genereert het programma een samengesteld beeld van alle kanalen en toont het de verschillende fluorescentiesignalen als een overlapping van verschillende kleuren. Het beeld kan vervolgens verder worden geanalyseerd voor co-lokalisatie met beeldvormingssoftware zoals ImageJ.
  3. Bewaar de objectglaasjes maximaal 6 maanden bij 4 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voordat we begonnen met onze protocoloptimalisatie, identificeerden we de belangrijkste stappen voor succesvolle kleuring door op PubMed te zoeken naar onderzoeken die FFPE-weefsel gebruikten voor de immunokleuring van NET's en hun protocollen te vergelijken. De meest veelbelovende protocolverschillen werden geïdentificeerd als de belangrijkste stappen voor de protocoloptimalisatie, terwijl stappen die grotendeels met elkaar overeenkwamen niet werden gewijzigd (tabel 1).

Tabel 1: PubMed-onderzoek naar FFPE-immunokleuring van NET's. Deze tabel toont de variabelen in het immunokleuringsprotocol in de onderzochte onderzoeken. De gebruikte protocollen werden onderverdeeld in hun essentiële stappen en vervolgens met elkaar vergeleken. De stappen met de meest veelbelovende verschillen werden vervolgens genomen als de belangrijkste stappen voor optimalisatie en aangepast voor ons protocol. Stappen die grotendeels met elkaar overeenkwamen, werden niet gewijzigd, zoals de incubatietijd van het primaire antilichaam ('s nachts, 4 °C). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Op basis van onze bevindingen concludeerden we dat de antilichamen die werden gekozen om zich op de epitopen te richten, de eerste kritieke stap waren. Ten minste 10 verschillende protocollen gebruikten het triH3cit-antilichaam (zie tabel 1; Primaire antilichaamkolom). Desalniettemin ontdekten Thålin et al. dat de H3cit (R8) kloon een mindere off-target kruisreactiviteit vertoonde op niet-gecitrullineerde histonen en verwaarloosbare variabiliteit tussen partijen vertoonde. Daarom hebben we besloten om de kleuringsresultaten van triH3cit en H3cit (R8) met elkaar te vergelijken28.

In vier studies werd het MPO-antilichaam voor mensen/muizen gebruikt. Verder werden in twee andere protocollen MPO (2D4) voor muizenweefsel en MPO (2C7) voor menselijk weefsel toegepast (zie tabel 1; Primaire antilichaamkolom). Daarom hebben we MPO (2C7) afzonderlijk vergeleken met MPO-antilichaam voor menselijke weefsels en MPO (2D4) met MPO-antilichaam voor muizen voor muizenweefsels. NE werd gedetecteerd met behulp van ten minste vijf verschillende antilichamen, maar slechts drie daarvan vertoonden goede kleuringsresultaten in de verstrekte beelden. Eén antilichaam was echter niet meer op de markt verkrijgbaar, dus vergeleken we het NE-antilichaam van een konijnengastheer met een van een muisgastheer voor onze testreeks in menselijke weefsels. Voor muizenmonsters leek er aan het begin van deze studie geen beschikbaar en betrouwbaar alternatief te zijn voor het NE-antilichaam dat in de konijnengastheer werd gekweekt. Aangezien één NE- en beide H3cit-antilichamen afkomstig zijn van dezelfde konijnengastheer, kunnen ze met dit protocol niet worden gecombineerd voor dubbele kleuring. Het secundaire antilichaam is specifiek voor het constante gebied van het primaire antilichaam, dat wordt bepaald door de gastheer waarin het is grootgebracht. Als twee primaire antilichamen afkomstig van dezelfde gastheer worden gebruikt, kan het secundaire antilichaam zich binden aan beide primaire antilichamen en zou de kleuring niet-specifiek zijn. Dubbele kleuring heeft echter de voorkeur boven enkelvoudige kleuring, omdat er meer NET-componenten kunnen worden gedetecteerd en gelokaliseerd. Daarom zal het kleuringsresultaat specifieker zijn. Daarom hebben we H3cit en MPO dubbel gekleurd om een robuuster detectieprotocol te verkrijgen.

Ondanks de overeenkomsten in de gebruikte antilichamen, varieerden de verdunningen voor de antilichamen in bijna alle protocollen; voor triH3cit was het concentratiebereik bijvoorbeeld van 0,5 μg/ml tot 20 μg/ml17,18. Voor elk gebruikt antilichaam hebben we verschillende verdunningen geprobeerd en bevredigende kleuringsresultaten verkregen in het hele bereik dat in de literatuur wordt gerapporteerd.

Verder waren er veel overeenkomsten te vinden in de incubatietijd van het primaire antilichaam ('s nachts bij 4 °C) en het gebruik en de verdunning van het secundaire antilichaam (zie tabel 1; Incubatie primaire antilichaamkolom). Daarom hebben we deze stappen in onze testreeks niet gewijzigd en uitgevoerd volgens het hierboven beschreven protocol.

De volgende cruciale stap die uit de literatuur werd bepaald, was het ophalen van antigeen. Deze stap is essentieel omdat, als gevolg van formalinefixatie, de epitopen voor de antilichamen worden gemaskeerd door methyleenbruggen, die kunnen worden omgekeerd door het weefselgedeelte in een geschikte bufferte verwarmen 29. Citraat TRS bij pH 6 en EDTA TRS-buffer bij pH 9 werden even vaak gebruikt in de literatuur en gaven vergelijkbare resultaten (zie tabel 1; TRS-bufferkolom). Daarom hebben we gekozen voor de pH 6 citraat TRS voor onze testserie. Voor het terughalen van antigeen hebben we twee verschillende verwarmingsmethoden getest: een magnetron (eerst 1 minuut op 360 W en daarna 9 minuten op 90 W) en een waterbad (60 °C gedurende 90 min, 96 °C gedurende 10 min).

De laatste stap die enige variabiliteit in de literatuur liet zien, was de permeabilisatie met Triton X-100. Deze stap vereiste optimalisatie omdat met een behandeling met wasmiddel het celmembraan doorlaatbaar wordt voor antilichamen en intracellulaire epitopen kunnen worden bereikt30. De vorige protocollen gebruikten verschillende Triton X-100-concentraties, variërend van 1% tot 0,1% (zie tabel 1; Permeabilisatiekolom). Daarom hebben we twee Triton X-100 concentraties (0,2% en 0,5%) en één serie zonder Triton permeabilisatie geprobeerd.

Nadat we deze belangrijke stappen hadden geïdentificeerd, hebben we ze aangepast en geprobeerd het protocol te optimaliseren. Vervolgens werden de beelden onderzocht aan de hand van een evaluatieblad en werden de verschillen semi-kwantitatief geregistreerd en vergeleken (zie tabel 2).

Tabel 2: Tabel met resultaten voor het optimaliseren van de protocolstappen. Deze tabel toont de resultaten voor de aangepaste stappen: autofluorescentieverlagend middel, antigeenextractie en permeabilisatie. Voordat we met deze testreeks begonnen, hebben we getest op de beste antilichaamcombinatie en -concentratie. De objectglaasjes werden geëvalueerd in 10 verschillende gebieden, en vervolgens werd één representatief gebied gescoord van (-) voor een negatief resultaat tot (++) voor een positief NET-bevattend resultaat. De gedeeltelijk positieve resultaten omvatten een hogere diffuse achtergrondkleuring van niet-neutrofiele cellen. Afkortingen: n/u = niet gebruikt; - = negatief resultaat; +/-gedeeltelijk positieve kleuring; + = matige specifieke kleuring; + = goede kleuring van NET en neutrofielen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Primaire antilichamen
Voordat we het protocol aanpasten, hebben we geprobeerd de beste antilichaamcombinatie te vinden. Hier vertoonde de triH3cit meer intracellulaire histonkleuring dan de H3cit (R8). Voor het detecteren van NET's hebben we besloten om het H3cit (R8)-antilichaam te gebruiken voor onze protocoloptimalisatie. Dit antilichaam bindt zich alleen aan het extracellulaire H3cit en vertoonde geen kleuring van intracellulair H3cit bij deze concentratie (zie figuur 1A,B).

Voor MPO-kleuring vergeleken we het MPO-antilichaam van mensen/muizen met het MPO (2C7) voor menselijk weefsel (zie figuur 1C,D) en het MPO (2D4) voor muizenweefsel (zie figuur 1E,F). De MPO (2D4) en de MPO (2C7) antilichamen konden geen consistente kleuring bereiken voor meerdere weefseltypes, terwijl de MPO voor mens/muis resulteerde in betrouwbare, goede kleuring voor MPO. Daarom hebben we MPO voor mens / muis geselecteerd voor ons kleuringsprotocol.

Voor NE probeerden we een NE-antilichaam van een muizengastheer op menselijk weefsel, dat slechts in één op de vijf monsters NE-kleuring vertoonde in vergelijking met de betrouwbare kleuring van het NE-antilichaam van een konijnengastheer. Bovendien is het NE-antilichaam van een konijnengastheer van toepassing op menselijk en muizenweefsel. (zie figuur 1G,H).

Figure 1
Figuur 1: Vergelijking van primaire antilichamen in verschillende weefsels. (A) Menselijk neonatale enterocolitis (NEC) weefsel gekleurd met H3cit (R8) (rood). Hier kan alleen een extracellulair signaal worden gedetecteerd. (B) Hetzelfde weefsel gekleurd met triH3cit (R2,8,17) (rood). Dit antilichaam creëert een breder signaal met intense intracellulaire kleuring van gecitrullineerde histonen (gele pijlen). (C,E) Menselijk NEC-weefsel (C) en volvulusweefsel van muizen (E) met goede kleuring voor H3cit (R8) (rood) en muis/humaan MPO (groen). De co-lokalisatie van het H3cit-, MPO- en DAPI-signaal (blauw) geeft NET-vorming aan (witte pijlen). (D,F) Ter vergelijking: (D) met behulp van de MPO (2C7) voor menselijk NEC-weefsel en (F)MPO (2D4) (groen) voor volvulusweefsel van muizen kon geen MPO-signaal worden verkregen. (G) Verbrand menselijk huidmonster met zeer sterke kleuring voor het NE-antilichaam van een konijnengastheer (magenta) vergeleken met het (H) negatieve kleuringsresultaat voor het NE-antilichaam van een muisgastheer. Voor de isotypecontrole, zie Aanvullende afbeelding Isocontrol 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deparaffinisatie
Hier werd het xyleen vervangen door limoneen, wat een betere deparaffinisatie van de weefselmonsters vertoonde in vergelijking met xyleen, met minder autofluorescentie op de achtergrond (zie figuur 2A,B).

Autofluorescentie-reducerend middel
Het kant-en-klare autofluorescentiereducerende middel op basis van Sudan Black kan gedurende 2-20 minuten worden aangebracht. Hier hebben we het 0 min, 5 min en 10 min toegepast. Wanneer er geen blokkering werd gebruikt, vertoonden sommige muizenmonsters meer niet-specifieke kleuring en kon een gedeeltelijke positieve kleuring worden bereikt (zie figuur 2C). De blokkeringstijd van 5 minuten liet goede resultaten zien in alle weefseltypes behalve H3cit en MPO in long- en huidweefsel van muizen (zie tabel 2). Na 10 minuten blokkeertijd in sommige monsters begon de kleuring minder helder te worden, dus het tijdsbestek van 5 minuten is de beste keuze voor het blokkeren van autofluorescentie (zie figuur 2D,E).

Figure 2
Figuur 2: Deparaffinisatiemethoden en gebruik van een autofluorescentiereducerend middel. (A) Menselijk spondylodiscitisweefsel gedeparaffineerd met limoneen en gekleurd voor H3cit (rood) en MPO (groen). De gevlochten vorming van de signalen en de gedeeltelijke co-lokalisatie duiden op de aanwezigheid van NET's (witte pijl). (B) Hetzelfde weefselmonster gedeparaffiniseerd met xyleen, wat resulteert in vergelijkbare kleuringsresultaten, wat aangeeft dat het veelgebruikte xyleen kan worden vervangen door een vervangend medium. (C-E) Longweefsel van muizen na geïnduceerde sepsis dat verschillende NE-kleuringspatronen (magenta) vertoont wanneer verschillende incubatietijden voor het autofluorescentiereducerende middel worden gebruikt. Omdat er geen autofluorescentiereductiemiddel is gebruikt, toont afbeelding C nog steeds een lichte achtergrondkleuring van erytrocyten (rode pijl). Afbeelding D laat daarentegen zien dat na 5 minuten incubatie met een autofluorescentiereducerend middel een duidelijk signaal wordt afgegeven. Na 10 minuten neemt de kleurkwaliteit in beeld E af en wordt het signaal minder helder. Voor de isotypecontrole, zie Aanvullende afbeelding Isocontrol 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Methoden voor het ophalen van antigeen
Voor NE-kleuring hebben we de monsters verwarmd in pH 6 citraatbuffer gedurende 10 minuten in de magnetron (eerst gedurende 1 minuut bij 360 W en vervolgens gedurende 9 minuten bij 90 W), gedurende 10 minuten in een waterbad bij 96 °C, of gedurende 90 minuten in een waterbad bij 60 °C. Hier vertoonden de hogere temperaturen in de magnetron en het waterbad consistent matige tot goede antigeenextractie (zie figuur 3A). Er werd geen significant verschil gevonden tussen de magnetron en het waterbad van 96 °C (zie tabel 2). Bovendien werd aangetoond dat er in een waterbad van 60 °C slechts gedeeltelijk positieve tot geen kleuring was (zie figuur 3B). Alleen het menselijk ileum en het menselijk myocardium lieten goede specifieke resultaten zien. Omdat met het 60 °C-waterbad geen adequate kleuring voor NE kon worden bereikt, werd de 60 °C-waterbadtestserie voor H3cit en MPO verworpen.

Voor dubbele kleuring met MPO en H3cit hebben we de monsters verwarmd in pH 6 citraatbuffer in de magnetron gedurende 10 minuten (eerst gedurende 1 minuut bij 360 W en vervolgens gedurende 9 minuten bij 90 W) of in een waterbad bij 96 °C gedurende 10 minuten. Hier lieten beide methoden goede specifieke resultaten zien, met iets gunstigere resultaten voor het waterbad van 96 °C (zie figuur 3C). Alleen long- en huidweefsel van muizen konden een matige algemene rangschikking bereiken (zie tabel 2).

Overschrijding van de incubatietijd van 40 minuten bij 96 °C resulteerde echter in een minder intense kleuring van antilichamen, terwijl aanzienlijk meer achtergrondkleuring kon worden waargenomen (zie figuur 3D).

Figure 3
Figuur 3: Methoden voor het ophalen van antigeen. (A) Volvulusweefsel van muizen dat is gekleurd voor NE (magenta) met een incubatietijd van 10 minuten bij 96 °C voor warmteterugname, vertoont een significant sterker signaal dan (B) wanneer het monster gedurende 90 minuten in een waterbad van 60 °C wordt geïncubeerd. (C) Bovendien resulteert de incubatie van 10 minuten bij 96 °C antigeenextractie ook in een sterk signaal voor H3cit (rood) en MPO (groen) met gecombineerde NET-kleuring (witte pijlen). D: Het koken van de monsters gedurende meer dan 40 minuten resulteert echter in minder specifieke extracellulaire H3cit-kleuring en geen MPO-kleuring. Voor de isotypecontrole, zie Aanvullende figuur Isocontrol 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Permeabilisatie
We probeerden de monsters te permeabiliseren met Triton X-100 in twee verdunningen (0,2% en 0,5%) gedurende 10 minuten en vergeleken dit met 10 minuten in gedeïoniseerd water. Hier leverde 10 minuten met Triton 0,2% goede resultaten op voor alle weefseltypes, ook al waren de verschillen klein in vergelijking met de 0,5% Triton en gedeïoniseerd water (zie tabel 2).

Aanvullende afbeelding Isocontrol 1: Isotype-controles voor figuur 1. Alle afbeeldingen tonen een goede DAPI (blauwe) kleuring, maar geen signaal voor het fluorescerende antilichaam. Dit bevestigt dat de binding van primaire antilichamen in figuur 1 specifiek is voor het doelantigeen en niet het gevolg is van niet-specifieke binding of eiwitinteracties. (A) Menselijk neonatale enterocolitis (NEC) weefsel gekleurd met het isocontrole-antilichaam voor H3cit (R8) (rood). (B) NEC-weefsel gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor H3cit (R2,8,17) (rood). (C) NEC-weefsel (E) en volvulusweefsel van muizen gekleurd met de isocontrole-antilichamen voor H3cit (R8) (rood) en muizen/humaan MPO (groen). (D) NEC-weefsel gekleurd met de isocontrole-antilichamen voor H3cit (R8) (rood) en MPO (2C7) (groen). (F) Volvulusweefsel van muizen gekleurd met de isocontrole-antilichamen voor H3cit (R8) (rood) en MPO 2D4 (groen). G: Verbrand menselijk huidmonster gekleurd met het isocontrole-antilichaam voor het NE-antilichaam van een konijnengastheer (magenta). (H) Hetzelfde weefsel gekleurd met het isocontrole-antilichaam voor het NE-antilichaam van een muizengastheer (magenta). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding Isocontrol 2: Isotypecontroles voor figuur 2. Alle afbeeldingen tonen een goede DAPI (blauwe) kleuring, maar geen signaal voor het fluorescerende antilichaam. Dit bevestigt de specifieke binding van de primaire antilichamen in figuur 2. Afbeeldingen C-E vertonen nog steeds enige achtergrondkleuring in magenta vanwege de lange belichtingstijden. Het NE-signaal in figuur 2 is echter te onderscheiden van de achtergrondkleuring. (EEN) Menselijk spondylodiscitisweefsel gedeparaffineerd met limoneen en gekleurd met de isocontrole-antilichamen voor H3cit (R8) (rood) en muis/humaan MPO (groen). (B) Hetzelfde weefselmonster gedeparaffiniseerd met xyleen en gekleurd met de isocontrol-antilichamen voor H3cit (rood) en MPO (groen). (C) Longweefsel van muizen gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor NE (magenta), zonder gebruik van autofluorescentieverlagend middel. (D) Hetzelfde weefsel gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor NE (magenta) en 5 minuten incubatie met een autofluorescentieverlagend middel. (E) Hetzelfde weefsel gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor NE (magenta) en 10 minuten incubatie met een autofluorescentiereducerend middel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding Isocontrol 3: Isotype-controles voor figuur 3. Alle afbeeldingen vertonen een goede DAPI (blauwe) kleuring, maar geen specifiek signaal voor het fluorescerende antilichaam. Dit bevestigt de specifieke binding van de primaire antilichamen in figuur 3. (A) Volvulusweefsel van muizen gekleurd met het isocontrole-antilichaam voor NE (magenta) met een incubatietijd van 10 minuten bij 96 °C voor warmteterugwinning. (B) Hetzelfde weefsel gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor NE (magenta) en warmteterugwinning gedurende 90 minuten in een waterbad van 60 °C. (C) Hetzelfde weefsel gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor H3cit (rood) en MPO (groen) en met identieke omstandigheden voor het ophalen van warmte als in A. De groene stip toont een kleuringsartefact van geaggregeerde secundaire antilichamen. (D) Hetzelfde weefsel gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor H3cit (rood) en MPO (groen) en met een incubatietijd van 40 minuten bij 96 °C voor warmteterugwinning. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding Isocontrol 4: Isotype-controles voor figuur 4. Alle volgende isocontrols zijn afkomstig van hetzelfde glaasje als het corresponderende "mislukte" experiment. De mislukte pogingen werden niet opzettelijk gedaan, dus sommige isocontrols lijken bruikbaar, terwijl het monster dat niet was. (A) NEC-weefsel gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor H3cit (rood) en MPO (groen). Dit monster werd sneller verwerkt zonder uit te drogen. Daarom is er geen overmatige achtergrondverkleuring zichtbaar. De groene en rode structuren zijn secundaire antilichaamaggregaten. (B) Spondylodiscitisweefsel gekleurd met het isocontrole-antilichaam voor NE (magenta). Hier is de deparaffinisatie succesvol verlopen, waardoor er geen paraffineresten te zien zijn. (C) NEC-weefsel gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor H3cit (rood) en MPO (groen). Hoewel dezelfde onjuist opgeslagen secundaire antilichamen werden gebruikt, zou er geen kleuring worden verwacht voor dit isocontrolebeeld. Daarom kan deze afbeelding niet worden gebruikt om de specifieke binding van de bijbehorende afbeelding te evalueren. (D) Verbrande menselijke huid gekleurd met het isocontrol-antilichaam voor H3cit (rood) en MPO (groen). Hier is de montage zorgvuldiger gebeurd en is er geen licht te zien dat door luchtbellen wordt verstrooid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk wilden we de bestaande protocollen voor het in beeld brengen van NET aanpassen en optimaliseren voor meer weefseltypes, te beginnen met het eigenlijke kleuringsproces. De eerste cruciale stap voor deze methode is de selectie van de meest geschikte antilichamen. Voor NE hebben we een NE-antilichaam van een muizengastheer op menselijk weefsel geprobeerd, dat geen betrouwbare kleuring vertoonde in vergelijking met NE van een konijnengastheer. Bovendien stelden Thålin et al. H3cit (R8) voor als een specifieker antilichaam voor extracellulaire kleuring. We vergeleken dit antilichaam met het veelgebruikte triH3cit (R2, R8, R17). Onze studie toonde aan dat het H3cit (R8)-antilichaam alleen gekleurd was voor een extracellulair signaal bij de gebruikte concentraties, waardoor NET's gemakkelijker op de objectglaasjes konden worden herkend. Deze bevinding ondersteunt de beweringen van Thålin et al. dat de H3cit (R8) kloon een goed NET-signaal kan leveren met verminderde off-target kruisreactiviteit op niet-gecitrullineerde histonen28. We vergeleken ook MPO-antilichamen voor menselijk en muizenweefsel voor MPO-kleuring. Onze resultaten tonen aan dat het muis/menselijke MPO-antilichaam een betrouwbaardere kleuring vertoonde en tegelijkertijd kan worden gebruikt op menselijke en muismonsters, wat het gebruik ervan in het laboratorium vereenvoudigt. Daarom raden we aan om deze antilichaamcombinatie, H3cit (R8) en muis/mens MPO, te gebruiken voor toekomstig onderzoek en deze in ons protocol te implementeren.

Er is echter een beperking voor meerdere kleuringspogingen met deze antilichaamselectie. Dit protocol is aangepast om primaire antilichamen van verschillende gastheren te gebruiken. Anders zou één secundair antilichaam zich kunnen binden aan beide primaire antilichamen. Het H3cit-antilichaam komt van dezelfde gastheer als het NE-antilichaam, dus we konden NE en H3cit niet samen kleuren. Hoewel er in deze studie geen drievoudige kleuring (NE, H3cit, MPO) werd gedaan, zou dit protocol in de toekomst als basis kunnen dienen voor drievoudige kleuringsexperimenten. Een mogelijke optie voor drievoudige kleuring of NE- en H3cit-dubbele kleuring zou kunnen zijn om een van deze antilichamen uit te wisselen met een betrouwbaar antilichaam van een andere gastheer. In dit geval zou een mogelijke combinatiepartner het NE-antilichaam (Santa Cruz; sc-55549) van schapen kunnen zijn dat door Knackstedt et al.24 wordt gebruikt. Een andere optie van Duler et al. werd gepubliceerd in 2021, waar ze een opeenvolgende dubbele kleuringsmethode gebruikten en NE en H3cit van een konijnengastheer combineerden26. Een andere veelbelovende toepassing van een meervoudige kleuringsmethode is voor het onderscheid tussen intra- en extravasculaire NET-vorming. In plaats van drievoudige kleuring voor NET-markers, zou dubbele NET-kleuring kunnen worden gecombineerd met extra vasculaire kleuring. Bovendien hebben steeds meer studies de intra- en extravasculaire distributie van NET onderzocht om meer kennis te vergaren over de pathomechanismen van specifieke ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer. Smyth et al.31 beschreven een veelbelovend en diepgaand protocol vergelijkbaar met het onze om onderscheid te maken tussen de twee mogelijke lokalisaties. Ze pasten hun bestaande NET-kleuringsprotocol aan door een gebiotinyleerde lectine toe te voegen om endotheelcellen te labelen en gebruikten een fluorofoor-geconjugeerde streptavidine voor de immunofluorescentiekleuring van lectine. Door de co-lokalisatie van lectine- en NET-markers in hetzelfde beeld te onderzoeken, waren ze in staat om intravasculaire NET's te identificeren31. In deze context zijn verdere studies nodig om de toepassing van ons protocol uit te breiden.

Na het vinden van de meest geschikte antilichaamcombinatie, is de volgende cruciale stap het introduceren van een autofluorescentiereducerend middel. Exogene factoren zoals monsterfixatie met behulp van formaldehydefixatieven en endogene factoren zoals erytrocyten kunnen leiden tot hoge autofluorescentie, wat het bepalen van co-lokalisatie moeilijk maakt32. Dit probleem doet zich vooral voor in de blauwe (excitatiegebied: 430-480 nm) en groene fluorescentiespectra (excitatiegebied: 500-550 nm) en kan resulteren in niet-overtuigende kleuringsresultaten wanneer een fluorescentie-antilichaam met hetzelfde excitatiegebied wordt gebruikt3. De literatuur meldt dat Sudan Black een effectief middel is voor het verminderen van inherente autofluorescentie vanweefsels 33. Sudan Black maakt het mogelijk om duidelijkere kleuringsresultaten te verkrijgen met behulp van de blauwe of groene fluorescentiekanalen. Dit excitatiegebied zal nodig zijn voor toekomstige meervoudige kleuringspogingen, omdat de blauwe en groene kanalen nodig zijn bij gebruik van een vierde fluorescerende kleurstof. Onze studie toont aan dat de optimale incubatietijd afhangt van het type weefsel en antilichaam dat in het kleuringsproces wordt gebruikt. Niettemin gaf 5 minuten autofluorescentiereducerend middel in dit werk over het algemeen goede resultaten op alle weefseltypes en had het het voordeel dat het monster zwart kleurde, waardoor het gemakkelijker te zien was op de objectglaasjes. Dit voorkwam ontbrekende delen van de weefsels in het kleuringsproces, vooral bij kleine monsters.

Een andere essentiële factor voor het succes van dit protocol is een constante hoge temperatuur voor de stap voor het ophalen van antigeen. Ons onderzoek toonde aan dat 10 van de 15 eerdere studies temperaturen boven 96 °C gebruikten voor het ophalen van antigeen: 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27. Dit kwam overeen met onze resultaten, waarbij het incuberen van de monsters in een waterbad of magnetron van 96 °C goede resultaten opleverde zonder significante verschillen. Toch raden we aan om een waterbad te gebruiken voor een gelijkmatige warmteverdeling. Bij gebruik van de magnetron vonden we een temperatuurgradiënt in de buffer van maximaal 5 °C tussen de boven- en onderkant van de kleurpot. Bovendien is het waterbad gemakkelijker te gebruiken en heeft het een lager risico dat de buffer overkookt. Voor permeabilisatie vonden we dat de Triton X-100 een minder effect had op de kleuring. Het overslaan van deze stap in het protocol is dus mogelijk zonder de uitkomst nadelig te beïnvloeden. Over het algemeen gaven menselijke monsters betere resultaten dan muizenmonsters. Een reden hiervoor zou kunnen zijn dat mensen een hoger percentage neutrofielen hebben dan muizen34,35. Bovendien vertoonden longmonsters van muizen geen zichtbare macroscopische ontsteking en minder neutrofielen, terwijl de darmmonsters van muizen macroscopisch ontstoken waren en goede kleuringsresultaten vertoonden. De lagere scores in ons onderzoek kunnen dus het gevolg zijn van de lage ontsteking en niet van het feit dat het protocol niet optimaal werkte.

Voor het oplossen van problemen kunnen kleine fouten in het protocol of het niet zorgvuldig behandelen van de monsters enorme gevolgen hebben voor de kleuringsresultaten. Een groot probleem dat we identificeerden, was uitdroging van monsters. Hier ontdekten we dat het van cruciaal belang was om meer dan 10-15 objectglaasjes tegelijk te verwerken, omdat elke stap tijdrovend is en kan leiden tot uitdroging van de monsters. Gedehydrateerde monsters zijn niet langer bruikbaar vanwege de hoge achtergrondkleuring en het ontbreken van een detecteerbaar specifiek fluorescentiesignaal (zie figuur 4A). Bovendien moeten de monsters volledig worden gedeparaffiniseerd voordat het kleuringsprotocol wordt gestart. Paraffineresidu resulteerde in een sterk achtergrondsignaal en de snijlijnen waren te zien in de gekleurde paraffine (zie figuur 4B). Bovendien kon na meer dan 20 vries-dooicycli geen signaal voor het secundaire antilichaam tegen MPO worden gedetecteerd (zie figuur 4C). Een andere belangrijke stap met een grote impact op de beeldkwaliteit is de afhandeling van de laatste montagestap. In dit werk resulteerden luchtbellen onder het dekglaasje in de verstrooiing van het fluorescerende signaal en dus een wazig beeld (zie figuur 4D).

Figure 4
Figuur 4: Tips voor het oplossen van problemen. (A) Dit paneel toont de gevolgen van een uitgedroogd monster. De effen rode achtergrondkleuring belemmert elke evaluatie van het monster. (B) Hier toont de rode pijl paraffineresten, gekenmerkt door het gegolfde uiterlijk, na een onvoldoende deparaffinisatie. Deze restanten resulteren in een hoog achtergrondsignaal en beelden van mindere kwaliteit. (C) Onvoldoende opslag van antilichamen of meer dan 20 vries-dooicycli resulteren in de aggregatie van het secundaire antilichaam (groene pijlen) en geen binding aan MPO. (D) Montage die niet zorgvuldig gebeurt, kan leiden tot luchtbellen en dus verstrooiing van het fluorescerende licht (blauwe pijl). Dit kan de beeldkwaliteit aanzienlijk beïnvloeden, vooral wanneer de verstrooiing het doel vervaagt. Voor de isotypecontrole, zie Aanvullende afbeelding Isocontrol 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hoewel NET steeds populairder wordt in wetenschappelijk onderzoek, zijn er nog steeds niet genoeg studies die zich richten op de methoden voor NET-detectie 3,13,17,26. Voor zover wij weten, presenteren we de eerste studie waarin protocollen van verschillende onderzoeken voor immunofluorescentiebeeldvorming van NET's in FFPE-weefsel worden vergeleken. De eerder gepubliceerde aangepaste protocollen verschilden in hun methoden voor het ophalen van antilichamen of antigeen en waren vaak ontworpen voor slechts één weefseltype, waardoor het vergelijken van de NET-beeldvormingsresultaten moeilijker werd. Daarom hebben we in deze studie kritieke stappen geïdentificeerd en een protocol opgesteld dat geschikt is voor verschillende muizen- en menselijke weefsels. We hebben dit bereikt door een nieuw primair antilichaam voor H3cit-kleuring te gebruiken en de achtergrondkleuring te verminderen met een autofluorescentieverlagend middel. Bovendien hebben we aangetoond dat een constante hoge temperatuur cruciaal is en dat een zorgvuldige behandeling van monsters van fundamenteel belang is voor een succesvolle NET-kleuring. Daarom biedt deze studie de essentiële stappen voor het ontwikkelen van een algemeen toepasbaar protocol voor het kleuren van NET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek is opgezet door de Duitse Onderzoeksvereniging (BO5534). We danken Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer en PD Dr. Ingo Königs voor het beschikbaar stellen van monsters. Daarnaast bedanken de auteurs het team van de UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) voor de ondersteuning bij de immunofluorescentiemicroscopie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Tags

Immunofluorescentiebeeldvorming Neutrofiele extracellulaire vallen NET's Bacteriële infectie Traumatische weefselschade Auto-immuunziekten Steriele ontsteking Dubbelstrengs DNA-filamenten Histonen Antimicrobiële eiwitten Pathogenen Homeostatische regulatie Bloedplaatjeshechting Coagulatie Sepsis Auto-immuunziekten Therapeutische interventie Elektronenmicroscopie Kleuringsmethoden Antilichamen Autofluorescentieverlagende middelen Antigeenophaalmethoden Permeabilisatie

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter