Summary
En förbättrad metod för att mäta pollenhydratiseringsprofiler i Arabidopsis thaliana beskrivs här. Den nya metoden erbjuder högre upplösning, är icke-invasiv och är mycket reproducerbar. Protokollet representerar ett nytt verktyg för en finare dissektion av de processer som reglerar de tidiga stadierna av pollinering.
Abstract
Sexuell reproduktion i blommande växter kräver initial interaktion mellan pollenkornet och den stigmatiska ytan, där en molekylär dialog upprättas mellan de interagerande partnerna. Studier över en rad arter har visat att en serie molekylära kontrollpunkter reglerar pollen-stigma-interaktionen för att säkerställa att endast kompatibel, i allmänhet intraspecifik pollen är framgångsrik för att åstadkomma befruktning. I arter som har en "torr stigma", såsom modellväxten Arabidopsis thaliana, är den första kontrollpunkten efter pollinering, prezygotisk kompatibilitetskontrollpunkt upprättandet av pollenhydrering.
Denna fas av pollinering är hårt reglerad, varigenom signaler från pollenkornet framkallar frisättning av vatten från stigmatiseringen, vilket möjliggör pollenhydrering. Förmågan att noggrant mäta och spåra pollenhydrering över tid är nyckeln till utformningen av experiment som syftar till att förstå regleringen av detta kritiska steg i reproduktionen. Publicerade protokoll använder ofta blommor som har skurits ut från moderplantan, upprätthållits på flytande eller fasta medier och bulkpollinerat.
Detta dokument beskriver en icke-invasiv, in vivo pollinering bioassay som möjliggör minut-för-minut hydreringsspårning av enskilda A. thaliana pollenkorn med hög upplösning. Analysen är mycket reproducerbar, kan detektera mycket subtila variationer av pollenhydratiseringsprofiler och är därför lämplig för analys av mutanter som påverkar vägar som reglerar pollinering. Även om protokollet är längre än de som beskrivs för bulkpollineringar, gör precisionen och reproducerbarheten det ger, tillsammans med dess in vivo-natur , det idealiskt för detaljerad dissektion av pollineringsfenotyper.
Introduction
Framgångsrik sexuell reproduktion hos angiospermer bygger vanligtvis på överföring av intraspecifika pollenkorn från anther till stigmatiseringen, antingen inom eller mellan individer (dvs. pollinering). Denna överföring av pollenkorn till en mottaglig blomma förmedlas vanligtvis av pollinatorer eller abiotiska faktorer; Som sådan resulterar detta också ofta i avsättning av heterospecifikt pollen under naturliga förhållanden. Med några få undantag är utvecklingen av pollinering av heterospecifikt pollen evolutionärt ofördelaktig, vilket minskar reproduktiv kondition genom förlorade parningsmöjligheter, med de flesta resulterande hybridavkommor som antingen misslyckas med att utvecklas på lämpligt sätt eller är steril1. Således har mekanismer utvecklats för att blockera pollinering av "inkompatibel" heterospecifik pollen2. Snabb igenkänning av kompatibel pollen är därför utan tvekan den viktigaste processen i de tidiga stadierna av sexuell reproduktion i många blommande växter.
I familjen Brassicaceae, där stigmas är av den "torra" typen, verkar en serie molekylära kontrollpunkter i flera steg i reproduktionsprocessen som reglerar pollinering, så att endast kompatibel pollen är framgångsrik. Pollenhydrering är en av de viktigaste kontrollpunkterna (figur 1), eftersom pollen som inte hydrerar inte kan utvecklas för att producera ett pollenrör och därefter leverera spermier till den kvinnliga gametofyten. Ofta misslyckas inkompatibla korn att passera denna första pollineringskontrollpunkt och får därmed inte tillgång till stigmatiskt vatten3. Bland medlemmar av familjen Brassicaceae sker igenkänningen av pollen snabbt, med kompatibilitet som fastställs inom några minuter efter pollenkornets bindning till pistillen 4,5. Under de senaste åren har stora framsteg gjorts, och vi börjar nu förstå de molekylära mekanismer som reglerar viktiga pollineringskontrollpunkter.
Figur 1: Översikt över viktiga händelser under kompatibel pollinering. Dessa steg, såsom pollenhydrering och pollenrörspiring, är också pollineringskontrollpunkter som måste navigeras framgångsrikt för att åstadkomma kompatibel pollinering. Diagrammet representerar en "torr" typ stigma, som är typisk för arter från Brassicaceae familjen 2,20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Banbrytande forskning om Brassica self-incompatibility (SI) -systemet, där "själv" pollen erkänns och avvisas, etablerade paradigmet för pollen-stigma erkännande i Brassicaceae 6,7,8,9,10. SI i Brassica och dess släktingar förmedlas av "igenkännande" proteiner som finns på ytan av pollen och vid det stigmatiska plasmamembranet som vid interaktion leder till pollenavstötning. SI-pollenavstötning fungerar genom störning av det basala pollen-stigma-kompatibilitetssystemet som, när det aktiveras fullt ut av uppfattningen av kompatibelt pollen, leder till riktad utsöndring av stigmatiseringen, vilket driver pollenhydrering (för recensioner av pollenkompatibilitetsmekanismen, se11,12). I exemplet med SI är den pollenburna liganden ett litet cysteinrikt protein, S-locus cysteinrikt (SCR / SP11), och den stigmatiska receptorn är S-locus receptorkinas (SRK).
Nyligen, i Arabidopsis thaliana, har en annan grupp av små cysteinrika pollenburna proteiner, pollenbeläggningsproteinklass B (vidPCP-Bs), visat sig vara viktiga regulatorer för pollenacceptans genom aktivering av pollenhydrering13. Stigmatiska receptorer av AtPCP-Bs och aspekter av nedströms regleringsvägen har också nyligen beskrivits14,15. Intressant nog har mutationsstudier av gener som kodar för potentiella pollenburna och stigmatiska signalmediatorer av pollenhydrering (inklusive vidPCP-Bs) misslyckats med att generera växter som har ett komplett block till pollenhydreringskontrollpunkten. Detta tyder starkt på att flera andra, ännu oupptäckta, faktorer spelar en roll i regleringen av pollenhydrering. Med utgångspunkt i den metod som först beskrevs av Wang et al.13 beskriver vi här en förbättrad högupplöst in vivo-bioassay lämplig för identifiering av subtila pollenhydratiseringsdefekter i kandidatmuterade A. thaliana-linjer.
Protocol
1. Växttillväxt och beredning av blommor
- Stratifiera A. thaliana frön i 0,1% agaros eller sterilt vatten i 3 dagar vid 4 ° C, eller som torra frön i 16-24 timmar vid -20 ° C (uNASC, personlig kommunikation).
- Överför de stratifierade fröna till kompostkrukor och placera i en miljökontrollerad tillväxtkammare. Föröka växter med en 16:8 h, ljus:mörk fotoperiod från lysrör (130 μmol m-2 s-1). Håll temperaturen vid 21 ± 2 °C med cirka 40 % relativ luftfuktighet.
- Se till att pollendonatorer och mottagande växter, tillsammans med andra lämpliga "kontroll"-växtlinjer, sås tillsammans för att säkerställa synkron blomning. Föröka växterna i cirka 6 veckor tills blomställningarna är väl etablerade.
- Välj steg 12 blomknoppar på pollenmottagarväxten 1 dag innan du utför bioanalysen för emasculation 16,17-dessa är oöppnade blomknoppar som kommer att slutföra blomöppningen och anther dehiscence följande dag 18.
OBS: Undvik de tre första blommorna som produceras på huvudblomställningen, eftersom dessa vanligtvis uppvisar ovanligt reproduktivt beteende. Om det är tillgängligt och lämpligt för studien, använd en manlig steril växtlinje, såsom A. thaliana (accession Col-0) pA9-barnase-linjen, där ståndare inte mognar19. - För att emasculera blommor av pollenmottagaren, placera växten, i sin kruka, på sin sida. Tejpa växtstammen, i regionen nära blommorna som kommer att emasculeras, till en glasskiva som är på plats under ett stereodissekeringsmikroskop.
- Använd ett par pincett, reta försiktigt upp blomknoppen och ta bort alla blomblad och strumpor. Se till att pistillen är oskadad och att stigmatiseringen är fri från förorenande pollen.
OBS: Manliga sterila växtlinjer kräver inte emasculation. - Återför växterna till tillväxtkammaren och se till att de emasculerade blommorna inte kommer i kontakt med andra växter eller främmande föremål.
2. Pollenhydreringsanalys-rådatainsamling
- Följande morgon, ta bort växterna från tillväxtkammaren. Lägg pollenmottagarväxten på sin sida och placera blomman på scenen i ett inverterat mikroskop (figur 2) så att stigmatiseringen tydligt kan avbildas.
- Fixa positionen för blomman som ska avbildas genom att immobilisera stammen till en glasskiva med remsor av maskeringstejp. Håll temperaturen mellan 18 °C och 25 °C och relativ luftfuktighet under 60 %.
OBS: För den manliga sterila växtlinjen pA9-barnas är det optimalt att utföra analysen på morgonen när blommorna öppnas och kronbladen inte hindrar synfältet. - Ta sedan bort en hälsosam och nyöppnad blomma från pollendonatorplantan. Placera under ett dissekerande mikroskop och samla några pollenkorn på spetsen av rena pincett med fin spets genom att försiktigt röra vid ståndarna (figur 3A). En ögonfrans tejpad på en kort stav är också ett effektivt verktyg för att samla in och överföra pollen (figur 3C).
- Ta bort överskott av pollen från pincetten genom att lätt röra dem mot kronbladen på blommorna från vilka pollenkornen skördades tills ett monolager pollenkorn bildas vid spetsen av pincetten.
OBS: Ett monolager av pollenkorn på spetsen av finspetsade pincett kommer avsevärt att underlätta överföring av enstaka korn i efterföljande steg. Det är också möjligt att erhålla ett enda pollenkorn på pincetten med denna teknik (kompletterande video S1). - Återgå till pollenrecipienten och använd en lågeffektlins (t.ex. 10x objektivlins; Figur 3B), fokusera det inverterade mikroskopet på stigmatiseringen som ska pollineras.
- Håll pincetten längs öppningen mellan tångens armar (figur 4) och närma dig försiktigt en opollinerad ("jungfrulig") stigmatisk papillcell.
OBS: Vi har funnit att denna metod för att hålla tången hjälper fingerfärdighet och minskar effekten av att skaka hand. En mikromanipulator kan användas för användare som är mindre erfarna eller har svårt att exakt applicera ett enda pollenkorn för hand. - Välj ett lämpligt placerat pollenkorn på pincetten för överföring till stigmatiseringen. Fortsätt att närma dig den opollinerade stigmatiska papillcellen tills det valda pollenkornet kommer lätt i kontakt med ytan. Dra långsamt ut pincetten och bekräfta pollenfästet (figur 5).
OBS: Kompletterande video S1 och kompletterande video S2 demonstrerar detta steg med både enstaka och flera pollenkorn närvarande på pincetten. - Se till att pollenkornet är orienterat så att dess ekvatorialaxel är tydligt synlig och i skarpt fokus. Byt omedelbart till en objektivlins med högre effekt (t.ex. 20x) och ta en bild av pollenkornet. Den första bilden är T = 0. Fortsätt att ta ytterligare bilder med 1 min intervall, totalt 10 min.
- Justera fokus efter behov för att rymma små rörelser i pollenkornet eller stigmatiseringen. Registrera rummets omgivningstemperatur och relativa luftfuktighet var 2:e minut för att möjliggöra framtida jämförelser mellan experimentella replikat.
- När alla bilder har tagits, spara dem i ett förlustfritt format, till exempel tillverkarens proprietära format eller som TIFF.
OBS: Det kommer att finnas 11 bilder per pollenkorn som provtas (kompletterande figur S1). De automatiserade/manuella timelapse-inhämtningsinställningarna i de flesta proprietära bildinsamlingsprogram är användbara funktioner för att underlätta organiseringen av varje tidsserie. - Upprepa steg 2.4 till 2.9 för ytterligare pollenkorn. Inhämta data för nästan motsvarande antal kontroller (vildtyp [WT]) och experimentella pollineringar.
Figur 2: Utrustningsinstallation som används för pollenhydreringsbioanalys. I detta exempel var en pA9-barnas-manlig steril växtlinje pollenmottagaren. Växten, i sin kruka, placerades på sin sida och stammen tejpades fast på en glasskiva placerad på mikroskopets scen. För att minska mekanisk påfrestning och underlätta positionering av växten användes en justerbar plattform för att stödja växtkrukan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Insamling av pollenkorn från pollendonatorblomman. Bilder visar användningen av (A) pincett med fin spets och (C) en bit ögonfransar. Klumpar av pollen (röd pil) bör avlägsnas genom att lätt röra dem mot kronbladen på givarblommorna tills ett monolager pollenkorn erhålls (grön pil). (B) Högupplöst bild av en opollinerad A. thaliana (Col-0) pA9-barnas-hane steril linje stigma som har nått ett lämpligt utvecklingsstadium för pollenhydrering bioassay. Skalstapel = 100 μm (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Metod för att hålla pincett vid överföring av pollen till mottagarens stigma. (A) Felaktig orientering för att hålla tången; (B) korrekt riktning för att hålla tången. Att hålla pincetten i sidled i denna konfiguration, vilket indikeras av tummens position mellan tångens armar, ger större stabilitet för att underlätta överföringen av pollenkorn till opollinerade stigmatiska papiller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Överföring av ett enda pollenkorn från spetsen av ett par pincett till en opollinerad ("jungfrulig") stigmatisk papillcell från en pA9-barnashansteril växt. (A) Försiktigt närma sig papillcellen. (B) Fastsättning av ett lämpligt placerat pollenkorn (blå pil) på papillcellen (orange pil). (C) Uttag av pincett och visuell bekräftelse av pollenfäste (lila pil). Panelerna A-C avbildades med en 10x objektivlins (10,5 mm arbetsavstånd; 0,25 numerisk bländare) och är ögonblicksbilder härledda från videoklippet som presenteras i kompletterande video S1. (D) Övergång till ett 20x objektivobjektiv (2,1 mm arbetsavstånd; 0,5 numerisk bländare) för initiering av bildtagning i en tidsserie. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Mätningar av pollenhydrering
- Definiera pollenhydratiseringshastigheten som längdförändringen för pollenkornets halvdelaxel (figur 6) över tiden och presentera den som procentuell förändring (ekvation [1]):
(1) - Med hjälp av bildanalysprogramvara registrerar du halv-mindre axelvärden för varje pollenkorn i experimentserien.
Namnet på det här mätalternativet är programvaruberoende, till exempel "Roterad ellips" eller "5-punkts ellips". - Upprepa steg 3.1–3.2 för alla andra pollenkorn som ska mätas. För konsekvens, använd samma grad av digital zoom och samma metod för att definiera "pollengränsen" för alla mätningar i datauppsättningarna.
- När alla mätningar har slutförts för en tidsserie exporterar du de råa halvdelsaxelvärdena för varje bildstapel till ett kalkylblad och presenterar data i kolumner per bildstapel. Se till att data från minst 15 hydratiserade pollenkorn inkluderas i analysen för varje växtlinje (kompletterande tabell S1).
- Det är inte ovanligt att ett litet antal pollenkorn misslyckas med att hydrera eller hydrera betydligt långsammare än förväntat. Dessa "dud" korn kan vara resultatet av dålig kontakt mellan kornet och papillcellen eller relaterade till pollenlivskraften. Leta efter och exkludera dessa från datauppsättningen om de inte krävs i experimentell design.
- Beräkna medelvärdena för varje tidpunkt per växtlinje. Använd oparade t-tester och envägs ANOVA för statistisk analys av vätskedata från WT och mutantlinjer vid varje tidpunkt. Använd ett multipelt t-test för samtidig jämförelse av medelvärdena mellan WT och mutantlinjer över flera tidpunkter.
OBS: XY-diagram är också mycket användbara för att visualisera den övergripande trenden med pollenhydrering mellan växtlinjerna som jämförs.
(1)
Figur 6: WT pollenkorn hydratisering på en stigmatisk papillcell av A. thaliana (Col-0; pA9-barnas hansteril linje). (A) Tidpunkt noll, 0 (0 KARTA) och (B) 10 KARTA. Den röda cirkeln runt pollenkornet är "pollengränsen" definierad och ritad av operatören med hjälp av bildanalysprogramvara. De gröna och mörkröda linjerna inuti pollen representerar semi-major respektive semi-minor axlar. Längden på den semi-minor-axeln används för att beräkna graden av pollenhydrering. En fullständig tidsserie av detta dataset finns i kompletterande figur S1. Bilden togs med ett 20x objektivobjektiv (2,1 mm arbetsavstånd; 0,5 numerisk bländare). Skalstänger = 50 μm. Förkortning: MAP = min-efter-pollinering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
I detta avsnitt presenteras två uppsättningar exempel på pollenhydreringsdata, insamlade enligt beskrivningen ovan, för A. thaliana. Den första uppsättningen data består av tre replikat av en pollenhydreringstidsserie för WT-växter, där varje replikat samlas in på en annan dag. Varje replikat innehåller inte mindre än 18 individuella pollenkornvärden, totalt 55 pollenkorn över alla tre replikaten. Minimi- och maximivärdena för medelvärdet mellan replikaten, för alla tidpunkter, låg inom 3 % (figur 7 och kompletterande tabell S1). Dessa representativa data för WT-pollineringar visar tydligt den höga grad av konsistens som kan erhållas med hjälp av den metod som beskrivs här för relativt låga provnummer och över olika dagar.
Figur 7: XY-diagram som visar konsistensen av pollenhydratiseringsprofilerna av vildtyp av A. thaliana under en tidsperiod på 10 minuter. Pollenföräldern var Col-0-anslutningen av A. thaliana och pistillföräldern var pA9-barnase-hansteril A. thaliana (Col-0) -linjen . Data representerar tre oberoende dataset som samlats in på olika dagar och visar en hög grad av konsekvens. Ett låd- och morrhårsdiagram och statistisk analys av medelvärdena för dessa dataset presenteras i kompletterande figur S2. Antalet uppmätta pollen ('n') för varje oberoende dataset visas bredvid syntaxen (WT1/WT2/WT3) i figuren. Förkortning: WT = vild typ. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Den andra uppsättningen data erhölls för en växtlinje som innehåller en T-DNA-insättning i en pollenbeläggningsproteinkodande gen som genererar en "knockdown" -mutation, här kallad "KD-mutant". Mutant pollen deponerades på pA9-barnas manliga sterila stigmas för hydreringsprofilering, som beskrivs i protokollet. Som framgår av de resulterande uppgifterna (figur 8) hade mutant och WT-pollen oskiljbara hydratiseringsprofiler under de första 5 minuterna. Men 5-10 minuter efter pollinering (MAP) började den genomsnittliga halv-mindre axelförändringen för mutant pollen falla bakom WT-pollen, med skillnaden som blev statistiskt signifikant vid 10 MAP. Detta resultat visar inte bara att detta pollenbeläggningsprotein har en roll i att förmedla pollenhydrering, utan illustrerar också snyggt nyttan av denna högupplösta, enkorniga bioanalys för att spåra pollenhydrering. I det här exemplet kunde dess känslighet upptäcka den subtila effekten av en "knockdown" av en pollenbeläggningsproteinkodande gen.
Figur 8: Pollenhydratiseringsprofiler för WT och en "knockdown" pollenbeläggningsproteinmutantlinje (KD-mutant). (A) Hydratiseringsprofiler under en 10 minuters tidsperiod för WT och muterat pollen. Pollenföräldrarna var Col-0-anslutningen av A. thaliana och pollenbeläggningsproteinet KD-mutant (även i Col-0-bakgrunden). I båda fallen var pistillföräldern pA9-barnase-hansteril A. thaliana (Col-0) -linjen. (B) Box- och whiskerdiagram som visar pollenhydreringens omfattning (uttryckt i procentuell förändring av halvminoraxeln) vid 5 MAP och 10 MAP för WT- och mutantpollendataset. Morrhår representerar provets minimi- och maximivärden. Rutorna visar datauppsättningens nedre kvartil, median och övre kvartil. Vita kors representerar medelvärdet av datauppsättningen. Oparad t-testanalys visar att den genomsnittliga procentandelen pollenhydrering skiljer sig signifikant mellan de två växtlinjerna vid 10 MAP. En asterisk anger p < 0,05 (oparad t-test). Förkortningar: WT = vild typ; KD = knockdown; MAP = min-efter-pollinering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: En beskuren pollenhydreringsbioassay tidsserie för ett WT-pollenkorn som hydrerar på en stigmatisk papillcell hos en pA9-barnassteril hansteril växt under 10 minuter. Bilder togs med 1 min intervall. Bilderna på 0 MAP och 10 MAP användes i figur 6 (separat bifogad). Skalstapel = 50 μm. Förkortningar: WT = vild typ; MAP = min-efter-pollinering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Box och whisker-diagram som visar pollenhydratiseringens omfattning (i procentuell förändring av halv-minor-axeln) under en 10-minutersperiod för de tre WT-pollendataset som beskrivs i figur 7. Pistillföräldern var pA9-barnase-hansteril A. thaliana (Col-0) linje. Morrhår representerar provets minimi- och maximivärden. Rutorna visar datauppsättningens nedre kvartil (nedre gångjärn), median (mellersta gångjärn) och övre kvartil (övre gångjärn). Enskilda datapunkter visas. Envägs ANOVA visar att den genomsnittliga procentandelen pollenhydreringsvärden mellan de tre dataseten inte var statistiskt signifikant olika från varandra under 10-minutersperioden. Det signifikanta tröskelvärdet är p < 0,05 (enkelriktad ANOVA). Förkortning: WT = vild typ. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S1: Rå pollenhydreringsdata som används för att konstruera figur 7 (A. thaliana WT Col-0 pollen på pA9-barnas manlig steril stigma). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video S1: En video som visar överföringen av ett enda WT (Col-0-anslutning) pollenkorn på spetsen av ett par pincett till en "jungfrulig" stigmatisk papillcell (pA9-barnas manlig steril linje). För att underlätta videons tillgänglighet sänktes bildkvaliteten avsiktligt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video S2: En video som visar överföringen av en enda WT (Col-0-anslutning) pollen från ett monolager pollenkorn vid spetsen av ett par pincett till en "jungfrulig" stigmatisk papillcell (pA9-barnas manlig steril linje). För att underlätta videons tillgänglighet sänktes bildkvaliteten avsiktligt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
För blommande växter är de mycket tidiga stadierna av sexuell reproduktion utan tvekan de viktigaste. På nivån av pollen-stigma-interaktionen fattas molekylära beslut som bestämmer "kompatibiliteten" hos de interagerande partnerna. Sådana beslut, om de fattas korrekt, undviker slöseri med resurser som kan påverka reproduktiv kondition21. Att endast tillåta kompatibel pollen att åstadkomma befruktning är således en viktig komponent för att upprätthålla väl anpassade genotyper, och därmed arternas evolutionära framgång. Forskning som utförts med modellväxten A. thaliana har varit oerhört värdefull för att fördjupa vår förståelse av denna process. Ett antal studier under de senaste decennierna har avslöjat förekomsten av faktorer i pollenbeläggningen som verkar vid den första kompatibilitetskontrollpunkten, där pollen får tillgång till stigmatiskt vatten för att tillåta pollenhydrering13. Trots dessa första insikter i mekanismerna som reglerar pollen-stigma kompatibilitet, finns det fortfarande många luckor i vår förståelse av denna process. Hittills kan inga mutanter av pollenburna ligander eller stigmatiska receptorer som är kända för att påverka pollenhydrering helt blockera kompatibel pollinering, vilket tyder på närvaron av andra oupptäckta pollenhydratiseringsdeterminanter. Genom att lätt kunna observera fenotypen av intresse är pollenhydreringsbioanalysen som beskrivs här en av de enklaste teknikerna för att studera potentiella mutanter som reglerar pollinering.
Befintliga metoder för att mäta pollenhydrering använder vanligtvis bulkpollineringar och rapporterar färre tidpunkter 14,22,23, och kan därför missa viktiga fenotyper med subtila hydratiseringsprofiler. Till exempel har studien av Wang et al.13, tillsammans med arbete på andra pollenbeläggningsproteinmutanter i vårt laboratorium (opublicerade observationer), avslöjat spännande skillnader i hydratiseringsprofiler mellan mutanter. Sådana subtila skillnader kan innehålla viktiga ledtrådar till de regleringsmekanismer som ligger till grund för kompatibel pollinering.
Metoden som beskrivs här fokuserar på förvärv av relativt små mätvärden mellan mutanta och WT-växtlinjer, med tonvikt på metodologisk precision för att minska variationen inom dataseten. Även om denna metod är mycket reproducerbar (som visas i figur 7), förutsatt att temperatur och luftfuktighet kontrolleras tillräckligt, är det viktigt att samla in hydratiseringsdata för nästan lika många WT och muterat pollen samma dag för att ytterligare minska risken för variation. Data kan sedan samlas över olika dagar om det behövs. Dessutom är det viktigt att välja lämpliga WT-kontrollanläggningar för korrekt tolkning av hydratiseringsresultaten. För pollenmottagaren bör samma växtlinje användas för att ta emot både WT-kontroll och muterade pollenkorn.
Till exempel använder vi pA9-barnas-hansterila växtlinjen, som också finns med i videoprotokollet, som pollenmottagare för både WT (kontroll) och mutant (experimentell) pollen när vi undersöker T-DNA-pollenmutantlinjer (såsom "KD" -mutanten som beskrivs i figur 8). Blandning av data från en sådan manlig steril linje, som inte behöver emasculeras, med den som samlas in från en manuellt emasculerad kontrolllinje bör undvikas eftersom dessa stigmas sannolikt kommer att bete sig annorlunda. På samma sätt bör emasculerade mutantlinjer användas tillsammans med en emasculerad WT (kontroll) linje när det är möjligt. Samma försiktighet bör också tillämpas när man överväger den genetiska bakgrunden hos de växter som studeras. Medan de mest populära T-DNA-mutantsamlingarna genererades i Col-0-bakgrunden, finns andra, såsom FLAG-samlingen från Institut national de la Recherche Agronomique (INRA), tillgängliga i Wassilewskija (WS) genetiska bakgrund24,25. I sådana fall är det lämpligt att använda respektive ekotyps WT-växtlinjer som kontroller.
Även om vi här har fokuserat på pollenhydrering under de första 10 minuterna av pollen-stigma-interaktionen, kan denna metod också anpassas för att omfatta hydratiseringsprofiler som täcker en längre tidsperiod. Ett viktigt inslag i protokollet är att blommor förblir fästa vid moderplantans nuvarande publicerade protokoll kräver vanligtvis excision av pistilen och placering i media för att upprätthålla vävnaden under experimentets varaktighet14,18,26. Även om det inte finns några direkta bevis som tyder på att en sådan semi in vivo-strategi påverkar pollenhydrering eller faktiskt förändrar in vivo-regleringen av denna process, är det tänkbart att excision av blommorna från moderplantan kan påverka pollinering. Således uppnår detta protokoll en sann in vivo-miljö för studier av pollen-stigma-interaktionen, där växtens strukturella integritet bevaras.
Överföringen av enstaka pollenkorn till "jungfruliga" stigmatiska papiller är utan tvekan en av de mest utmanande operationerna som beskrivs i detta protokoll. Det är inte ovanligt att överföra kluster av pollenkorn av misstag. Risken för att detta inträffar kan dock minskas kraftigt genom att säkerställa att endast ett monolager pollen finns på pincetten (figur 3A) (eller till och med bara ett enda pollenkorn; Figur 5), och/eller genom att använda pollenkorn som redan är orienterade, så att de "sticker ut" från andra på spetsen av pincetten. Vi har funnit att en erfaren operatör framgångsrikt kan slutföra överföringen av en enda pollen till en stigmatisk papillcell på cirka 3 minuter och registrera data för upp till fem pollenkorn under en 1-timmarsperiod. Under en period av 2-4 dagar kan således tillräckligt med data ackumuleras för meningsfull statistisk analys av de växtlinjer som studeras.
Mänskliga fel är potentiellt den största källan till variation i analysen av dataset som härrör från studier som använder detta protokoll. Till exempel kommer definitionen av "pollengränsen" under bildanalys ner till den enskilda forskarens bedömning. Det finns alltså en potential att mätningar gjorda av olika forskare, även på samma dataset, kan generera variation. När det är möjligt bör en enda forskare utföra mätningarna för att minimera provtagningsfel. Att koppla analysen av WT och mutanta dataset av samma operator förnekar dessutom den potentiellt subjektiva definitionen av "pollengränsen" och variationen mellan operatörer.
Sammanfattningsvis beskrivs en sofistikerad men ändå noggrann metod för att mäta pollenhydratiseringsprofiler i modellorganismen A. thaliana. Vi har visat att, genom att använda detta protokoll, mycket konsekventa pollenhydreringsdata för A. thaliana lätt kan förvärvas. Tre oberoende satser av data för WT-pollineringar som förvärvats på olika dagar visade konsekventa små avvikelser på <3% över alla tidpunkter (figur 7 och kompletterande tabell S1). Även om bioanalysen som presenteras här är något mer komplex än de flesta befintliga protokoll, är upplösningen av de genererade data överlägsen och lämplig för identifiering och karakterisering av nya mutanter som påverkar vägar som reglerar kompatibel pollinering.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av University of Bath (University of Bath, Bath, Storbritannien, BA2 7AY) forskarstipendier till Y.-L.L. och L.W. Figur 1 skapades med BioRender.com (https://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pA9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
| Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
| GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
| JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
| Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
| Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
| Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
| Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
| Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
| Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
| Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
| WT Col-0 plant line | uNASC | N70000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |
References
- Rieseberg, L. H., Willis, J. H.
- Hiscock, S. J., Allen, A. M. Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus. New Phytologist. 179 (2), 286-317 (2008).
- Kandasamy, M. K., Nasrallah, J. B., Nasrallah, M. E. Pollen pistil interactions and developmental regulation of pollen-tube growth in Arabidopsis. Development. 120 (12), 3405-3418 (1994).
- Bosch, M., Wang, L. Pollen-stigma interactions in Brassicaceae: complex communication events regulating pollen hydration. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2465-2468 (2020).
- Rozier, F., et al. Live-cell imaging of early events following pollen perception in self-incompatible Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2513-2526 (2020).
- Dickinson, H. Dry stigmas, water and self-incompatibility in Brassica. Sexual Plant Reproduction. 8, 1-10 (1995).
- Takasaki, T., et al. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma. Nature. 403 (6772), 913-916 (2000).
- Schopfer, C. R., Nasrallah, M. E., Nasrallah, J. B. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science. 286 (5445), 1697-1700 (1999).
- Takayama, S., et al. Direct ligand-receptor complex interaction controls Brassica self-incompatibility. Nature. 413 (6855), 534-538 (2001).
- Shiba, H., et al. A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specificity in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiology. 125 (4), 2095-2103 (2001).
- Broz, A. K., Bedinger, P. A. Pollen-pistil interactions as reproductive barriers. Annual Review of Plant Biology. 72 (1), 615-639 (2021).
- Cheung, A. Y., Duan, Q., Li, C., James Liu, M. -C., Wu, H. -M. Pollen-pistil interactions: It takes two to tangle but a molecular cast of many to deliver. Current Opinion in Plant Biology. 69, 102279 (2022).
- Wang, L. D., et al. PCP-B class pollen coat proteins are key regulators of the hydration checkpoint in Arabidopsis thaliana pollen-stigma interactions. New Phytologist. 213 (2), 764-777 (2017).
- Liu, C., et al. Pollen PCP-B peptides unlock a stigma peptide-receptor kinase gating mechanism for pollination. Science. 372 (6538), 171-175 (2021).
- Bordeleau, S. J., Sanchez, L. E. C., Goring, D. R. Finding new Arabidopsis receptor kinases that regulate compatible pollen-pistil interactions. Frontiers in Plant Science. 13, 1022684 (2022).
- Suwabe, K., et al. Double-locking mechanism of self-compatibility in Arabidopsis thaliana: the synergistic effect of transcriptional depression and disruption of coding region in the male specificity gene. Frontiers in Plant Science. 11, 576140 (2020).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Lee, H. K., Macgregor, S., Goring, D. R. A toolkit for teasing apart the early stages of pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. Pollen and Pollen Tube Biology. 2160, 13-28 (2020).
- Dilkes, B. P., et al. The maternally expressed WRKY transcription factor TTG2 controls lethality in interploidy crosses of Arabidopsis. PLoS Biology. 6 (12), 2707-2720 (2008).
- Riglet, L., et al. KATANIN-dependent mechanical properties of the stigmatic cell wall mediate the pollen tube path in Arabidopsis. eLife. 9, e57282 (2020).
- Zhou, L. Z., Dresselhaus, T. Friend or foe: Signaling mechanisms during double fertilization in flowering seed plants. Plant Development and Evolution. 131, 453-496 (2019).
- Gao, X. -Q., et al. The Arabidopsis KINβγ subunit of the SnRK1 complex regulates pollen hydration on the stigma by mediating the level of reactive oxygen species in pollen. PLoS Genetics. 12 (7), e1006228 (2016).
- Lee, H. K., Goring, D. R. Two subgroups of receptor-like kinases promote early compatible pollen responses in the Arabidopsis thaliana pistil. Journal of Experimental Botany. 72 (4), 1198-1211 (2021).
- O'Malley, R. C., Barragan, C. C., Ecker, J. R. A user's guide to the Arabidopsis T-DNA insertion mutant collections. Pollen and Pollen Tube Biology. 1284, 323-342 (2015).
- Samson, F., et al. FLAGdb++: a database for the functional analysis of the Arabidopsis genome. Nucleic Acids Research. 32, D347-D350 (2004).
- Doucet, J., et al. Investigations into a putative role for the novel BRASSIKIN pseudokinases in compatible pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 19 (1), 549 (2019).
