Summary
שיטה משופרת למדידת פרופילי הידרציה של אבקה ב- Arabidopsis thaliana מתוארת כאן. השיטה החדשה מציעה רזולוציה גבוהה יותר, אינה פולשנית וניתנת לשחזור רב. הפרוטוקול מהווה כלי חדש לניתוח עדין יותר של התהליכים המווסתים את השלבים המוקדמים של ההאבקה.
Abstract
רבייה מינית בצמחים פורחים דורשת אינטראקציה ראשונית בין גרגר האבקה לבין פני השטח הסטיגמטיים, שם נוצר דיאלוג מולקולרי בין השותפים המקיימים אינטראקציה. מחקרים במגוון מינים גילו כי סדרה של נקודות ביקורת מולקולריות מווסתות את האינטראקציה בין אבקה לסטיגמה כדי להבטיח שרק אבקה תואמת, בדרך כלל תוך ספציפית, תצליח להשפיע על ההפריה. במינים בעלי "סטיגמה יבשה", כמו צמח המודל Arabidopsis thaliana, מחסום התאימות הפרזיגוטי הראשון לאחר האבקה הוא ביסוס הידרציה של אבקנים.
שלב זה של האבקה מווסת באופן הדוק, שבו אותות מגרגרי האבקה מעוררים שחרור מים מהצלקת, ובכך מאפשרים הידרציה של אבקה. היכולת למדוד במדויק ולעקוב אחר הידרציה של אבקה לאורך זמן היא המפתח לתכנון ניסויים המכוונים להבנת הוויסות של שלב קריטי זה ברבייה. פרוטוקולים שפורסמו משתמשים לעתים קרובות בפרחים שנכרתו מצמח האם, נשמרים על מדיה נוזלית או מוצקה, ומואבקים בתפזורת.
מאמר זה מתאר בדיקה ביולוגית לא פולשנית של האבקה in vivo המאפשרת מעקב הידרציה דקה אחר דקה אחר גרגרי אבקה בודדים של A. thaliana ברזולוציה גבוהה. הבדיקה ניתנת לשחזור ברמה גבוהה, מסוגלת לזהות וריאציות עדינות מאוד של פרופילי הידרציה של אבקה, ולכן מתאימה לניתוח מוטנטים המשפיעים על מסלולים המווסתים את ההאבקה. למרות שהפרוטוקול ארוך יותר מאלה המתוארים עבור האבקות בתפזורת, הדיוק ויכולת השחזור שהוא מספק, יחד עם אופיו in vivo , הופכים אותו לאידיאלי לדיסקציה מפורטת של פנוטיפים של האבקה.
Introduction
רבייה מינית מוצלחת באנגיוספרם מסתמכת בדרך כלל על העברת גרגרי אבקה תוך-ספציפיים מהגחלת אל הצלקת, בתוך או בין פרטים (כלומר האבקה). העברה זו של גרגרי אבקה לפרח פתוח מתווכת בדרך כלל על ידי מאביקים או גורמים אביוטיים; ככזה, זה גם גורם לעתים קרובות לשקיעת אבקה הטרוספציפית בתנאים טבעיים. למעט כמה יוצאים מן הכלל, התקדמות ההאבקה על ידי אבקה הטרוספציפית היא חיסרון אבולוציוני, ומפחיתה את כושר הרבייה באמצעות הזדמנויות הזדווגות אבודות, כאשר רוב צאצאי הכלאיים הנוצרים כתוצאה מכך אינם מתפתחים כראוי או שהם סטריליים1. לפיכך, התפתחו מנגנונים לחסימת האבקה על ידי אבקה הטרוספציפית "לא תואמת"2. זיהוי מהיר של אבקה תואמת הוא אפוא התהליך החשוב ביותר בשלבים המוקדמים של רבייה מינית בצמחים פורחים רבים.
במשפחת Brassicaceae, שבה הסטיגמות הן מהסוג ה"יבש", סדרה של נקודות ביקורת מולקולריות פועלות במספר שלבים בתהליך הרבייה המווסתות את ההאבקה, כך שרק אבקה תואמת מצליחה. הידרציה של אבקה היא אחד מנקודות הביקורת החשובות ביותר (איור 1), מאחר שאבקה שאינה מצליחה להתייבש אינה יכולה להתקדם כדי לייצר צינור אבקה ולאחר מכן לספק זרע לגמטופיט הנקבה. לעתים קרובות, דגנים לא תואמים אינם עוברים את מחסום ההאבקה הראשון, ולכן אינם מקבלים גישה למים סטיגמטיים3. בקרב בני משפחת Brassicaceae, זיהוי האבקה מתרחש במהירות, כאשר התאימות נוצרת תוך דקות מחיבור גרגרי האבקה לפיסטיל 4,5. בשנים האחרונות חלה התקדמות רבה, וכעת אנו מתחילים להבין את המנגנונים המולקולריים המווסתים נקודות ביקורת האבקה מרכזיות.
איור 1: סקירה כללית של אירועי מפתח במהלך האבקה תואמת. שלבים אלה, כגון הידרציה של אבקנים ונביטה של צינור אבקה, הם גם "מחסומים" של האבקה שיש לנווט בהצלחה כדי ליצור האבקה תואמת. התרשים מייצג סטיגמה מסוג 'יבש', האופיינית למינים ממשפחת Brassicaceae 2,20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
מחקר חלוצי על מערכת אי-התאימות העצמית של Brassica (SI), שבה אבקה "עצמית" מוכרת ונדחית, ביסס את הפרדיגמה לזיהוי אבקה-סטיגמה ב- Brassicaceae 6,7,8,9,10. SI בברסיקה ובקרוביו מתווך על ידי חלבוני "זיהוי" השוכנים על פני השטח של האבקה ובקרום הפלזמה הסטיגמטי, שבעת אינטראקציה מובילים לדחיית אבקה. דחיית אבקה SI פועלת על ידי שיבוש של מערכת תאימות אבקה-סטיגמה בסיסית, אשר, כאשר מופעל במלואו על ידי תפיסה של אבקה תואמת, מוביל להפרשה ממוקדת על ידי הצלקת, ובכך מניע הידרציה אבקה (לסקירות של מנגנון תאימות אבקה, ראה11,12). בדוגמה של SI, הליגנד הנישא על האבקה הוא חלבון קטן עשיר בציסטאין, S-locus cysteine עשיר (SCR/SP11), והקולטן הסטיגמטי הוא קולטן S-locus receptor kinase (SRK).
לאחרונה, ב- Arabidopsis thaliana, קבוצה נוספת של חלבונים קטנים עשירים בציסטאין הנישאים באבקה, קבוצת חלבון מעיל אבקה B (ב- PCP-Bs), נמצאו כרגולטורים חשובים של קבלת אבקה באמצעות הפעלת הידרציה של אבקה13. קולטנים סטיגמטיים של ה- At PCP-Bsוהיבטים של מסלול הרגולציה במורד הזרם תוארו לאחרונהגם 14,15. באופן מעניין, מחקרים מוטציוניים של גנים המקודדים מתווכי איתות סטיגמטיים פוטנציאליים הנישאים על אבקה (כולל ב- PCP-Bs) לא הצליחו לייצר צמחים שיש להם חסימה מוחלטת למחסום הידרציית האבקה. עובדה זו מצביעה על כך שגורמים רבים אחרים, שעדיין לא התגלו, ממלאים תפקיד בוויסות הידרציית האבקנים. בהתבסס על השיטה שתוארה לראשונה על ידי Wang et al.13, כאן אנו מתארים ביו-אסאי משופר ברזולוציה גבוהה in vivo המתאים לזיהוי פגמים עדינים בהידרציה של אבקה בקווי A. thaliana מוטנטיים מועמדים.
Protocol
1. גידול צמחים והכנת פרחים
- לרבד זרעי A. thaliana ב 0.1 % agarose או מים סטריליים במשך 3 ימים ב 4 ° C, או כמו זרעים יבשים במשך 16-24 שעות ב -20 ° C (uNASC, תקשורת אישית).
- מעבירים את הזרעים המרובדים לעציצי קומפוסט ומניחים בתא גידול מבוקר סביבתית. להפיץ צמחים עם 16:8 שעות, בהיר: כהה photoperiod מסופק על ידי צינורות פלואורסצנטי (130 μmol m-2 s-1). שמור על הטמפרטורה ב 21 ± 2 °C (75 °F) עם כ 40% לחות יחסית.
- ודא כי צמחים תורם אבקה ומקבל, יחד עם כל קווי צמחים מתאימים אחרים "בקרה", נזרעים יחד כדי להבטיח פריחה סינכרונית. מפיצים את הצמחים כ-6 שבועות עד שהתפרחות מבוססות היטב.
- בחר ניצני פרחים שלב 12 על צמח מקבל האבקה יום אחד לפני ביצוע הבדיקה הביולוגית לניקוז16,17 - אלה ניצני פרחים שלא נפתחו שישלימו את פתיחת הפרח ואת הלחישה הגחלת למחרת18.
הערה: הימנעו משלושת הפרחים הראשונים המיוצרים על התפרחת העיקרית, מכיוון שהם בדרך כלל מפגינים התנהגות רבייה יוצאת דופן. אם זמין ומתאים למחקר, השתמש בקו צמחים סטרילי זכרי, כגון קו A. thaliana (accession Col-0) pA9-barnase, שבו אנטרים אינם מצליחים להבשיל19. - כדי לסרס פרחים של מקבל אבקה, מניחים את הצמח, בעציץ שלו, על צידו. הדביקו את גזע הצמח, באזור הסמוך לפרחים שיסולקו, למגלשת זכוכית הנמצאת במקומה תחת מיקרוסקופ מנתח סטריאו.
- בעזרת זוג מלקחיים עדינים, פתחו בזהירות את ניצן הפרח והוציאו את כל עלי הכותרת והאנתרים. יש לוודא כי הפיסטיל אינו פגום וכי הצלקת נקייה מאבקנים מזהמים.
הערה: קווי צמחים סטריליים זכריים אינם דורשים ניקוז. - החזירו את הצמחים לתא הגידול וודאו שהפרחים המסולקים אינם באים במגע עם צמחים אחרים או עם עצמים זרים.
2. בדיקת הידרציה אבקה - איסוף נתונים גולמיים
- למחרת בבוקר, הוציאו את הצמחים מתא הצמיחה. הניחו את צמח מקבל האבקה על צידו ומקמו את הפרח על במת מיקרוסקופ הפוך (איור 2) כך שניתן יהיה לצלם בבירור את הצלקת.
- קבע את מיקום הפרח לצילום על ידי השתקת הגבעול למגלשת זכוכית באמצעות רצועות מסקינג טייפ. שמור על הטמפרטורה בין 18 °C (75 °F) ו 25 °C (75 °F) ולחות יחסית מתחת 60%.
הערה: עבור קו הצמחים הסטריליים הגברי pA9-barnase, אופטימלי לבצע את הבדיקה בבוקר כאשר הפרחים נפתחים ועלי הכותרת אינם מפריעים לשדה הראייה. - לאחר מכן, הוציאו פרח בריא וטרי שנפתח מהצמח התורם אבקה. הניחו מתחת למיקרוסקופ מנתח ואספו כמה גרגרי אבקה על קצה המלקחיים הנקיים והעדינים על-ידי נגיעה עדינה באנתרים (איור 3A). ריס המודבק למוט קצר הוא גם כלי יעיל לאיסוף והעברת אבקה (איור 3C).
- הסר אבקה עודפת מן המלקחיים על ידי נגיעה קלה בהם על עלי הכותרת של הפרחים מהמקום שבו נקטפו גרגרי האבקה, עד שנוצרת שכבה אחת של גרגרי אבקה בקצה המלקחיים.
הערה: שכבה חד-שכבתית של גרגרי אבקה בקצה מלקחיים עדינים תקל באופן משמעותי על העברת גרגר בודד בשלבים הבאים. ניתן גם להשיג גרגר אבקה אחד בודד על המלקחיים בטכניקה זו (וידאו משלים S1). - חזרו לצמח מקבל האבקה והשתמשו בעדשה אובייקטיבית בעוצמה נמוכה (למשל, עדשה אובייקטיבית פי 10; איור 3B), מקדו את המיקרוסקופ ההפוך בצלקת שיש להאבק.
- כשמחזיקים את המלקחיים לאורך הפתח שבין זרועות המלקחיים (איור 4), מתקרבים בזהירות לתא פפילה סטיגמטי לא מואבק ("בתולי").
הערה: מצאנו ששיטה זו של החזקת המלקחיים מסייעת למיומנות ומפחיתה את ההשפעה של לחיצת ידיים. מיקרומניפולטור יכול לשמש למשתמשים שהם פחות מנוסים או מתקשים ליישם במדויק גרגר אבקה יחיד ביד. - בחר גרגר אבקה ממוקם כראוי על המלקחיים להעברה לסטיגמה. המשיכו להתקרב לתא הפפילה הסטיגמטי הלא מואבק עד שגרגר האבקה שנבחר יוצר מגע קל עם פני השטח שלו. משכו לאט את המלקחיים ואשרו את היצמדות האבקה (איור 5).
הערה: וידאו משלים S1 ווידאו משלים S2 מדגימים שלב זה עם גרגרי אבקה בודדים ומרובים נוכחים על המלקחיים. - ודא כי גרגר האבקה הוא בכיוון כך הציר המשווני שלה גלוי בבירור ומיקוד חד. עברו מיד לעדשה אובייקטיבית בעלת עוצמה גבוהה יותר (למשל, פי 20) וצלמו תמונה של גרגרי האבקה. תמונה ראשונה זו היא T = 0. המשך לצלם תמונות נוספות במרווחי זמן של דקה אחת למשך 10 דקות בסך הכל.
- התאימו את המיקוד לפי הצורך כדי להתאים לתנועות קטנות בגרגר האבקה או בצלקת. רשום את טמפרטורת הסביבה והלחות היחסית של החדר כל 2 דקות כדי לאפשר השוואות עתידיות בין שכפולים ניסיוניים.
- לאחר שכל התמונות נלכדו, שמור אותן בתבנית ללא אובדן נתונים, כגון התבנית הקניינית של היצרן או כתבניות TIFF.
הערה: יהיו 11 תמונות לכל גרגר אבקה שנדגם (איור משלים S1). הגדרות הרכישה האוטומטית/הידנית של קיטועי זמן ברוב תוכנות רכישת התמונות הקנייניות הן תכונות שימושיות כדי להקל על הארגון של כל סדרת זמן. - חזור על שלבים 2.4 עד 2.9 עבור גרגרי אבקה נוספים. השגת נתונים עבור מספר כמעט שווה ערך של ביקורת (סוג בר [WT]) והאבקות ניסיוניות.
איור 2: ציוד המשמש לביואסיית הידרציה של אבקנים. בדוגמה זו, קו צמחים סטרילי זכרי pA9-barnase היה מקבל האבקה. הצמח, בתוך העציץ, הונח על צדו, והגבעול הודבק למגלשת זכוכית שהוצבה על במת המיקרוסקופ. כדי להפחית לחץ מכני ולסייע במיקום הצמח, נעשה שימוש בפלטפורמה מתכווננת לתמיכה בעציץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: איסוף גרגרי אבקה מהפרח התורם אבקה. התמונות מראות את השימוש ב-(A) מלקחיים עדינים ו-(C) פיסת ריסים. גושי אבקה (חץ אדום) יש להסיר על ידי נגיעה קלה בהם על עלי הכותרת של פרחי התורם עד לקבלת שכבה אחת של גרגרי אבקה (חץ ירוק). (B) תמונה ברזולוציה גבוהה של סטיגמת קו סטרילי זכרית לא מואבקת A. thaliana (Col-0) pA9-barnase שהגיעה לשלב ההתפתחותי המתאים לביואסיית הידרציה של אבקה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שיטה להחזקת מלקחיים בעת העברת אבקה לצלקת הנמען. (א) כיוון שגוי להחזקת המלקחיים; (ב) כיוון נכון להחזקת המלקחיים. החזקת המלקחיים לצדדים בתצורה זו, כפי שמסומן על ידי מיקום האגודל בין זרועות המלקחיים, מספקת יציבות רבה יותר כדי להקל על העברת גרגרי אבקה לפפילות סטיגמטיות לא מואבקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: העברה של גרגר אבקה בודד מקצה זוג מלקחיים לתא פפילה סטיגמטי לא מואבק ("בתולי") של צמח סטרילי זכר pA9-barnase. (A) גישה זהירה כלפי תא הפפילה. (B) חיבור של גרגר אבקה במיקום מתאים (חץ כחול) לתא הפפילה (חץ כתום). (C) משיכת המלקחיים ואישור חזותי של חיבור אבקה (חץ סגול). לוחות A-C צולמו בעדשה אובייקטיבית 10x (מרחק עבודה של 10.5 מ"מ; צמצם מספרי 0.25) והם תצלומי בזק שנגזרו מסרטון הווידאו שהוצג בסרטון המשלים S1. (D) מעבר לעדשה אובייקטיבית של 20x (מרחק עבודה של 2.1 מ"מ; צמצם מספרי של 0.5) לצורך התחלת לכידת תמונה בסדרת זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
3. מדידות בדיקת הידרציה של אבקה
- הגדירו את קצב הידרציית האבקה כשינוי באורך הציר החצי-מינורי (איור 6) של גרגר האבקה (כלומר, רדיוס קו המשווה) לאורך זמן, והציגו אותו כאחוז השינוי (משוואה [1]):
(1) - באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, רשום ערכי ציר חצי מינוריים עבור כל גרגר אבקה בסדרת הניסויים.
הערה: השם של אפשרות מדידה זו תלוי תוכנה, כגון 'אליפסה מסובבת' או 'אליפסה של 5 נקודות'. - חזור על שלבים 3.1-3.2 כדי שכל גרגרי האבקה האחרים יימדדו. כדי לשמור על עקביות, יישמו את אותה מידה של זום דיגיטלי ואת אותה גישה להגדרת 'גבול האבקה' עבור כל המדידות במערכי הנתונים.
- לאחר השלמת כל המדידות לסדרת זמן, יצא את ערכי הצירים הגולמיים המינוריים למחצה של כל אוסף תמונות לגיליון אלקטרוני והצג את הנתונים בעמודות לכל אוסף תמונות. ודא הכללת נתונים של לפחות 15 גרגרי אבקה hydrated בניתוח עבור כל קו צמח (טבלה משלימה S1).
- זה לא יוצא דופן עבור מספר קטן של גרגרי אבקה להיכשל לחות או לחות באופן משמעותי לאט יותר מהצפוי. גרגרי נפל אלה עשויים להיות תוצאה של מגע לקוי בין הדגן לתא הפפילה או קשורים לכדאיות האבקה. חפש ואל תכלול אותם במערך הנתונים, אלא אם כן הם נדרשים בתכנון הניסוי שלהם.
- חשב את הערכים הממוצעים עבור כל נקודת זמן לכל קו צמח. השתמש במבחני t לא מזווגים וב-ANOVA חד-כיווני לניתוח סטטיסטי של נתוני הידרציה מ-WT וקווים מוטנטיים בכל נקודת זמן. השתמש במבחן t מרובים להשוואה סימולטנית של האמצעים בין WT וקווים מוטנטיים על פני נקודות זמן מרובות.
הערה: חלקות XY שימושיות מאוד גם להמחשת המגמה הכוללת של הידרציה אבקה בין קווי הצמחים המושווים.
(1)
איור 6: גרגרי אבקה WT מתבלבלים על תא פפילה סטיגמטי של A. thaliana (Col-0; pA9-barnase זכר קו סטרילי). (A) נקודת זמן אפס, 0 (0 MAP) ו-(B) 10 MAP. העיגול האדום סביב גרגר האבקה הוא "גבול האבקה" שהוגדר ושורטט על ידי המפעיל באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. הקווים הירוקים והאדומים הכהים בתוך האבקה מייצגים את הצירים החצי-מז'וריים והחצי-מינוריים, בהתאמה. אורך הציר המינורי למחצה משמש לחישוב מידת הידרציה אבקה. סדרה מלאה של מערך נתונים זה ניתן למצוא באיור משלים S1. התמונה צולמה עם עדשה אובייקטיבית 20x (מרחק עבודה 2.1 מ"מ; צמצם מספרי 0.5). פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: MAP = מינימום לאחר האבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Representative Results
חלק זה מציג שתי קבוצות של נתוני הידרציה לדוגמה של אבקה, שנאספו כמתואר לעיל, עבור A. thaliana. קבוצת הנתונים הראשונה מורכבת משלושה עותקים משוכפלים של סדרת זמן הידרציה של אבקה עבור צמחי WT, כאשר כל שכפול נאסף ביום אחר. כל העתק מכיל לא פחות מ-18 ערכי גרגרי אבקה בודדים, ובסך הכל 55 גרגרי אבקה בכל שלושת ההעתקים. ערכי המינימום והמקסימום של האמצעים בין המשוכפלים, עבור כל נקודות הזמן, היו בטווח של 3% (איור 7 וטבלה משלימה S1). נתונים מייצגים אלה עבור האבקות WT מדגימים בבירור את רמת העקביות הגבוהה שניתן להשיג תוך שימוש במתודולוגיה המפורטת כאן עבור מספרי מדגם נמוכים יחסית ועל פני ימים שונים.
איור 7: תרשים XY המראה עקביות של פרופילי הידרציה של אבקה מסוג A. thaliana wild type על פני פרק זמן של 10 דקות. ההורה האבקה היה Col-0 של A. thaliana וההורה pistil היה הזכר pA9-barnase סטרילי A. thaliana (Col-0) קו . הנתונים מייצגים שלושה מערכי נתונים עצמאיים שנאספו בימים שונים ומפגינים רמה גבוהה של עקביות. תרשים קופסה ושפם וניתוח סטטיסטי של האמצעים למערכי נתונים אלה מוצגים בתרשים משלים S2. מספר האבקה הנמדדת ('n') עבור כל ערכת נתונים עצמאית מוצג לצד התחביר (WT1/WT2/WT3) באיור. קיצור: WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קבוצת הנתונים השנייה התקבלה עבור קו צמחים המכיל החדרת T-DNA בגן מקודד חלבון בציפוי אבקה היוצר מוטציה "מפילה", המכונה כאן "מוטציה KD". אבקה מוטנטית הופקדה על סטיגמות סטריליות זכריות pA9-barnase לצורך פרופיל הידרציה, כמתואר בפרוטוקול. כפי שניתן לראות מהנתונים שהתקבלו (איור 8), למוטציות ולאבקני WT היו פרופילי הידרציה בלתי ניתנים להבחנה במהלך 5 הדקות הראשונות. עם זאת, 5-10 דקות לאחר האבקה (MAP), השינוי הממוצע בציר החצי-מינורי עבור אבקה מוטנטית החל להיות מאחורי זה של אבקת WT, כאשר ההבדל הפך מובהק סטטיסטית ב-10 MAP. תוצאה זו לא רק מדגימה כי לחלבון פרווה אבקני זה יש תפקיד בתיווך הידרציה של אבקה, אלא גם ממחישה יפה את התועלת של בדיקה ביולוגית זו ברזולוציה גבוהה של גרגר יחיד למעקב אחר הידרציה של אבקנים. בדוגמה הספציפית הזו, הרגישות שלו הצליחה לזהות את ההשפעה העדינה של "הפלה" של גן המקודד חלבון בציפוי אבקה.
איור 8: פרופילי הידרציה של אבקה עבור WT וקו מוטנטי של חלבון מעיל אבקה (מוטנט KD). (A) פרופילי הידרציה במשך פרק זמן של 10 דקות עבור WT ואבקה מוטנטית. הורי האבקה היו ההצטרפות Col-0 של A. thaliana וחלבון הפרווה KD מוטנט (גם הוא ברקע Col-0). בשני המקרים, ההורה הפיסטיל היה קו A. thaliana (Col-0) סטרילי זכר pA9-barnase. (B) תרשימי קופסה ושפם המראים את מידת הידרציית האבקה (במונחים של אחוז השינוי של הציר החצי-מינורי) ב-5 MAP וב-10 MAP עבור מערכי נתונים של WT ואבקנים מוטנטיים. שפם מייצג ערכי מינימום ומקסימום לדוגמה. תיבות מתארות את הרביעון התחתון, החציון והרביעון העליון של ערכת הנתונים. צלבים לבנים מייצגים את הממוצע של ערכת הנתונים. ניתוח לא מזווג של בדיקת t מראה כי האחוז הממוצע של הידרציה אבקה שונה באופן משמעותי בין שני קווי הצמח ב 10 MAP. כוכבית אחת מציינת p < 0.05 (מבחן t לא מזווג). קיצורים: WT = סוג פראי; KD = להפיל; MAP = מינימום לאחר האבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: סדרת זמן קצוצה של אבקת אבקה של גרגר אבקה WT המתייבש על תא פפילה סטיגמטי של צמח סטרילי זכר pA9-barnase במשך 10 דקות. התמונות צולמו במרווחים של דקה. התמונות ב-0 MAP וב-10 MAP שימשו באיור 6 (מצורפות בנפרד). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: WT = סוג פראי; MAP = מינימום לאחר האבקה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: תרשים קופסה ושפם המראה את מידת הידרציית האבקה (במונחים של אחוז השינוי של הציר החצי-מינורי) על פני פרק זמן של 10 דקות עבור שלושת מערכי הנתונים של אבקני WT המתוארים באיור 7. ההורה הפיסטילי היה קו A. thaliana (Col-0) סטרילי זכר pA9-barnase. שפם מייצג ערכי מינימום ומקסימום לדוגמה. תיבות מתארות את הרביעון התחתון (ציר תחתון), חציון (ציר אמצעי) ורביעון עליון (ציר עליון) של ערכת הנתונים. נקודות נתונים נפרדות מוצגות. ANOVA חד-כיווני מראה כי האחוז הממוצע של ערכי הידרציה אבקה בין שלושת מערכי הנתונים לא היה שונה באופן מובהק סטטיסטית זה מזה לאורך פרק הזמן של 10 דקות. הסף המשמעותי הוא p < 0.05 (ANOVA חד כיוונית). קיצור: WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S1: נתוני הידרציה גולמיים של אבקה ששימשו לבניית איור 7 (A. thaliana WT Col-0 pollen on pA9-barnase male sterile stigma). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרטון משלים S1: סרטון המדגים העברה של גרגר אבקה WT יחיד (Col-0 accession) על קצה זוג מלקחיים לתא פפילה סטיגמטי 'בתולי' (קו סטרילי זכרי pA9-barnase). כדי להקל על נגישות הסרטון, איכות התמונה הופחתה בכוונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרטון משלים S2: סרטון המדגים העברה של אבקה בודדת מסוג WT (Col-0 accession) משכבה חד-שכבתית של גרגרי אבקה בקצה זוג מלקחיים לתא פפילה סטיגמטי 'בתולי' (קו סטרילי זכרי pA9-barnase). כדי להקל על נגישות הסרטון, איכות התמונה הופחתה בכוונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
עבור צמחים פורחים, השלבים המוקדמים מאוד של רבייה מינית הם ללא ספק החשובים ביותר. ברמת האינטראקציה אבקה-סטיגמה, מתקבלות החלטות מולקולריות הקובעות את "ההתאמה" של השותפים המקיימים אינטראקציה. החלטות כאלה, אם מתקבלות נכון, מונעות בזבוז משאבים שעלול להשפיע על כושר הרבייה21. לפיכך, מתן היתר רק לאבקה תואמת כדי להשפיע על ההפריה הוא מרכיב חשוב אחד בשמירה על גנוטיפים מותאמים היטב, ובכך ההצלחה האבולוציונית של מינים. מחקר שנערך עם צמח המודל A. thaliana היה בעל ערך רב בהעמקת ההבנה שלנו של תהליך זה. מספר מחקרים בעשורים האחרונים חשפו את נוכחותם של גורמים במעטפת האבקה הפועלים ב"מחסום" התאימות הראשון, שבו האבקה מקבלת גישה למים סטיגמטיים כדי לאפשר הידרציה של אבקה13. למרות התובנות הראשונות הללו לגבי המנגנונים המווסתים את תאימות האבקה-סטיגמה, עדיין קיימים פערים רבים בהבנתנו את התהליך הזה. נכון להיום, אף מוטציה של ליגנדים הנישאים באבקה או קולטנים סטיגמטיים הידועים כמשפיעים על הידרציית אבקה אינה יכולה לחסום לחלוטין האבקה תואמת, דבר המצביע על נוכחותם של קובעי הידרמינציה אבקניים אחרים שלא התגלו. על ידי היכולת להתבונן בקלות בפנוטיפ של עניין, bioassay הידרציה אבקה המתואר כאן הוא אחת הטכניקות הפשוטות ביותר לחקור מוטנטים פוטנציאליים המווסתים האבקה.
מתודולוגיות קיימות למדידת הידרציה של אבקנים משתמשות בדרך כלל בהאבקה בתפזורת ומדווחות על פחות נקודות זמן 14,22,23, ולכן עלולות להחמיץ פנוטיפים חשובים של פרופיל הידרציה עדינה. לדוגמה, המחקר של וואנג ועמיתיו 13, יחד עם עבודה על מוטנטים אחרים של חלבון פרווה אבקה במעבדה שלנו (תצפיות שלא פורסמו), חשפו הבדלים מסקרנים בפרופילי הידרציה בין מוטנטים. הבדלים עדינים כאלה עשויים להכיל רמזים חשובים למנגנוני הבקרה העומדים בבסיס האבקה תואמת.
השיטה המתוארת כאן מתמקדת ברכישת מספר קטן יחסית של מדידות בין קווי צמחים מוטנטיים ו-WT, בדגש על דיוק מתודולוגי לצמצום השונות בתוך מערכי הנתונים. בעוד ששיטה זו ניתנת לשחזור גבוה (כפי שמוצג באיור 7), בהנחה שהטמפרטורה והלחות נשלטות כראוי, חשוב לאסוף נתוני הידרציה עבור מספר כמעט שווה של WT ואבקה מוטנטית באותו יום כדי להפחית עוד יותר את פוטנציאל השונות. לאחר מכן ניתן לאגד נתונים על פני ימים שונים במידת הצורך. בנוסף, בחירת מתקני הבקרה המתאימים של WT חיונית לפרשנות נכונה של תוצאות ההידרציה. עבור מקבל האבקה, אותו קו צמחי צריך לשמש לקבלת בקרת WT וגרגירי אבקה מוטנטיים.
לדוגמה, אנו משתמשים בקו הצמחים הסטריליים הזכרי pA9-barnase, שמוצג גם בפרוטוקול הווידיאו, כמקבל האבקה הן עבור אבקה מסוג WT (בקרה) והן עבור אבקה מוטנטית (ניסיונית) בעת חקירת קווי מוטציות של אבקני T-DNA (כמו מוטציית KD המתוארת באיור 8). יש להימנע מערבוב של נתונים מקו סטרילי גברי שכזה, שאין צורך לסרס, עם זה שנאסף מקו בקרה המסולק ידנית, שכן סטיגמות אלה צפויות להתנהג אחרת. כמו כן, יש להשתמש בקווים מוטנטיים מסולקים בשילוב עם קו WT (בקרה) מקולקל במידת האפשר. אותה זהירות צריכה להיות מיושמת גם כאשר בוחנים את הרקע הגנטי של הצמחים הנחקרים. בעוד שרוב אוספי מוטנטי T-DNA הפופולריים נוצרו ברקע Col-0, אחרים, כגון אוסף FLAG מהמכון הלאומי לאגרונומיה (INRA), זמינים ברקע הגנטי Wassilewskija (WS)24,25. במקרים כאלה, מומלץ להשתמש בקווי הצמחים WT של האקוטיפ המתאים כבקרות.
למרות שכאן התמקדנו בהידרציה של אבקה במהלך 10 הדקות הראשונות של אינטראקציית אבקה-סטיגמה, שיטה זו יכולה להיות מותאמת גם כדי להקיף פרופילי הידרציה המכסים פרק זמן ארוך יותר. מאפיין מרכזי של הפרוטוקול הוא שהפרחים נשארים מחוברים לצמח האב הפרוטוקולים שפורסמו בדרך כלל דורשים כריתה של הפיסטיל ומיקום במדיה כדי לקיים את הרקמה למשך הניסוי14,18,26. למרות שאין ראיות ישירות המצביעות על כך שגישת semi in vivo כזו משפיעה על הידרציה של אבקה או אכן משנה את ויסות in vivo של תהליך זה, ניתן להעלות על הדעת כי כריתת הפרחים מצמח האב עשויה להשפיע על האבקה. לפיכך, פרוטוקול זה משיג סביבת in vivo אמיתית לחקר האינטראקציה אבקה-סטיגמה, שבה נשמרת שלמותו המבנית של הצמח.
העברת גרגרי אבקה בודדים לפפילות סטיגמטיות "בתוליות" היא ללא ספק אחת הפעולות המאתגרות ביותר המתוארות בפרוטוקול זה. אין זה נדיר להעביר אשכולות של גרגרי אבקה בטעות. אולם ניתן להפחית במידה ניכרת את הסיכוי שזה יקרה על-ידי הבטחה שרק שכבה אחת של אבקה נמצאת על המלקחיים (איור 3A) (או אפילו רק גרגר אבקה יחיד; איור 5), ו/או על-ידי שימוש בגרגרי אבקה שכבר מכוונים, כך שהם "בולטים" מאחרים בקצה המלקחיים. מצאנו כי מפעיל מנוסה יכול להשלים בהצלחה העברה של אבקה בודדת לתא פפילה סטיגמטי בתוך כ -3 דקות ולהקליט נתונים עבור עד חמישה גרגרי אבקה על פני תקופה של 1 שעות. כך, במשך תקופה של 2-4 ימים, ניתן לצבור מספיק נתונים לניתוח סטטיסטי משמעותי של קווי הצמחים הנחקרים.
טעויות אנוש הן המקור הגדול ביותר לשונות בניתוח מערכי נתונים הנגזרים ממחקרים המשתמשים בפרוטוקול זה. לדוגמה, ההגדרה של "גבול האבקה" במהלך ניתוח תמונה מסתכמת בשיקול דעתו של החוקר הבודד. לפיכך, קיים פוטנציאל שמדידות שנעשות על ידי חוקרים שונים, אפילו על אותו מערך נתונים, עשויות ליצור שונות. במידת האפשר, חוקר יחיד צריך לבצע את המדידות כדי למזער טעויות דגימה. בנוסף, צימוד של WT ומערכי נתונים מוטנטיים על ידי אותו אופרטור שולל את ההגדרה הסובייקטיבית הפוטנציאלית של "גבול האבקה" והשונות הבין-אופרטיבית.
לסיכום, מתוארת שיטה מתוחכמת אך מדויקת למדידת פרופילי הידרציה של אבקנים באורגניזם המודל A. thaliana . הוכחנו כי, על ידי שימוש בפרוטוקול זה, ניתן להשיג בקלות נתוני הידרציה עקביים ביותר של אבקה עבור A. thaliana . שלוש קבוצות נתונים בלתי תלויות עבור האבקות WT שנרכשו בימים שונים הראו סטיות קטנות עקביות של <3% בכל נקודות הזמן (איור 7 וטבלה משלימה S1). למרות שהביו-אסאה המוצגת כאן מעט מורכבת יותר מרוב הפרוטוקולים הקיימים, הרזולוציה של הנתונים המופקים עדיפה ומתאימה לזיהוי ואפיון מוטנטים חדשים המשפיעים על מסלולים המווסתים האבקה תואמת.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת באת' (אוניברסיטת באת', בריטניה, BA2 7AY) מלגות לתואר שני ל Y.-L.L. ואיור 1 של L.W. נוצר עם BioRender.com (https://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pA9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
| Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
| GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
| JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
| Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
| Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
| Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
| Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
| Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
| Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
| Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
| WT Col-0 plant line | uNASC | N70000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |
References
- Rieseberg, L. H., Willis, J. H.
- Hiscock, S. J., Allen, A. M. Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus. New Phytologist. 179 (2), 286-317 (2008).
- Kandasamy, M. K., Nasrallah, J. B., Nasrallah, M. E. Pollen pistil interactions and developmental regulation of pollen-tube growth in Arabidopsis. Development. 120 (12), 3405-3418 (1994).
- Bosch, M., Wang, L. Pollen-stigma interactions in Brassicaceae: complex communication events regulating pollen hydration. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2465-2468 (2020).
- Rozier, F., et al. Live-cell imaging of early events following pollen perception in self-incompatible Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2513-2526 (2020).
- Dickinson, H. Dry stigmas, water and self-incompatibility in Brassica. Sexual Plant Reproduction. 8, 1-10 (1995).
- Takasaki, T., et al. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma. Nature. 403 (6772), 913-916 (2000).
- Schopfer, C. R., Nasrallah, M. E., Nasrallah, J. B. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science. 286 (5445), 1697-1700 (1999).
- Takayama, S., et al. Direct ligand-receptor complex interaction controls Brassica self-incompatibility. Nature. 413 (6855), 534-538 (2001).
- Shiba, H., et al. A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specificity in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiology. 125 (4), 2095-2103 (2001).
- Broz, A. K., Bedinger, P. A. Pollen-pistil interactions as reproductive barriers. Annual Review of Plant Biology. 72 (1), 615-639 (2021).
- Cheung, A. Y., Duan, Q., Li, C., James Liu, M. -C., Wu, H. -M. Pollen-pistil interactions: It takes two to tangle but a molecular cast of many to deliver. Current Opinion in Plant Biology. 69, 102279 (2022).
- Wang, L. D., et al. PCP-B class pollen coat proteins are key regulators of the hydration checkpoint in Arabidopsis thaliana pollen-stigma interactions. New Phytologist. 213 (2), 764-777 (2017).
- Liu, C., et al. Pollen PCP-B peptides unlock a stigma peptide-receptor kinase gating mechanism for pollination. Science. 372 (6538), 171-175 (2021).
- Bordeleau, S. J., Sanchez, L. E. C., Goring, D. R. Finding new Arabidopsis receptor kinases that regulate compatible pollen-pistil interactions. Frontiers in Plant Science. 13, 1022684 (2022).
- Suwabe, K., et al. Double-locking mechanism of self-compatibility in Arabidopsis thaliana: the synergistic effect of transcriptional depression and disruption of coding region in the male specificity gene. Frontiers in Plant Science. 11, 576140 (2020).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Lee, H. K., Macgregor, S., Goring, D. R. A toolkit for teasing apart the early stages of pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. Pollen and Pollen Tube Biology. 2160, 13-28 (2020).
- Dilkes, B. P., et al. The maternally expressed WRKY transcription factor TTG2 controls lethality in interploidy crosses of Arabidopsis. PLoS Biology. 6 (12), 2707-2720 (2008).
- Riglet, L., et al. KATANIN-dependent mechanical properties of the stigmatic cell wall mediate the pollen tube path in Arabidopsis. eLife. 9, e57282 (2020).
- Zhou, L. Z., Dresselhaus, T. Friend or foe: Signaling mechanisms during double fertilization in flowering seed plants. Plant Development and Evolution. 131, 453-496 (2019).
- Gao, X. -Q., et al. The Arabidopsis KINβγ subunit of the SnRK1 complex regulates pollen hydration on the stigma by mediating the level of reactive oxygen species in pollen. PLoS Genetics. 12 (7), e1006228 (2016).
- Lee, H. K., Goring, D. R. Two subgroups of receptor-like kinases promote early compatible pollen responses in the Arabidopsis thaliana pistil. Journal of Experimental Botany. 72 (4), 1198-1211 (2021).
- O'Malley, R. C., Barragan, C. C., Ecker, J. R. A user's guide to the Arabidopsis T-DNA insertion mutant collections. Pollen and Pollen Tube Biology. 1284, 323-342 (2015).
- Samson, F., et al. FLAGdb++: a database for the functional analysis of the Arabidopsis genome. Nucleic Acids Research. 32, D347-D350 (2004).
- Doucet, J., et al. Investigations into a putative role for the novel BRASSIKIN pseudokinases in compatible pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 19 (1), 549 (2019).
