Summary
En forbedret metode for å måle pollenhydreringsprofiler i Arabidopsis thaliana er beskrevet her. Den nye metoden gir høyere oppløsning, er ikke-invasiv og er svært reproduserbar. Protokollen representerer et nytt verktøy for en finere disseksjon av prosessene som regulerer de tidlige stadiene av pollinering.
Abstract
Seksuell reproduksjon i blomstrende planter krever innledende interaksjon mellom pollenkornet og den stigmatiske overflaten, hvor en molekylær dialog etableres mellom de samvirkende partnerne. Studier på tvers av en rekke arter har vist at en rekke molekylære kontrollpunkter regulerer pollen-stigma-interaksjonen for å sikre at bare kompatible, generelt intraspesifikke pollen lykkes med å utføre befruktning. Hos arter som har et "tørt stigma", som modellplanten Arabidopsis thaliana, er det første kontrollpunktet etter pollinering, prezygotisk kompatibilitet etablering av pollenhydrering.
Denne fasen av pollinering er tett regulert, hvorved signaler fra pollenkornet fremkaller utslipp av vann fra stigmaet, og dermed tillater pollenhydrering. Evnen til nøyaktig måling og sporing av pollenhydrering over tid er nøkkelen til utformingen av eksperimenter rettet mot å forstå reguleringen av dette kritiske trinnet i reproduksjon. Publiserte protokoller bruker ofte blomster som er skåret ut fra foreldreplanten, vedlikeholdt på flytende eller faste medier, og bulkpollinert.
Dette papiret beskriver en ikke-invasiv, in vivo pollineringsbioassay som tillater minutt-for-minutt hydreringssporing av individuelle A. thaliana pollenkorn i høy oppløsning. Analysen er svært reproduserbar, i stand til å oppdage svært subtile variasjoner av pollenhydreringsprofiler, og er dermed egnet for analyse av mutanter som påvirker veier som regulerer pollinering. Selv om protokollen er lengre enn de som er beskrevet for bulkpollineringer, gjør presisjonen og reproduserbarheten den gir, sammen med dens in vivo natur, den ideell for detaljert disseksjon av pollineringsfenotyper.
Introduction
Vellykket seksuell reproduksjon i angiospermer er vanligvis avhengig av overføring av intraspesifikke pollenkorn fra anther til stigma, enten innenfor eller mellom individer (dvs. pollinering). Denne overføringen av pollenkorn til en mottakelig blomst er vanligvis formidlet av pollinatorer eller abiotiske faktorer; Som sådan resulterer dette også ofte i avsetning av heterospesifikk pollen under naturlige forhold. Med noen få unntak er progresjonen av pollinering av heterospesifikk pollen evolusjonært ufordelaktig, og reduserer reproduktiv kondisjon gjennom tapte parringsmuligheter, med de fleste resulterende hybridavkom som enten ikke klarer å utvikle seg riktig eller er steril1. Dermed har mekanismer utviklet seg til å blokkere pollinering av "inkompatible" heterospesifikke pollen2. Rask anerkjennelse av kompatibel pollen er derfor uten tvil den viktigste prosessen i de tidlige stadiene av seksuell reproduksjon i mange blomstrende planter.
I Brassicaceae-familien, hvor stigmas er av den "tørre" typen, virker en rekke molekylære sjekkpunkter på flere stadier i reproduksjonsprosessen som regulerer pollinering, slik at bare kompatibel pollen er vellykket. Pollenhydrering er et av de viktigste sjekkpunktene (figur 1), da pollen som ikke klarer å hydrere, ikke kan utvikle seg til å produsere et pollenrør og deretter levere sæd til den kvinnelige gametofytten. Ofte klarer ikke uforenlige kornsorter å passere dette første pollineringskontrollpunktet, og får dermed ikke tilgang til stigmatisk vann3. Blant medlemmer av Brassicaceae-familien skjer gjenkjennelsen av pollen raskt, med kompatibilitet som etableres innen minutter etter at pollenkorn festes til pistilen 4,5. De siste årene har det blitt gjort store fremskritt, og vi begynner nå å forstå de molekylære mekanismene som regulerer viktige pollineringskontrollpunkter.
Figur 1: Oversikt over viktige hendelser under kompatibel pollinering. Disse stadiene, som pollenhydrering og spiring av pollenrør, er også pollineringskontrollpunkter som må navigeres vellykket for å oppnå kompatibel pollinering. Diagrammet representerer et "tørt" type stigma, som er typisk for arter fra Brassicaceae-familien 2,20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Banebrytende forskning på Brassica self-incompatibility (SI) system, hvor "selv" pollen er anerkjent og avvist, etablerte paradigmet for pollen-stigma anerkjennelse i Brassicaceae 6,7,8,9,10. SI i Brassica og dens slektninger er mediert av "anerkjennelsesproteiner" som ligger på overflaten av pollen og på den stigmatiske plasmamembranen som ved interaksjon fører til pollenavvisning. SI-pollenavvisning virker ved forstyrrelse av det basale pollen-stigma-kompatibilitetssystemet som, når det er fullt aktivert av oppfatningen av kompatibelt pollen, fører til målrettet sekresjon av stigmaet, og dermed driver pollenhydrering (for vurderinger av pollenkompatibilitetsmekanismen, se11,12). I eksempelet med SI er den pollenbårne liganden et lite cysteinrikt protein, S-locus cystein rik (SCR/SP11), og den stigmatiske reseptoren er S-locus reseptorkinase (SRK).
Nylig, i Arabidopsis thaliana, har en annen gruppe små cysteinrike pollenbårne proteiner, pollenbeleggproteinklasse Bs (vedPCP-Bs), blitt funnet å være viktige regulatorer av pollenaksept gjennom aktivering av pollenhydrering13. Stigmatiske reseptorer av AtPCP-Bs og aspekter ved nedstrøms regulatorisk vei har også nylig blitt beskrevet14,15. Interessant nok har mutasjonsstudier av gener som koder for potensielle pollenbårne og stigmatiske signalmediatorer av pollenhydrering (inkludert vedPCP-Bs) ikke klart å generere planter som har en komplett blokk til pollenhydreringskontrollpunktet. Dette antyder sterkt at flere andre, men uoppdagede, faktorer spiller en rolle i reguleringen av pollenhydrering. Ved å bygge på metoden som først ble beskrevet av Wang et al.13, beskriver vi her en forbedret høyoppløselig in vivo bioassay egnet for identifisering av subtile pollenhydreringsdefekter i kandidatmutante A. thaliana-linjer.
Protocol
1. Plantevekst og tilberedning av blomster
- Stratifiser A. thalianafrø i 0,1% agarose eller sterilt vann i 3 dager ved 4 °C, eller som tørre frø i 16-24 timer ved -20 °C (uNASC, personlig meddelelse).
- Overfør de stratifiserte frøene til potter av kompost og plasser i et miljøkontrollert vekstkammer. Forplante planter med en 16: 8 h, lys: mørk fotoperiode levert av fluorescerende rør (130 μmol m-2 s-1). Hold temperaturen på 21 ± 2 °C med ca. 40 % relativ fuktighet.
- Sørg for at pollendonor- og resipientplanter, sammen med eventuelle andre egnede "kontroll" plantelinjer, blir sådd sammen for å sikre synkron blomstring. Forplante plantene i ca 6 uker til blomstringene er godt etablert.
- Velg trinn 12 blomsterknopper på pollenmottakerplanten 1 dag før bioassay for emaskulasjon 16,17-dette er uåpnede blomsterknopper som vil fullføre blomsteråpning og antherdehiscens dagen etter 18.
MERK: Unngå de tre første blomstene som produseres på hovedblomsten, da disse vanligvis viser uvanlig reproduktiv oppførsel. Hvis tilgjengelig og hensiktsmessig for studien, bruk en mannlig steril plantelinje, for eksempel A. thaliana (tiltredelse Col-0) pA9-barnase-linjen, hvor støtfangere ikke klarer å modne19. - For å emasculate blomster av pollen mottakeren, plasser planten, i potten, på sin side. Teip plantestammen, i regionen nær blomstene som vil bli emasculated, til et glassglass som er på plass under et stereo dissekerende mikroskop.
- Bruk et par fintippede tang, forsiktig erte åpne blomsterknoppen og fjern alle blomsterbladene og støtfangerne. Sørg for at pistilen er uskadet og at stigmaet er fritt for forurensende pollen.
MERK: Mannlige sterile plantelinjer krever ikke emasculation. - Returner plantene til vekstkammeret og sørg for at de emasculated blomstene ikke kommer i kontakt med andre planter eller fremmedlegemer.
2. Pollenhydreringsanalyse-rå datainnsamling
- Neste morgen, fjern plantene fra vekstkammeret. Legg pollenmottakerplanten på siden og plasser blomsten på scenen i et omvendt mikroskop (figur 2) slik at stigmaet kan avbildes tydelig.
- Fest posisjonen til blomsten som skal avbildes ved å immobilisere stammen til et lysbilde ved hjelp av strimler av maskeringstape. Hold temperaturen mellom 18 °C og 25 °C og relativ luftfuktighet under 60 %.
MERK: For pA9-barnase mannlig steril plantelinje er det optimalt å utføre analysen om morgenen når blomstene åpnes og kronbladene ikke hindrer synsfeltet. - Deretter fjerner du en sunn og nyåpnet blomst fra pollendonorplanten. Plasser under et dissekerende mikroskop og samle noen pollenkorn på tuppen av rene fintippede tanger ved å berøre støtfangerne forsiktig (figur 3A). En øyenvippe teipet til en kort stang er også et effektivt verktøy for å samle og overføre pollen (figur 3C).
- Fjern overflødig pollen fra tangen ved å berøre dem lett mot kronbladene på blomstene der pollenkornene ble høstet, til et monolag av pollenkorn dannes på spissen av tangen.
MERK: Et monolag av pollenkorn på tuppen av fintippet tang vil i betydelig grad lette overføring av enkeltkorn i påfølgende trinn. Det er også mulig å få ett enkelt pollenkorn på tangen ved denne teknikken (Supplerende video S1). - Gå tilbake til pollenmottakerplanten og, ved hjelp av en objektivlinse med lav effekt (f.eks. 10x objektivlinse; Figur 3B), fokuser det omvendte mikroskopet på stigmaet som skal pollineres.
- Mens du holder tangen langs åpningen mellom tangens armer (figur 4), nærmer du deg forsiktig en ubestøvet («jomfru») stigmatisk papillacelle.
MERK: Vi har funnet denne metoden for å holde tangen hjelpemidler fingerferdighet og reduserer virkningen av å håndhilse. En mikromanipulator kan brukes til brukere som er mindre erfarne eller har problemer med å påføre et enkelt pollenkorn for hånd. - Velg et passende plassert pollenkorn på tangen for overføring til stigmaet. Fortsett å nærme deg den ubestøvede stigmatiske papillacellen til det valgte pollenkornet gir lett kontakt med overflaten. Trekk tangen langsomt ut og bekreft pollenfesting (figur 5).
MERK: Supplerende video S1 og tilleggsvideo S2 demonstrerer dette trinnet med både enkle og flere pollenkorn tilstede på tangen. - Sørg for at pollenkornet er orientert slik at ekvatorialaksen er tydelig synlig og i skarpt fokus. Bytt umiddelbart til en objektivlinse med høyere effekt (f.eks. 20x) og ta et bilde av pollenkornet. Dette første bildet er T = 0. Fortsett å ta ytterligere bilder med intervaller på 1 minutt i totalt 10 minutter.
- Juster fokuset etter behov for å imøtekomme små bevegelser i pollenkornet eller stigmaet. Registrer omgivelsestemperaturen og den relative fuktigheten i rommet hvert 2. minutt for å tillate fremtidige sammenligninger mellom eksperimentelle replikater.
- Når alle bildene er tatt, lagrer du dem i et tapsfritt format, for eksempel produsentens proprietære format eller som TIFF-er.
MERK: Det vil være 11 bilder per pollenkorn samplet (tilleggsfigur S1). De automatiserte/manuelle innstillingene for timelapse-anskaffelse i de fleste proprietære bildeinnsamlingsprogrammer er nyttige funksjoner for å lette organiseringen av hver tidsserie. - Gjenta trinn 2,4 til 2,9 for ytterligere pollenkorn. Innhente data for tilnærmet ekvivalent antall kontrollpersoner (villtype [WT]) og eksperimentelle pollinasjoner.
Figur 2: Utstyrsoppsett brukt til pollenhydreringsbioassay. I dette eksemplet var en pA9-barnase mannlig steril plantelinje pollenmottaker. Planten, innenfor potten, ble plassert på siden, og stammen tapet til et glassglass plassert på mikroskopets scene. For å redusere mekanisk belastning og hjelpeposisjonering av anlegget, ble det brukt en justerbar plattform for å støtte plantepotten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Innsamling av pollenkorn fra pollendonorblomsten. Bilder viser bruk av (A) fintippet tang og (C) et stykke øyenvippe. Klumper av pollen (rød pil) bør fjernes ved å berøre dem lett mot kronbladene til donorblomstene til et monolag av pollenkorn er oppnådd (grønn pil). (B) Høyoppløselig bilde av et ubestøvet A. thaliana (Col-0) pA9-barnase mannlig sterilt linjestigma som har nådd riktig utviklingsstadium for pollenhydreringsbioassay. Skala bar = 100 μm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Metode for å holde tang ved overføring av pollen til mottakerstigma. (A) Feil orientering for å holde tangen; (B) riktig orientering for å holde tangen. Å holde tangen sidelengs i denne konfigurasjonen, som betegnes av tommelens posisjon mellom armene på tangen, gir større stabilitet for å lette overføringen av pollenkorn til ubestøvede stigmatiske papiller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Overføring av et enkelt pollenkorn fra tuppen av en tang til en upollinert ('jomfru') stigmatisk papillacelle av en pA9-barnase mannlig steril plante. (A) Forsiktig tilnærming mot papillacellen. (B) Festing av et passende plassert pollenkorn (blå pil) til papillacellen (oransje pil). (C) Tilbaketrekking av tangen og visuell bekreftelse av pollenfeste (lilla pil). Panel A-C ble avbildet med en 10x objektivlinse (10,5 mm arbeidsavstand; 0,25 numerisk blenderåpning) og er øyeblikksbilder avledet fra videoklippet presentert i Supplementary Video S1. (D) Overgang til et 20x objektivobjektivt objektiv (2,1 mm arbeidsavstand; 0,5 numerisk blenderåpning) for oppstart av bildeopptak i en tidsserie. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Pollen hydrering analyse-målinger
- Definer hastigheten på pollenhydrering som endringen i lengden på halvmollaksen (figur 6) av pollenkornet (dvs. ekvatorialradiusen) over tid og presenter det som prosentvis endring (ligning [1]):
(1) - Ved hjelp av bildeanalyseprogramvare registrerer du semi-mindre akseverdier for hvert pollenkorn i eksperimentserien.
MERK: Navnet på dette målealternativet er programvareavhengig, for eksempel "Rotert ellipse" eller "5-punkts ellipse". - Gjenta trinn 3.1-3.2 for alle andre pollenkorn som skal måles. For konsistens, bruk samme grad av digital zoom og samme tilnærming til å definere "pollengrensen" for alle målinger i datasettene.
- Når alle målingene er fullført for en tidsserie, eksporterer du de rå halvakseverdiene for hver bildestakk til et regneark og presenterer dataene i kolonner per bildestakk. Sikre inklusjon av data fra minst 15 hydrerte pollenkorn i analysen for hver plantelinje (tilleggstabell S1).
- Det er ikke uvanlig at et lite antall pollenkorn ikke klarer å hydrere eller hydrere betydelig langsommere enn forventet. Disse "dud" kornene kan være et resultat av dårlig kontakt mellom korn og papilla celle eller relatert til pollen levedyktighet. Se etter og ekskluder disse fra datasettet med mindre disse er nødvendige i deres eksperimentelle design.
- Beregn middelverdiene for hvert tidspunkt per anleggslinje. Bruk uparede t-tester og enveis ANOVA for statistisk analyse av hydreringsdata fra WT og mutantlinjer ved hvert tidspunkt. Bruk en multippel t-test for samtidig sammenligning av gjennomsnittet mellom WT og mutantlinjer over flere tidspunkter.
MERK: XY-plott er også veldig nyttige for å visualisere den generelle trenden med pollenhydrering mellom plantelinjene som sammenlignes.
(1)
Figur 6: WT pollenkornhydrering på en stigmatisk papillacelle av A. thaliana (Col-0; pA9-barnase mannlig steril linje). (A) Tidspunkt null, 0 (0 KART) og (B) 10 KART. Den røde sirkelen rundt pollenkornet er "pollengrensen" definert og tegnet av operatøren ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. De grønne og mørkerøde linjene inne i pollen representerer henholdsvis halvdur- og halvmollaksene. Lengden på den semi-mindre aksen brukes til å beregne graden av pollenhydrering. En fullstendig tidsserie av dette datasettet finnes i tilleggsfigur S1. Bildet ble tatt med et 20x objektivobjektivt objektiv (2,1 mm arbeidsavstand; 0,5 numerisk blenderåpning). Skalastenger = 50 μm. Forkortelse: MAP = min-etter-pollinering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Representative Results
Denne delen presenterer to sett med eksempler på pollenhydreringsdata, samlet som beskrevet ovenfor, for A. thaliana. Det første settet med data består av tre replikater av en tidsserie for pollenhydrering for WT-planter, med hver replikering samlet på en annen dag. Hver replikat inneholder ikke mindre enn 18 individuelle pollenkornverdier, totalt 55 pollenkorn på tvers av alle tre replikatene. Minimums- og maksimumsverdier for gjennomsnittet mellom replikater, for alle tidspunkter, var innenfor 3 % (figur 7 og tilleggstabell S1). Disse representative dataene for WT-pollineringer viser tydelig den høye graden av konsistens som kan oppnås ved hjelp av metodikken som er beskrevet her for relativt lave utvalgstall og på tvers av forskjellige dager.
Figur 7: XY-plott som viser konsistens av A. thaliana villtype pollenhydreringsprofiler over en 10 min tidsperiode. Pollenforelderen var Col-0-tiltredelsen av A. thaliana og pistilforelderen var pA9-barnase hannsteril A. thaliana (Col-0) linje. Dataene representerer tre uavhengige datasett samlet inn på ulike dager og viser høy grad av konsistens. Et boksdiagram og statistisk analyse av gjennomsnittet for disse datasettene er presentert i tilleggsfigur S2. Antall målte pollen ('n') for hvert uavhengige datasett vises ved siden av syntaksen (WT1/WT2/WT3) på figuren. Forkortelse: WT = vill type. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det andre settet med data ble oppnådd for en plantelinje som har en T-DNA-innsetting i et pollenbeleggproteinkodende gen som genererer en "knockdown" -mutasjon, her referert til som "KD-mutant". Mutert pollen ble deponert på pA9-barnase mannlige sterile stigmaer for hydreringsprofilering, som beskrevet i protokollen. Som det fremgår av de resulterende dataene (figur 8), hadde mutant og WT-pollen uutslettelige hydreringsprofiler i løpet av de første 5 minuttene. Men 5-10 minutter etter pollinering (MAP) begynte den gjennomsnittlige halvmindre akseendringen for mutant pollen å falle bak WT-pollen, med forskjellen som ble statistisk signifikant ved 10 MAP. Dette resultatet viser ikke bare at dette pollenbeleggproteinet har en rolle i formidling av pollenhydrering, men illustrerer også pent nytten av denne høyoppløselige, enkeltkornsbioassay for sporing av pollenhydrering. I dette spesielle eksemplet var følsomheten i stand til å oppdage den subtile effekten av en "knockdown" av et pollenbeleggproteinkodende gen.
Figur 8: Pollenhydreringsprofiler for WT og en "knockdown" pollenbeleggproteinmutantlinje (KD mutant). (A) Hydreringsprofiler over en 10 min tidsperiode for WT og mutert pollen. Pollenforeldrene var Col-0-tiltredelsen av A. thaliana og pollenbeleggproteinet KD-mutanten (også i Col-0-bakgrunnen). I begge tilfeller var pistilforelderen pA9-barnase mannlig steril A. thaliana (Col-0) linje. (B) Boks- og værhårplott som viser omfanget av pollenhydrering (i form av prosentvis endring av halvmollaksen) ved 5 MAP og 10 MAP for WT og mutant pollen datasett. Værhår representerer minimums- og maksimumsverdier for eksempler. Bokser viser nedre kvartil, median og øvre kvartil i datasettet. Hvite kryss representerer gjennomsnittet av datasettet. Uparet t-testanalyse viser at gjennomsnittlig prosentandel av pollenhydrering er signifikant forskjellig mellom de to plantelinjene ved 10 MAP. En stjerne angir p < 0,05 (uparret t-test). Forkortelser: WT = vill type; KD = knockdown; MAP = min-etter-pollinering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: En beskåret pollenhydreringsbioassay tidsserie av et WT-pollenkorn som hydrerer på en stigmatisk papillacelle av en pA9-barnase mannlig steril plante i løpet av 10 minutter. Bildene ble tatt med 1 minutts mellomrom. Bildene på 0 MAP og 10 MAP ble brukt i figur 6 (separat vedlagt). Skala bar = 50 μm. Forkortelser: WT = vill type; MAP = min-etter-pollinering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Boks- og værhårplott som viser omfanget av pollenhydrering (i form av prosentvis endring av halvmollaksen) over en 10 minutters tidsperiode for de tre WT-pollendatasettene beskrevet i figur 7. Pistilforelderen var pA9-barnase mannlig steril A. thaliana (Col-0) linje. Værhår representerer minimums- og maksimumsverdier for eksempler. Bokser viser den nedre kvartilen (nedre hengsel), medianen (midtre hengsel) og øvre kvartil (øvre hengsel) i datasettet. Individuelle datapunkter vises. Enveis ANOVA viser at gjennomsnittlig prosentandel av pollenhydreringsverdier mellom de tre datasettene ikke var statistisk signifikant forskjellig fra hverandre gjennom tidsperioden på 10 minutter. Den signifikante terskelen er p < 0,05 (enveis ANOVA). Forkortelse: WT = vill type. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Rå pollenhydreringsdata brukt til å konstruere figur 7 (A. thaliana WT Col-0 pollen på pA9-barnase mannlig sterilt stigma). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsvideo S1: En video som demonstrerer overføringen av et enkelt WT (Col-0-tiltredelse) pollenkorn på tuppen av en tang til en "jomfruelig" stigmatisk papillacelle (pA9-barnase mannlig steril linje). For å lette tilgjengeligheten til videoen ble bildekvaliteten med vilje senket. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsvideo S2: En video som demonstrerer overføring av en enkelt WT (Col-0 tiltredelse) pollen fra et monolag av pollenkorn på tuppen av en tang til en "jomfruelig" stigmatisk papillacelle (pA9-barnase mannlig steril linje). For å lette tilgjengeligheten til videoen ble bildekvaliteten med vilje senket. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
For blomstrende planter er de aller tidlige stadiene av seksuell reproduksjon uten tvil den viktigste. På nivået av pollen-stigma-interaksjonen tas molekylære beslutninger som bestemmer "kompatibiliteten" til de samvirkende partnerne. Slike beslutninger, hvis de tas riktig, unngår sløsing med ressurser som kan påvirke reproduktiv kondisjon21. Å tillate bare kompatibelt pollen å påvirke befruktning er derfor en viktig komponent for å opprettholde godt tilpassede genotyper, og dermed artenes evolusjonære suksess. Forskning utført med modellplanten A. thaliana har vært ekstremt verdifull for å utdype vår forståelse av denne prosessen. En rekke studier de siste tiårene har avslørt tilstedeværelsen av faktorer i pollenbelegget som virker ved det første kompatibilitetskontrollpunktet, hvor pollen får tilgang til stigmatisk vann for å tillate pollenhydrering13. Til tross for disse første innsiktene i mekanismene som regulerer pollen-stigma-kompatibilitet, er det fortsatt mange hull i vår forståelse av denne prosessen. Til dags dato kan ingen mutanter av pollenbårne ligander eller stigmatiske reseptorer som er kjent for å påvirke pollenhydrering, helt blokkere kompatibel pollinering, noe som tyder på tilstedeværelsen av andre uoppdagede pollenhydreringsdeterminanter. Ved å være i stand til lett å observere fenotypen av interesse, er pollenhydreringsbioassayen beskrevet her en av de enkleste teknikkene for å studere potensielle mutanter som regulerer pollinering.
Eksisterende metoder for måling av pollenhydrering bruker vanligvis bulkpollineringer og rapporterer færre tidspunkter 14,22,23, og kan dermed gå glipp av viktige subtile hydreringsprofilfenotyper. For eksempel har studien av Wang et al.13, sammen med arbeid på andre pollenbeleggproteinmutanter i laboratoriet vårt (upubliserte observasjoner), avslørt spennende forskjeller i hydreringsprofiler mellom mutanter. Slike subtile forskjeller kan gi viktige ledetråder til reguleringsmekanismene som ligger til grunn for kompatibel pollinering.
Metoden beskrevet her fokuserer på innsamling av relativt små antall målinger mellom mutant- og WT-plantelinjer, med vekt på metodisk presisjon for å redusere variasjon innen datasettene. Selv om denne metoden er svært reproduserbar (som vist i figur 7), forutsatt at temperatur og fuktighet er tilstrekkelig kontrollert, er det viktig å samle hydreringsdata for nesten like mange WT og mutert pollen på samme dag for ytterligere å redusere potensialet for variasjon. Data kan deretter samles over forskjellige dager om nødvendig. I tillegg er valg av passende WT-kontrollanlegg avgjørende for korrekt tolkning av hydreringsresultatene. For pollenmottakeren bør samme plantelinje brukes til mottak av både WT-kontroll og mutante pollenkorn.
For eksempel bruker vi den sterile plantelinjen pA9-barnase, som også er omtalt i videoprotokollen, som pollenmottaker for både WT (kontroll) og mutert (eksperimentelt) pollen når vi undersøker T-DNA-pollenmutantlinjer (som 'KD'-mutanten beskrevet i figur 8). Blanding av data fra en slik mannlig steril linje, som ikke trenger å bli emasculated, med det samlet fra en manuelt emasculated kontrolllinje bør unngås, da disse stigmaene sannsynligvis vil oppføre seg annerledes. På samme måte bør emasculated mutant linjer brukes i forbindelse med en emasculated WT (kontroll) linje når det er mulig. Den samme forsiktigheten bør også brukes når man vurderer den genetiske bakgrunnen til plantene som studeres. Mens de mest populære T-DNA mutantsamlingene ble generert i Col-0-bakgrunnen, er andre, som FLAG-samlingen fra Institut national de la Recherche Agronomique (INRA), tilgjengelige i Wassilewskija (WS) genetisk bakgrunn24,25. I slike tilfeller anbefales det å bruke den respektive økotypens WT-anleggslinjer som kontroller.
Selv om vi her har fokusert på pollenhydrering i løpet av de første 10 minuttene av pollen-stigma-interaksjonen, kan denne metoden også tilpasses for å omfatte hydreringsprofiler som dekker en lengre tidsperiode. Et sentralt trekk ved protokollen er at blomster forblir festet til de overordnede plantestrøm-publiserte protokollene krever vanligvis eksisjon av pistilen og plassering i media for å opprettholde vevet i løpet av forsøket14,18,26. Selv om det ikke er direkte bevis som tyder på at en slik semi in vivo-tilnærming påvirker pollenhydrering eller faktisk endrer in vivo-reguleringen av denne prosessen, er det tenkelig at eksisjon av blomstene fra foreldreplanten kan påvirke pollineringen. Dermed oppnår denne protokollen et ekte in vivo-miljø for studiet av pollen-stigma-interaksjonen, der plantens strukturelle integritet er bevart.
Overføringen av enkle pollenkorn til "jomfruelige" stigmatiske papiller er uten tvil en av de mest utfordrende operasjonene som er beskrevet i denne protokollen. Det er ikke uvanlig å overføre klynger av pollenkorn ved en feil. Imidlertid kan sjansen for at dette skjer reduseres kraftig ved å sikre at bare et monolag av pollen er tilstede på tangen (figur 3A) (eller til og med bare et enkelt pollenkorn; Figur 5), og/eller ved å benytte pollenkorn som allerede er orientert, slik at de «stikker ut» fra andre på tuppen av tangen. Vi har funnet ut at en erfaren operatør kan fullføre overføringen av en enkelt pollen til en stigmatisk papillacelle på omtrent 3 minutter og registrere data for opptil fem pollenkorn over en 1 timers periode. Således, over en periode på 2-4 dager, kan nok data akkumuleres for meningsfull statistisk analyse av anleggslinjene som studeres.
Menneskelig feil er potensielt den største kilden til variasjon i analysen av datasett hentet fra studier som bruker denne protokollen. For eksempel kommer definisjonen av "pollengrensen" under bildeanalyse ned til den enkelte forskers skjønn. Dermed er det potensial for at målinger gjort av ulike forskere, selv på samme datasett, kan generere variasjon. Der det er mulig, bør en enkelt forsker utføre målingene for å minimere utvalgsfeil. I tillegg opphever kobling av analysen av WT og muterte datasett av samme operator den potensielt subjektive definisjonen av "pollengrensen" og interoperatørvariasjon.
Avslutningsvis beskrives en sofistikert, men nøyaktig metode for å måle pollenhydreringsprofiler i modellorganismen A. thaliana. Vi har vist at ved å bruke denne protokollen kan svært konsistente pollenhydreringsdata for A. thaliana lett anskaffes. Tre uavhengige grupper med data for WT-pollineringer innhentet på forskjellige dager viste konsistente små avvik på <3 % over alle tidspunkter (figur 7 og tilleggstabell S1). Selv om bioassay presentert her er litt mer kompleks enn de fleste eksisterende protokoller, er oppløsningen av dataene som genereres overlegen og egnet for identifisering og karakterisering av nye mutanter som påvirker veier som regulerer kompatibel pollinering.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av University of Bath (University of Bath, Bath, Storbritannia, BA2 7AY) stipendier til YL og L.W. Figur 1 ble laget med BioRender.com (https://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pA9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
| Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
| GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
| JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
| Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
| Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
| Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
| Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
| Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
| Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
| Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
| WT Col-0 plant line | uNASC | N70000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |
References
- Rieseberg, L. H., Willis, J. H.
- Hiscock, S. J., Allen, A. M. Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus. New Phytologist. 179 (2), 286-317 (2008).
- Kandasamy, M. K., Nasrallah, J. B., Nasrallah, M. E. Pollen pistil interactions and developmental regulation of pollen-tube growth in Arabidopsis. Development. 120 (12), 3405-3418 (1994).
- Bosch, M., Wang, L. Pollen-stigma interactions in Brassicaceae: complex communication events regulating pollen hydration. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2465-2468 (2020).
- Rozier, F., et al. Live-cell imaging of early events following pollen perception in self-incompatible Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2513-2526 (2020).
- Dickinson, H. Dry stigmas, water and self-incompatibility in Brassica. Sexual Plant Reproduction. 8, 1-10 (1995).
- Takasaki, T., et al. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma. Nature. 403 (6772), 913-916 (2000).
- Schopfer, C. R., Nasrallah, M. E., Nasrallah, J. B. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science. 286 (5445), 1697-1700 (1999).
- Takayama, S., et al. Direct ligand-receptor complex interaction controls Brassica self-incompatibility. Nature. 413 (6855), 534-538 (2001).
- Shiba, H., et al. A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specificity in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiology. 125 (4), 2095-2103 (2001).
- Broz, A. K., Bedinger, P. A. Pollen-pistil interactions as reproductive barriers. Annual Review of Plant Biology. 72 (1), 615-639 (2021).
- Cheung, A. Y., Duan, Q., Li, C., James Liu, M. -C., Wu, H. -M. Pollen-pistil interactions: It takes two to tangle but a molecular cast of many to deliver. Current Opinion in Plant Biology. 69, 102279 (2022).
- Wang, L. D., et al. PCP-B class pollen coat proteins are key regulators of the hydration checkpoint in Arabidopsis thaliana pollen-stigma interactions. New Phytologist. 213 (2), 764-777 (2017).
- Liu, C., et al. Pollen PCP-B peptides unlock a stigma peptide-receptor kinase gating mechanism for pollination. Science. 372 (6538), 171-175 (2021).
- Bordeleau, S. J., Sanchez, L. E. C., Goring, D. R. Finding new Arabidopsis receptor kinases that regulate compatible pollen-pistil interactions. Frontiers in Plant Science. 13, 1022684 (2022).
- Suwabe, K., et al. Double-locking mechanism of self-compatibility in Arabidopsis thaliana: the synergistic effect of transcriptional depression and disruption of coding region in the male specificity gene. Frontiers in Plant Science. 11, 576140 (2020).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Lee, H. K., Macgregor, S., Goring, D. R. A toolkit for teasing apart the early stages of pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. Pollen and Pollen Tube Biology. 2160, 13-28 (2020).
- Dilkes, B. P., et al. The maternally expressed WRKY transcription factor TTG2 controls lethality in interploidy crosses of Arabidopsis. PLoS Biology. 6 (12), 2707-2720 (2008).
- Riglet, L., et al. KATANIN-dependent mechanical properties of the stigmatic cell wall mediate the pollen tube path in Arabidopsis. eLife. 9, e57282 (2020).
- Zhou, L. Z., Dresselhaus, T. Friend or foe: Signaling mechanisms during double fertilization in flowering seed plants. Plant Development and Evolution. 131, 453-496 (2019).
- Gao, X. -Q., et al. The Arabidopsis KINβγ subunit of the SnRK1 complex regulates pollen hydration on the stigma by mediating the level of reactive oxygen species in pollen. PLoS Genetics. 12 (7), e1006228 (2016).
- Lee, H. K., Goring, D. R. Two subgroups of receptor-like kinases promote early compatible pollen responses in the Arabidopsis thaliana pistil. Journal of Experimental Botany. 72 (4), 1198-1211 (2021).
- O'Malley, R. C., Barragan, C. C., Ecker, J. R. A user's guide to the Arabidopsis T-DNA insertion mutant collections. Pollen and Pollen Tube Biology. 1284, 323-342 (2015).
- Samson, F., et al. FLAGdb++: a database for the functional analysis of the Arabidopsis genome. Nucleic Acids Research. 32, D347-D350 (2004).
- Doucet, J., et al. Investigations into a putative role for the novel BRASSIKIN pseudokinases in compatible pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 19 (1), 549 (2019).
