Summary
Arabidopsis thaliana에서 꽃가루 수화 프로필을 측정하는 개선된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 새로운 방법은 더 높은 분해능을 제공하고 비침습적이며 재현성이 높습니다. 이 프로토콜은 수분의 초기 단계를 조절하는 과정을 보다 세밀하게 해부하기 위한 새로운 도구를 나타냅니다.
Abstract
꽃 피는 식물에서의 유성 생식은 꽃가루 알갱이와 낙인 표면 사이의 초기 상호 작용을 필요로하며, 상호 작용하는 파트너간에 분자 대화가 이루어집니다. 다양한 종에 걸친 연구에 따르면 일련의 분자 체크포인트가 꽃가루-낙인 상호작용을 조절하여 호환 가능하고 일반적으로 종내 꽃가루만 수정에 성공할 수 있도록 합니다. 모델 식물 Arabidopsis thaliana와 같이 '건조한 낙인'을 가진 종에서 첫 번째 수분 후 접합 전 호환성 체크포인트는 꽃가루 수화의 확립입니다.
이 수분 단계는 엄격하게 조절되어 꽃가루 알갱이의 신호가 암술머리에서 물의 방출을 유도하여 꽃가루 수화를 허용합니다. 시간 경과에 따른 꽃가루 수화를 정확하게 측정하고 추적하는 능력은 번식에서 이 중요한 단계의 조절을 이해하기 위한 실험 설계의 핵심입니다. 발표된 프로토콜은 모식물에서 절제되고 액체 또는 고체 배지에서 유지되고 대량으로 수분된 꽃을 자주 사용합니다.
이 논문은 고해상도에서 개별 A. thaliana 꽃가루 알갱이의 분 단위 수분 추적을 허용하는 비침습적 생체 내 수분 생물학적 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 재현성이 높고 꽃가루 수화 프로파일의 매우 미묘한 변화를 감지할 수 있으므로 수분을 조절하는 경로에 영향을 미치는 돌연변이 분석에 적합합니다. 이 프로토콜은 대량 수분에 대해 설명된 것보다 길지만 생체 내 특성과 함께 제공하는 정밀도와 재현성으로 인해 수분 표현형의 상세한 해부에 이상적입니다.
Introduction
속씨식물에서 성공적인 유성 생식은 일반적으로 개체 내에서 또는 개체 사이에서(즉, 수분) 꽃밥에서 암술머리로 종내 꽃가루 알갱이의 이동에 의존합니다. 꽃가루 알갱이가 수용성 꽃으로 옮겨지는 것은 일반적으로 수분 매개자 또는 비 생물 적 요인에 의해 매개됩니다. 따라서 이것은 또한 자연 조건에서 이종 특이성 꽃가루의 침착을 자주 초래합니다. 몇 가지 예외를 제외하고, 이종 특이성 꽃가루에 의한 수분 진행은 진화적으로 불리하며, 짝짓기 기회를 잃음으로써 생식 적합성을 감소시키며, 그 결과 대부분의 잡종 자손은 적절하게 발달하지 못하거나 불임이 된다1. 따라서 메커니즘은 '호환되지 않는' 이종 특이성 꽃가루2에 의한 수분을 차단하도록 진화했습니다. 따라서 호환 가능한 꽃가루의 신속한 인식은 틀림없이 많은 꽃 피는 식물에서 유성 생식의 초기 단계에서 가장 중요한 과정입니다.
낙인이 '건조한' 유형인 Brassicaceae 계통에서는 일련의 분자 체크포인트가 수분을 조절하는 생식 과정의 여러 단계에서 작용하여 호환 가능한 꽃가루만 성공합니다. 수분 공급은 가장 중요한 체크포인트 중 하나이며(그림 1), 수분을 공급하지 못한 꽃가루는 꽃가루관을 생성하여 암컷 배우체에게 정자를 전달할 수 없습니다. 종종 호환되지 않는 곡물은 이 첫 번째 수분 체크포인트를 통과하지 못하여 낙인 찍힌 물에 접근할 수 없습니다3. 브라시카과(Brassicaceae)과에 속하는 꽃가루 인식은 빠르게 발생하며, 꽃가루 알갱이가 암술에 부착된 후 몇 분 이내에 적합성이 확립됩니다 4,5. 최근 몇 년 동안 많은 진전이 이루어졌으며 이제 주요 수분 체크포인트를 조절하는 분자 메커니즘을 이해하기 시작했습니다.
그림 1: 호환 가능한 수분 중 주요 이벤트의 개요. 꽃가루 수화 및 꽃가루 튜브 발아와 같은 이러한 단계는 호환 가능한 수분에 영향을 미치기 위해 성공적으로 탐색해야 하는 수분 '체크포인트'이기도 합니다. 이 도표는 '건조한' 유형의 낙인을 나타내며, 이는 Brassicaceae계통 2,20의 종에 전형적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
'자가' 꽃가루가 인식되고 거부되는 Brassica 자기 비호환성(SI) 시스템에 대한 선구적인 연구는 Brassicaceae 6,7,8,9,10에서 꽃가루 낙인 인식에 대한 패러다임을 확립했습니다. Brassica와 그 친척의 SI는 꽃가루 표면과 상호 작용 시 꽃가루 거부를 유발하는 낙인 모양의 원형질막에 존재하는 '인식' 단백질에 의해 매개됩니다. SI 꽃가루 거부는 기저 꽃가루-낙인 호환성 시스템의 파괴에 의해 작동하며, 이는 호환 가능한 꽃가루에 대한 인식에 의해 완전히 활성화될 때 낙인에 의한 표적 분비로 이어져 꽃가루 수화를 유도합니다(꽃가루 호환성 메커니즘에 대한 검토는11,12 참조). SI의 예에서 꽃가루 매개 리간드는 작은 시스테인이 풍부한 단백질인 S-유전자좌 시스테인이 풍부(SCR/SP11)이고 낙인 수용체는 S-유전자좌 수용체 키나아제(SRK)입니다.
최근, 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서는 작은 시스테인이 풍부한 꽃가루 매개 단백질의 또 다른 그룹인 꽃가루 코트 단백질 클래스 B(AtPCP-Bs)가 꽃가루 수화의 활성화를 통한 꽃가루 수용의 중요한 조절인자로 밝혀졌다13. AtPCP-B의 낙인 수용체 및 다운스트림 조절 경로의 측면도 최근에 설명되었습니다14,15. 흥미롭게도, 잠재적인 꽃가루 매개 및 꽃가루 수화의 낙인 신호 매개체(AtPCP-B 포함)를 암호화하는 유전자에 대한 돌연변이 연구는 꽃가루 수화 체크포인트에 대한 완전한 차단을 가진 식물을 생성하는 데 실패했습니다. 이것은 아직 발견되지 않은 여러 가지 다른 요인이 꽃가루 수화 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 강력하게 시사합니다. Wang et al.13이 처음 설명한 방법을 기반으로 여기에서 우리는 후보 돌연변이 A. thaliana 계통에서 미묘한 꽃가루 수화 결함을 식별하는 데 적합한 개선된 고해상도 생체 내 생물학적 분석을 설명합니다.
Protocol
1. 식물의 성장과 꽃의 준비
- A. thaliana 종자를 0.1 % 아가로스 또는 멸균 수에서 4 °C에서 3 일 동안 또는 -20 °C에서 16-24 시간 동안 건조 종자로 성화합니다 (uNASC, 개인 통신).
- 층화 된 씨앗을 퇴비 화분에 옮기고 환경 적으로 통제 된 성장 챔버에 넣습니다. 형광 튜브 (130 μmol m-2 s-1)에 의해 제공되는 16 : 8 h, 밝음 : 어두운 광주기로 식물을 전파합니다. 온도를 21 ± 2 °C, 상대 습도 약 40%로 유지합니다.
- 꽃가루 기증자와 수혜 식물이 다른 적절한 '통제' 식물 계통과 함께 함께 뿌려져 동시 개화를 보장하는지 확인하십시오. 꽃차례가 잘 확립 될 때까지 약 6 주 동안 식물을 전파하십시오.
- 거세에 대한 생물학적 분석을 수행하기 1일 전에 꽃가루 수용 식물에서12단계 꽃봉오리를 선택하십시오 16,17 - 이들은 다음 날 18일에 꽃이 열리고 꽃밥 열개를 완료하는 미개봉 꽃봉오리입니다.
참고: 주요 꽃차례에서 생산되는 처음 세 개의 꽃은 일반적으로 비정상적인 번식 행동을 나타내므로 피하십시오. 가능하고 연구에 적합한 경우 꽃밥이 성숙하지 못하는 A. thaliana (accession Col-0) pA9-barnase 계통과 같은 수컷 무균 식물 계통을 사용하십시오19. - 꽃가루 수령인의 꽃을 거세하려면 식물을 화분에 옆으로 눕히십시오. 거세될 꽃에 가까운 영역에 있는 식물 줄기를 입체 해부 현미경 아래에 있는 유리 슬라이드에 테이프로 붙입니다.
- 끝이 가는 집게를 사용하여 조심스럽게 꽃봉오리를 열고 꽃잎과 꽃밥을 모두 제거합니다. 암술이 손상되지 않았는지, 암술머리에 꽃가루를 오염시키지 않았는지 확인하십시오.
참고: 수컷 멸균 식물 라인은 거세가 필요하지 않습니다. - 식물을 성장실로 되돌리고 거세된 꽃이 다른 식물이나 이물질과 접촉하지 않도록 합니다.
2. 꽃가루 수화 분석 - 원시 데이터 수집
- 다음날 아침, 성장 챔버에서 식물을 제거하십시오. 꽃가루를 받는 식물을 옆으로 눕히고 꽃을 도립 현미경 무대에 놓아(그림 2) 암술머리를 명확하게 이미지화할 수 있도록 합니다.
- 마스킹 테이프 스트립을 사용하여 줄기를 유리 슬라이드에 고정하여 이미지화할 꽃의 위치를 고정합니다. 온도를 18 °C에서 25 °C 사이로 유지하고 상대 습도를 60% 미만으로 유지하십시오.
참고: pA9-barnase 수컷 무균 식물 계통의 경우 꽃이 열리고 꽃잎이 시야를 방해하지 않는 아침에 분석을 수행하는 것이 가장 좋습니다. - 다음으로, 꽃가루 기증자 식물에서 건강하고 갓 열린 꽃을 제거하십시오. 해부 현미경 아래에 놓고 꽃밥을 부드럽게 만져 끝이 가는 깨끗한 집게의 끝에 꽃가루 알갱이 몇 개를 모읍니다(그림 3A). 짧은 막대에 테이프로 붙인 속눈썹은 꽃가루를 수집하고 옮기는 데 효과적인 도구이기도 합니다(그림 3C).
- 집게의 끝에 꽃가루 알갱이의 단층이 형성 될 때까지 꽃가루 알갱이가 수확 된 꽃잎에 가볍게 닿아 집게에서 과도한 꽃가루를 제거합니다.
알림: 끝이 가는 집게의 끝에 있는 꽃가루 알갱이의 단층은 후속 단계에서 단일 알갱이 이동을 크게 촉진합니다. 이 기술로 집게에서 하나의 꽃가루 알갱이를 얻을 수도 있습니다(보충 비디오 S1). - 꽃가루 수용 식물로 돌아가서, 저전력 대물렌즈(예를 들어, 10x 대물렌즈; 그림 3B), 도립 현미경을 수분될 암술머리에 초점을 맞춥니다.
- 집게의 팔 사이의 구멍을 따라 집게를 잡고 (그림 4) 수분되지 않은 ( '처녀') 낙인 유두 세포에 조심스럽게 접근합니다.
알림: 우리는 집게를 잡는 이 방법이 손재주를 돕고 악수의 영향을 줄이는 것을 발견했습니다. 마이크로 매니퓰레이터는 경험이 적거나 단일 꽃가루 알갱이를 손으로 정밀하게 적용하는 데 어려움이 있는 사용자에게 사용할 수 있습니다. - 암술머리로 옮기기 위해 집게에 적절하게 배치 된 꽃가루 알갱이를 선택하십시오. 선택된 꽃가루 알갱이가 표면에 가볍게 닿을 때까지 수분되지 않은 낙인 유두 세포에 계속 접근하십시오. 집게를 천천히 빼내고 꽃가루 부착을 확인합니다(그림 5).
참고: 보충 비디오 S1 및 보충 비디오 S2는 집게에 단일 및 다중 꽃가루 알갱이가 모두 있는 이 단계를 보여줍니다. - 꽃가루 알갱이가 적도 축이 명확하게 보이고 초점이 선명하게 맞춰지도록 방향을 잡았는지 확인하십시오. 즉시 고출력 대물 렌즈(예: 20x)로 전환하고 꽃가루 알갱이의 이미지를 캡처합니다. 이 첫 번째 이미지는 T = 0입니다. 총 10분 동안 1분 간격으로 추가 이미지를 계속 캡처합니다.
- 꽃가루 알갱이 또는 암술머리의 작은 움직임을 수용하기 위해 필요에 따라 초점을 조정하십시오. 2분마다 실내 온도와 상대 습도를 기록하여 향후 실험 반복실험 간의 비교를 가능하게 합니다.
- 모든 이미지가 캡처되면 제조업체의 독점 형식 또는 TIFF와 같은 무손실 형식으로 저장합니다.
참고: 샘플링된 꽃가루 알갱이당 11개의 이미지가 있습니다(보충 그림 S1). 대부분의 독점 이미지 획득 소프트웨어의 자동/수동 타임랩스 획득 설정은 각 시계열의 구성을 용이하게 하는 유용한 기능입니다. - 추가 꽃가루 알갱이에 대해 2.4-2.9단계를 반복합니다. 거의 동일한 수의 대조군(야생형[WT]) 및 실험 수분에 대한 데이터를 수집합니다.
그림 2: 꽃가루 수화 생물학적 분석에 사용된 장비 설정. 이 예에서, pA9-barnase 수컷 무균 식물 계통이 꽃가루 수용자였다. 화분 안에 있는 식물을 옆으로 눕히고 줄기를 현미경 무대에 있는 유리 슬라이드에 테이프로 붙였습니다. 기계적 응력을 줄이고 플랜트의 위치 지정을 돕기 위해 조정 가능한 플랫폼이 화분을 지지하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 꽃가루 기증자 꽃에서 꽃가루 알갱이 수집. 이미지는 (A) 끝이 가는 집게와 (C) 속눈썹 조각을 사용하는 것을 보여줍니다. 꽃가루 덩어리 (빨간색 화살표)는 꽃가루 알갱이의 단층이 얻어 질 때까지 기증자 꽃의 꽃잎에 가볍게 닿아 제거해야합니다 (녹색 화살표). (B) 꽃가루 수화 생물학적 분석을 위한 적절한 발달 단계에 도달한 수분되지 않은 A. thaliana(Col-0) pA9-barnase 수컷 무균 계통 낙인의 고해상도 이미지. 스케일 바 = 100 μm (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 꽃가루를 수혜자 낙인으로 옮길 때 집게를 잡는 방법. (A) 집게를 잡기 위한 잘못된 방향; (B) 집게를 잡기 위한 올바른 방향. 이 구성에서 겸자를 옆으로 잡으면 집게의 팔 사이에 있는 엄지손가락의 위치에서 알 수 있듯이 꽃가루 알갱이가 수분되지 않은 낙인 유두로 쉽게 이동할 수 있도록 더 큰 안정성을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 한 쌍의 집게의 끝에서 pA9-barnase 수컷 불임 식물의 수분되지 않은('처녀') 낙인 유두 세포로 단일 꽃가루 알갱이의 이동. (A) 유두 세포에 조심스럽게 접근합니다. (B) 적절하게 배치된 꽃가루 알갱이(파란색 화살표)를 유두 세포(주황색 화살표)에 부착합니다. (C) 겸자 배출 및 꽃가루 부착의 시각적 확인(보라색 화살표). 패널 A-C는 10x 대물 렌즈(작동 거리 10.5mm, 개구 0.25개)로 이미지화되었으며 보충 비디오 S1에 제공된 비디오 클립에서 파생된 스냅샷입니다. (D) 시계열에서 이미지 캡처를 시작하기 위해 20x 대물 렌즈(작동 거리 2.1mm, 개구 0.5개)로 전환합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 꽃가루 수화 분석 측정
- 꽃가루 수화 속도를 시간 경과에 따른 꽃가루 알갱이(즉, 적도 반경)의 반단축(그림 6)의 길이 변화로 정의하고 백분율 변화(방정식 [1])로 제시합니다.
(1개) - 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 실험 시리즈의 각 꽃가루 알갱이에 대한 반단축 값을 기록합니다.
참고: 이 측정 옵션의 이름은 '회전된 타원' 또는 '5점 타원'과 같이 소프트웨어에 따라 다릅니다. - 측정할 다른 모든 꽃가루 알갱이에 대해 3.1-3.2단계를 반복합니다. 일관성을 위해 데이터 세트의 모든 측정에 대해 '꽃가루 경계'를 정의하는 데 동일한 수준의 디지털 확대/축소와 동일한 접근 방식을 적용합니다.
- 시계열에 대한 모든 측정이 완료되면 각 이미지 스택의 원시 반부 축 값을 스프레드시트로 내보내고 이미지 스택당 열에 데이터를 표시합니다. 각 식물 계통에 대한 분석에 최소 15개의 수화된 꽃가루 알갱이의 데이터가 포함되어 있는지 확인합니다(보충 표 S1).
- 소수의 꽃가루 알갱이가 예상보다 훨씬 더 천천히 수분을 공급하거나 수분을 공급하지 못하는 것은 드문 일이 아닙니다. 이러한 '더드' 곡물은 곡물과 유두 세포 사이의 접촉 불량의 결과이거나 꽃가루 생존력과 관련이 있을 수 있습니다. 실험 설계에 필요한 경우가 아니면 데이터 세트에서 이러한 항목을 찾아 제외합니다.
- 플랜트 라인당 각 시점에 대한 평균값을 계산합니다. 각 시점에서 WT 및 돌연변이 라인의 수화 데이터에 대한 통계 분석을 위해 unpaired t-검정 및 일원 ANOVA를 사용합니다. 여러 시점에서 WT와 돌연변이 라인 사이의 평균을 동시에 비교하기 위해 다중 t-검정을 사용합니다.
참고: XY 플롯은 비교되는 식물 계통 간의 꽃가루 수화의 전반적인 추세를 시각화하는 데에도 매우 유용합니다.
(1개)
그림 6: A. thaliana (Col-0; pA9-barnase 수컷 멸균 라인의 낙인 유두 세포에서 수화되는 WT 꽃가루 입자. (A) 시점 0, 0(0 MAP) 및 (B) 10 MAP. 꽃가루 알갱이 주위의 빨간색 원은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 작업자가 정의하고 그린 "꽃가루 경계"입니다. 꽃가루 내부의 녹색과 짙은 빨간색 선은 각각 반장축과 반단축을 나타냅니다. 반 마이너 축의 길이는 꽃가루 수화 정도를 계산하는 데 사용됩니다. 이 데이터 세트의 전체 시계열은 보충 그림 S1에서 찾을 수 있습니다. 이미지는 20x 대물 렌즈(작동 거리 2.1mm, 개구 0.5개)로 촬영되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: MAP = 수분 후 분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
이 섹션에서는 A. thaliana에 대해 위에서 설명한 대로 수집된 두 세트의 꽃가루 수화 데이터 세트를 제공합니다. 첫 번째 데이터 세트는 WT 식물에 대한 꽃가루 수화 시계열의 세 가지 반복으로 구성되며 각 복제는 다른 날에 수집됩니다. 각 복제물에는 18개 이상의 개별 꽃가루 알갱이 값이 포함되어 있으며, 세 번의 반복물 모두에서 총 55개의 꽃가루 알갱이가 있습니다. 모든 시점에 대한 반복실험 간 평균의 최소값과 최대값은 3% 이내였습니다(그림 7 및 보충 표 S1). WT 수분에 대한 이러한 대표 데이터는 상대적으로 낮은 샘플 수와 다른 날짜에 대해 여기에 설명된 방법론을 사용하여 얻을 수 있는 높은 수준의 일관성을 명확하게 보여줍니다.
그림 7: 10분 동안 A. thaliana 야생형 꽃가루 수화 프로필의 일관성을 보여주는 XY 플롯. 꽃가루 부모는 A. thaliana 의 Col-0 가입이었고 암술 부모는 pA9-barnase 수컷 불임 A. thaliana (Col-0) 계통이었습니다. 데이터는 서로 다른 날짜에 수집된 세 개의 독립적인 데이터 세트를 나타내며 높은 수준의 일관성을 보여줍니다. 상자 및 수염 다이어그램 및 이러한 데이터 세트에 대한 평균의 통계 분석은 보충 그림 S2에 나와 있습니다. 각 독립 데이터 세트에 대해 측정된 꽃가루 수('n')는 그림의 구문(WT1/WT2/WT3) 옆에 표시됩니다. 약어: WT = 야생형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
두 번째 데이터 세트는 '녹다운' 돌연변이를 생성하는 꽃가루 코트 단백질 인코딩 유전자에 T-DNA 삽입을 포함하는 식물 계통에 대해 얻어졌으며, 여기서는 'KD 돌연변이'로 지칭됩니다. 돌연변이 꽃가루는 프로토콜에 설명된 대로 수화 프로파일링을 위해 pA9-barnase 수컷 불임 암술머리에 침착되었습니다. 결과 데이터(그림 8)에서 볼 수 있듯이 돌연변이 꽃가루와 WT 꽃가루는 처음 5분 동안 구별할 수 없는 수화 프로필을 가졌습니다. 그러나 수분(MAP) 후 5-10분이 지나면 돌연변이 꽃가루의 평균 반소축 변화가 WT 꽃가루의 평균 반소축 변화보다 뒤처지기 시작했으며 그 차이는 10 MAP에서 통계적으로 유의해졌습니다. 이 결과는 이 꽃가루 코트 단백질이 꽃가루 수화를 매개하는 역할을 한다는 것을 보여줄 뿐만 아니라 꽃가루 수화를 추적하기 위한 이 고해상도 단일 곡물 생물학적 분석의 유용성을 잘 보여줍니다. 이 특별한 예에서, 그 민감도는 꽃가루 코트 단백질 코딩 유전자의 '녹다운'의 미묘한 효과를 감지 할 수있었습니다.
그림 8: WT 및 '녹다운' 꽃가루 코트 단백질 돌연변이 라인(KD 돌연변이)에 대한 꽃가루 수화 프로필. (A) WT 및 돌연변이 꽃가루에 대한 10분 동안의 수화 프로필. 꽃가루 부모는 A. thaliana의 Col-0 가입과 꽃가루 코트 단백질 KD 돌연변이(Col-0 배경에도 있음)였습니다. 두 경우 모두, 암술 부모는 pA9-barnase 수컷 불임 A. thaliana (Col-0) 계통이었다. (B) WT 및 돌연변이 꽃가루 데이터 세트에 대해 5 MAP 및 10 MAP에서 꽃가루 수화 정도(반부 축의 백분율 변화 측면에서)를 보여주는 상자 및 수염 플롯. 수염은 샘플 최소값과 최대값을 나타냅니다. 상자는 데이터 세트의 하위 사분위수, 중앙값 및 상위 사분위수를 나타냅니다. 흰색 십자 표시는 데이터 세트의 평균을 나타냅니다. 짝을 이루지 않은 t-검정 분석은 10 MAP에서 두 식물 계통 간에 꽃가루 수화의 평균 비율이 유의하게 다르다는 것을 보여줍니다. 하나의 별표는 p < 0.05(unpaired t-검정)를 나타냅니다. 약어: WT = 야생형; KD = 넉다운; MAP = 수분 후 분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 10분 동안 pA9-barnase 수컷 불임 식물의 낙인 유두 세포에서 수화되는 WT 꽃가루 알갱이의 자른 꽃가루 수화 생물학적 분석 시계열. 이미지는 1분 간격으로 촬영되었습니다. 0 MAP 및 10 MAP에서의 이미지는 그림 6 (별도 첨부)에 사용되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: WT = 야생형; MAP = 수분 후 분. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 그림 7에 설명된 3개의 WT 꽃가루 데이터 세트에 대해 10분 동안 꽃가루 수화 정도(반부 축의 백분율 변화 측면에서)를 보여주는 상자 및 수염 플롯. 암술 부모는 pA9-barnase 수컷 불임 A. thaliana (Col-0) 계통이었다. 수염은 샘플 최소값과 최대값을 나타냅니다. 상자는 데이터 세트의 하위 사분위수(하위 힌지), 중앙값(중간 힌지) 및 상위 사분위수(상위 힌지)를 나타냅니다. 개별 데이터 포인트가 표시됩니다. 일원 분산 분석은 세 데이터 세트 간의 꽃가루 수화 값의 평균 백분율이 10분 동안 서로 통계적으로 유의미하게 다르지 않았음을 보여줍니다. 유의한 임계값은 p < 0.05(일원 분산 분석)입니다. 약어: WT = 야생형. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충표 S1: 도 7 을 구성하기 위해 사용된 원시 꽃가루 수화 데이터(A. thaliana WT Col-0 pollen on pA9-barnase male sterile stigma). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S1: 한 쌍의 집게 끝에 있는 단일 WT(Col-0 가입) 꽃가루 알갱이가 '처녀' 낙인 유두 세포(pA9-barnase 수컷 무균 라인)로 이동하는 것을 보여주는 비디오. 비디오의 접근성을 용이하게 하기 위해 이미지 품질을 의도적으로 낮췄습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S2: 한 쌍의 집게 끝에 있는 꽃가루 알갱이의 단층에서 단일 WT(Col-0 accession) 꽃가루가 '처녀' 낙인 유두 세포(pA9-barnase male sterile line)로 이동하는 것을 보여주는 비디오입니다. 비디오의 접근성을 용이하게 하기 위해 이미지 품질을 의도적으로 낮췄습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
꽃 피는 식물의 경우 유성 생식의 초기 단계가 틀림없이 가장 중요합니다. 꽃가루-낙인 상호 작용 수준에서 상호 작용하는 파트너의 '호환성'을 결정하는 분자 결정이 내려집니다. 이러한 결정이 올바르게 내려진다면 생식 적합성에 영향을 미칠 수 있는 자원의 낭비를 피할 수 있다21. 따라서 호환 가능한 꽃가루만 수정에 영향을 미치도록 허용하는 것은 잘 적응된 유전자형을 유지하고 따라서 종의 진화적 성공을 유지하는 데 중요한 요소 중 하나입니다. 모델 식물 A. thaliana 로 수행된 연구는 이 과정에 대한 우리의 이해를 심화시키는 데 매우 가치가 있습니다. 지난 수십 년 동안 많은 연구에서 꽃가루가 낙인 같은 물에 접근하여 꽃가루 수분 공급을 허용하는 첫 번째 적합성 '체크포인트'에서 작용하는 인자가 꽃가루 코트에 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다13. 꽃가루-낙인 적합성을 조절하는 메커니즘에 대한 이러한 첫 번째 통찰력에도 불구하고 이 과정에 대한 우리의 이해에는 여전히 많은 격차가 있습니다. 현재까지 꽃가루 매개 리간드 또는 꽃가루 수화에 영향을 미치는 것으로 알려진 낙인 수용체의 돌연변이는 호환 가능한 수분을 완전히 차단할 수 없으며, 이는 발견되지 않은 다른 꽃가루 수화 결정 요인의 존재를 시사합니다. 관심 표현형을 쉽게 관찰할 수 있기 때문에 여기에 설명된 꽃가루 수화 생물학적 분석은 수분을 조절하는 잠재적인 돌연변이를 연구하는 가장 간단한 기술 중 하나입니다.
꽃가루 수화를 측정하기 위한 기존의 방법론은 일반적으로 대량 수분을 활용하고 더 적은 시점을 보고하므로 14,22,23 중요하고 미묘한 수화 프로필 표현형을 놓칠 수 있습니다. 예를 들어, Wang et al.13의 연구는 우리 실험실의 다른 꽃가루 코트 단백질 돌연변이에 대한 연구(미공개 관찰)와 함께 돌연변이 간의 수화 프로파일에 흥미로운 차이를 보여주었습니다. 이러한 미묘한 차이는 호환 가능한 수분의 기초가되는 조절 메커니즘에 대한 중요한 단서를 보유 할 수 있습니다.
여기에 설명된 방법은 데이터 세트 내의 변동을 줄이기 위한 방법론적 정밀도에 중점을 두고 돌연변이와 WT 플랜트 라인 간에 상대적으로 적은 수의 측정값을 획득하는 데 중점을 둡니다. 이 방법은 재현성이 높지만( 그림 7 참조) 온도와 습도가 적절하게 제어된다고 가정할 때 변동 가능성을 더욱 줄이기 위해 같은 날 거의 동일한 수의 WT 및 돌연변이 꽃가루에 대한 수화 데이터를 수집하는 것이 중요합니다. 그런 다음 필요한 경우 여러 날짜에 걸쳐 데이터를 풀링할 수 있습니다. 또한 적절한 WT 제어 플랜트를 선택하는 것은 수화 결과의 정확한 해석을 위해 매우 중요합니다. 꽃가루 수용자의 경우 WT 대조군과 돌연변이 꽃가루 알갱이를 모두 수용하는 데 동일한 식물 계통을 사용해야 합니다.
예를 들어, T-DNA 꽃가루 돌연변이 계통(예: 그림 8에 설명된 'KD' 돌연변이)을 조사할 때 WT(대조군) 및 돌연변이(실험) 꽃가루 모두에 대한 꽃가루 수용자로 비디오 프로토콜에도 등장하는 pA9-barnase 수컷 무균 식물 계통을 사용합니다. 거세할 필요가 없는 이러한 남성 무균 라인의 데이터와 수동으로 거세된 제어 라인에서 수집된 데이터의 혼합은 이러한 낙인이 다르게 행동할 가능성이 높기 때문에 피해야 합니다. 마찬가지로, 거세된 돌연변이 라인은 가능하면 거세된 WT(대조군) 라인과 함께 사용해야 합니다. 연구 중인 식물의 유전적 배경을 고려할 때도 동일한 주의를 기울여야 합니다. 가장 인기 있는 T-DNA 돌연변이 컬렉션은 Col-0 배경에서 생성되었지만, INRA(Institut national de la Recherche Agronomique )의 FLAG 컬렉션과 같은 다른 컬렉션은 Wassilewskija(WS) 유전적 배경24,25에서 사용할 수 있습니다. 이러한 경우 해당 에코타입의 WT 플랜트 라인을 대조군으로 사용하는 것이 좋습니다.
여기에서는 꽃가루-낙인 상호 작용의 처음 10분 동안 꽃가루 수화에 초점을 맞추었지만 이 방법은 더 긴 기간을 포괄하는 수화 프로필을 포함하도록 조정할 수도 있습니다. 프로토콜의 주요 특징은 꽃이 부모 식물에 부착된 상태로 남아 있다는 것입니다.-현재 발표된 프로토콜은 일반적으로 실험 기간 동안 조직을 유지하기 위해 암술의 절제와 배지 배치를 필요로 한다14,18,26. 이러한 반 생체 내 접근 방식이 꽃가루 수화에 영향을 미치거나 실제로이 과정의 생체 내 조절을 변경한다는 직접적인 증거는 없지만 모 식물에서 꽃을 절제하면 수분에 영향을 미칠 수 있다고 생각할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 식물의 구조적 무결성이 보존되는 꽃가루-낙인 상호 작용 연구를 위한 진정한 생체 내 환경을 달성합니다.
단일 꽃가루 알갱이를 '처녀' 낙인 유두로 옮기는 것은 틀림없이 이 프로토콜에 설명된 가장 어려운 작업 중 하나입니다. 꽃가루 알갱이의 클러스터를 잘못 옮기는 것은 드문 일이 아닙니다. 그러나 이러한 발생 가능성은 집게에 꽃가루의 단층만 존재하도록 함으로써 크게 줄일 수 있습니다(그림 3A)(또는 단일 꽃가루 알갱이; 그림 5) 및/또는 이미 배향된 꽃가루 알갱이를 활용하여 집게 끝에서 다른 사람들로부터 '돌출'되도록 합니다. 숙련된 작업자가 약 3분 만에 단일 꽃가루를 낙인이 있는 유두 세포로 성공적으로 옮기고 1시간 동안 최대 5개의 꽃가루 알갱이에 대한 데이터를 기록할 수 있음을 발견했습니다. 따라서 2-4일 동안 연구 중인 플랜트 라인의 의미 있는 통계 분석을 위해 충분한 데이터를 축적할 수 있습니다.
인적 오류는 잠재적으로 이 프로토콜을 사용하는 연구에서 파생된 데이터 세트 분석에서 가장 큰 변동 원인입니다. 예를 들어, 이미지 분석 중 '꽃가루 경계'의 정의는 개별 연구자의 판단에 달려 있습니다. 따라서 동일한 데이터 세트에서도 서로 다른 연구자가 측정한 측정값이 변동을 생성할 가능성이 있습니다. 가능하면 한 명의 연구원이 샘플링 오류를 최소화하기 위해 측정을 수행해야 합니다. 또한 동일한 연산자에 의한 WT 및 돌연변이 데이터 세트의 분석을 결합하면 '꽃가루 경계' 및 연산자 간 변동에 대한 잠재적으로 주관적인 정의가 무효화됩니다.
결론적으로, 모델 유기체 A. thaliana 에서 꽃가루 수화 프로필을 측정하는 정교하면서도 정확한 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 이 프로토콜을 활용하여 A. thaliana 에 대한 매우 일관된 꽃가루 수화 데이터를 쉽게 얻을 수 있음을 입증했습니다. 서로 다른 날에 획득한 WT 수분에 대한 3개의 독립적인 데이터 배치는 모든 시점에서 <3%의 일관된 작은 편차를 보여주었습니다(그림 7 및 보충 표 S1). 여기에 제시된 생물학적 분석은 대부분의 기존 프로토콜보다 약간 더 복잡하지만 생성된 데이터의 분해능이 우수하고 호환 가능한 수분을 조절하는 경로에 영향을 미치는 새로운 돌연변이의 식별 및 특성화에 적합합니다.
Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 University of Bath(University of Bath, Bath, UK, BA2 7AY)의 대학원 장학금으로 Y.-L.L.에 지원되었습니다. LW 그림 1 은 BioRender.com (https://biorender.com/)로 작성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pA9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
| Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
| GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
| JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
| Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
| Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
| Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
| Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
| Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
| Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
| Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
| WT Col-0 plant line | uNASC | N70000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |
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