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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

प्रारंभिक संवहनी विकास के दौरान परिवर्तित हेमोडायनामिक लोडिंग के लिए एक मॉडल के रूप में एवियन भ्रूण में बाएं एट्रियल लिगेशन

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65330
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences and Engineering, Koc University, 2Department of Mechanical Engineering, Koc University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एवियन भ्रूण में बाएं एट्रियल लिगेशन (एलएएल) मॉडल को निष्पादित करने के लिए एक विस्तृत दृश्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एलएएल मॉडल इंट्राकार्डियक प्रवाह को बदल देता है, जो दीवार कतरनी तनाव लोडिंग को बदलता है, हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम की नकल करता है। इस कठिन माइक्रोसर्जरी मॉडल की चुनौतियों को दूर करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

अपने चार-कक्षीय परिपक्व वेंट्रिकुलर विन्यास, संस्कृति में आसानी, इमेजिंग पहुंच और दक्षता के कारण, एवियन भ्रूण कार्डियोवैस्कुलर विकास का अध्ययन करने के लिए एक पसंदीदा कशेरुक पशु मॉडल है। सामान्य विकास और जन्मजात हृदय दोष रोग निदान को समझने के उद्देश्य से अध्ययन व्यापक रूप से इस मॉडल को अपनाते हैं। माइक्रोस्कोपिक सर्जिकल तकनीकों को एक विशिष्ट भ्रूण समय बिंदु पर सामान्य यांत्रिक लोडिंग पैटर्न को बदलने और डाउनस्ट्रीम आणविक और आनुवंशिक कैस्केड को ट्रैक करने के लिए पेश किया जाता है। सबसे आम यांत्रिक हस्तक्षेप बाएं विटेलिन नस बंधाव, कोनोट्रंकल बैंडिंग और बाएं एट्रियल लिगेशन (एलएएल) हैं, जो रक्त प्रवाह के कारण इंट्राम्यूरल संवहनी दबाव और दीवार कतरनी तनाव को संशोधित करते हैं। एलएएल, विशेष रूप से यदि ओवो में प्रदर्शन किया जाता है, तो सबसे चुनौतीपूर्ण हस्तक्षेप है, जिसमें बेहद ठीक अनुक्रमिक माइक्रोसर्जिकल ऑपरेशन के कारण बहुत कम नमूना पैदावार होती है। इसके उच्च जोखिम के बावजूद, ओवो एलएएल वैज्ञानिक रूप से बहुत मूल्यवान है क्योंकि यह हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम (एचएलएचएस) रोगजनन की नकल करता है। एचएलएचएस एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक, जटिल जन्मजात हृदय रोग है जो मानव नवजात शिशुओं में देखा जाता है। ओवो एलएएल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल इस पेपर में प्रलेखित है। संक्षेप में, निषेचित एवियन भ्रूण को 37.5 डिग्री सेल्सियस और 60% निरंतर आर्द्रता पर इनक्यूबेट किया गया था, जब तक कि वे हैमबर्गर-हैमिल्टन (एचएच) चरण 20 से 21 तक नहीं पहुंच जाते। अंडे के छिलके खुले हुए थे, और बाहरी और आंतरिक झिल्ली को हटा दिया गया था। सामान्य आलिंद के बाएं एट्रियल बल्ब को उजागर करने के लिए भ्रूण को धीरे से घुमाया गया था। 10-0 नायलॉन सीवन से पूर्व-इकट्ठे माइक्रो-नॉट्स को धीरे से रखा गया और बाएं एट्रियल कली के चारों ओर बांधा गया। अंत में, भ्रूण को उसकी मूल स्थिति में वापस कर दिया गया, और एलएएल पूरा हो गया। सामान्य और एलएएल-इंस्ट्रूमेंटेड वेंट्रिकल्स ने ऊतक संघनन में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया। एक कुशल एलएएल मॉडल पीढ़ी पाइपलाइन कार्डियोवैस्कुलर घटकों के भ्रूण के विकास के दौरान सिंक्रनाइज़ यांत्रिक और आनुवंशिक हेरफेर पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों में योगदान देगी। इसी तरह, यह मॉडल ऊतक संस्कृति अनुसंधान और संवहनी जीव विज्ञान के लिए एक परेशान सेल स्रोत प्रदान करेगा।

Introduction

जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) संरचनात्मक विकार हैं जो असामान्यभ्रूण के विकास के कारण होते हैं। आनुवंशिक स्थितियों के अलावा, रोगजनन परिवर्तित यांत्रिक लोडिंग 2,3 से प्रभावित होता है। हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम (एचएलएचएस), एक जन्मजात हृदय रोग, जन्मके समय एक अविकसित वेंट्रिकल / महाधमनी का परिणाम होता है जिसमें मृत्यु दर 5,6 होती है। इसके नैदानिक प्रबंधन में हालिया प्रगति के बावजूद, एचएलएचएस की संवहनी वृद्धि और विकास गतिशीलता अभीभी स्पष्ट नहीं है। सामान्य भ्रूण के विकास में, बाएं वेंट्रिकल (एलवी) एंडोकार्डियम और मायोकार्डियम हृदय पूर्वजों से उत्पन्न होते हैं क्योंकि प्रारंभिक भ्रूण हृदय ट्यूब गठन प्रगति करता है। मायोकार्डियल ट्रेबेक्यूलेशन, मोटी परतों और कार्डियोमायोसाइट्स प्रसार की क्रमिकउपस्थिति की सूचना दी गई है। एचएलएचएस के लिए, परिवर्तित ट्रेब्युलर रीमॉडेलिंग और बाएं वेंट्रिकुलर चपटेपन को देखा जाता है, जो असामान्य कार्डियोमायोसाइट्स माइग्रेशन 2,8,9,10 के कारण मायोकार्डियल हाइपोप्लासिया में योगदान देता है।

हृदय के विकास का अध्ययन करने और हेमोडायनामिक स्थितियों को समझने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीवों में से, एवियन भ्रूणको इसके चार-कक्षीय परिपक्व हृदय और11,12,13,14 की संस्कृति में आसानी के कारण पसंद किया जाता है। दूसरी ओर, जेब्राफिश भ्रूण और ट्रांसजेनिक / नॉकआउट चूहों की उन्नत इमेजिंग पहुंच अलग-अलग फायदे प्रदान करती है11,12. एवियन भ्रूण के लिए विभिन्न यांत्रिक हस्तक्षेपों का परीक्षण किया गया है जो कार्डियोवैस्कुलर घटकों को विकसित करने में इंट्राम्यूरल दबाव और दीवार कतरनी तनाव को बदलते हैं। इन मॉडलों में लेफ्ट विटेलिन लिगेशन, कोनोट्रंकल बैंडिंग15 और लेफ्ट एट्रियल लिगेशन (एलएएल) 11,12,16 शामिल हैं। परिवर्तित यांत्रिक लोडिंग के कारण परिणामी फेनोटाइप को प्रारंभिक पूर्वानुमान11,13 पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों में सर्जिकल हस्तक्षेप के लगभग 24-48 घंटे बाद देखा जा सकता है। एलएएल हस्तक्षेप एट्रियोवेंट्रिकुलर ओपनिंग के चारों ओर एक सीवन लूप रखकर बाएं आलिंद (एलए) की कार्यात्मक मात्रा को संकीर्ण करने के लिए एक लोकप्रिय तकनीक है। इसी तरह, माइक्रोसर्जिकल हस्तक्षेप भी किए गए हैं जो राइट एट्रियल लिगेशन (आरएएल) 17,18 को लक्षित करते हैं। इसी तरह, कुछ शोधकर्ता एलए19,20 की मात्रा को कम करने के लिए माइक्रो क्लिप का उपयोग करके बाएं एट्रियल उपांग (एलएए) को लक्षित करते हैं। कुछ अध्ययनों में, एक सर्जिकल नायलॉन धागा एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड19,21 पर लागू किया जाता है। उपयोग किए जाने वाले हस्तक्षेपों में से एक एलएएल है, जो एचएलएचएस की नकल कर सकता है, लेकिन प्रदर्शन करने के लिए सबसे कठिन मॉडल भी है, जिसमें बेहद ठीक माइक्रोसर्जिकल ऑपरेशन की आवश्यकता के कारण बहुत कम नमूना पैदावार होती है। हमारी प्रयोगशाला में, एलएएल को हैमबर्गर-हैमिल्टन (एचएच) चरण 20 और 21 के बीच ओवो में किया जाता है, इससे पहले कि आम आलिंद पूरी तरह से 6,14,22,23 हो। एलए के चारों ओर एक सर्जिकल सीवन रखा जाता है, जो इंट्राकार्डियक रक्त प्रवाह धाराओं को बदल देता है। एचएलएचएस के एलएएल मॉडल में, वेंट्रिकल दीवार कठोरता में वृद्धि, परिवर्तित मायोफिबर कोण, और एलवी गुहा आकार में कमी14,24 देखी गई है।

इस वीडियो लेख में, ओवो एलएएल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और दृष्टिकोण प्रदान किया गया है। संक्षेप में, निषेचित एवियन भ्रूण को माइक्रोसर्जरी के लिए इनक्यूबेट किया गया था, अंडे के छिलके को खुला छोड़ दिया गया था, और बाहरी और आंतरिक झिल्ली को साफ कर दिया गया था। भ्रूण को धीरे-धीरे घुमाया गया ताकि एलए सुलभ हो। एक 10-0 नायलॉन सर्जिकल सीवन को एट्रियल कली से बांधा गया था, और भ्रूण को एलएएल प्रक्रिया25 को पूरा करते हुए अपने मूल अभिविन्यास में वापस कर दिया गया था। एलएएल और सामान्य वेंट्रिकल्स की तुलना ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी और बुनियादी हिस्टोलॉजी के माध्यम से ऊतक संघनन और वेंट्रिकल वॉल्यूम के लिए की जाती है।

एक सफलतापूर्वक निष्पादित एलएएल मॉडल पाइपलाइन, जैसा कि यहां वर्णित है, कार्डियोवैस्कुलर घटकों के भ्रूण के विकास पर ध्यान केंद्रित करने वाले बुनियादी अध्ययनों में योगदान देगा। इस मॉडल का उपयोग आनुवंशिक जोड़तोड़ और उन्नत इमेजिंग तौर-तरीकों के साथ भी किया जा सकता है। इसी तरह, तीव्र एलएएल मॉडल ऊतक संवर्धन प्रयोगों के लिए रोगग्रस्त संवहनी कोशिकाओं का एक स्थिर स्रोत है।

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Protocol

उपजाऊ सफेद लेगहॉर्न अंडे विश्वसनीय आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त किए जाते हैं और विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार सेते हैं। चूजा भ्रूण, चरण 18 (दिन 3) से 24 (दिन 4) (इस पेपर में प्रस्तुत चरण) को यूरोपीय संघ (ईयू) निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ और अमेरिका में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) दिशानिर्देशों द्वारा जीवित कशेरुक जानवर नहीं माना जाता है। अमेरिकी कानूनों के अनुसार इनक्यूबेशन के 19 वें दिन के बाद चूजे के भ्रूण को "जीवित जानवर" माना जाता है, लेकिन यूरोपीय संघ के लिए नहीं। प्रत्येक अंडे को सेने की शुरुआत की तारीख के साथ लेबल किया जाता है और इनक्यूबेशन के 10वें दिन से बाद में नहीं निकलने के लिए निर्धारित किया जाता है। अंडे से निकलने के बाद, चूजों को इनक्यूबेटर से हटा दिया जाता है। प्रोटोकॉल दो बेंच-टॉप ऑपरेशन स्टेशनों (स्टेशन 1 और स्टेशन 2) में किया जाता है, जो विशेष मॉडल पीढ़ी के चरणों पर ध्यान केंद्रित करता है।

1. माइक्रोसर्जरी से पहले तैयारी

  1. निषेचित अंडे या तो एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) ग्रेड के साथ एक टीका विकास केंद्र से या सूखे पॉलीस्टाइनिन कंटेनरों में एक नाजुक वितरण कूरियर द्वारा एक विश्वसनीय वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता खेत के माध्यम से प्राप्त करें। इनक्यूबेशन से पहले, संदूषण को दूर करने के लिए 70% इथेनॉल में भिगोए गए लिंट-फ्री वाइप्स के साथ अंडे के छिलके को धीरे से साफ करें।
  2. भ्रूण समावेशन/बहिष्करण मानदंड
    1. परिवहन के दौरान फटे या क्षतिग्रस्त अंडे न सेएं।
    2. यदि एलएएल प्रक्रिया के दौरान या पुन: इनक्यूबेशन के बाद रक्तस्राव नोट किया जाता है, तो भ्रूण का उपयोग न करें।
    3. बाईं ओर की स्थिति में विकसित होने वाले भ्रूण का उपयोग न करें, क्योंकि हेमोडायनामिक रक्त प्रवाह सामान्य अभिविन्यास से भिन्न हो सकता है।
    4. डिसकार्ड भ्रूण पूर्व और बाद की शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं दोनों में जन्मजात दोषों के साथ विकसित होता है।
    5. उन भ्रूणों को शामिल करें जो अपने मूल स्थान पर विकसित होने वाले लक्षित चरण तक पहुंचते हैं, जो एलएएल मॉडल के रूप में एचएलएचएस की नकल करते हैं।
  3. निषेचित सफेद-लेगहॉर्न चिकन अंडे (गैलस गैलस डोमेस्टिकस एल), कुंद अंत-अप, आमतौर पर एचएच 20-2115 (37.5 डिग्री सेल्सियस, 60% आर्द्रता, 3.5 दिन) में वांछित चरण में इनक्यूबेट करें (चित्रा 1)।
    नोट: उपज बढ़ाने के लिए अंडे को निरंतर तापमान और आर्द्रता पर रखना महत्वपूर्ण है। इनक्यूबेटर मॉडल के आधार पर, आसुत जल से भरे पैन के अलावा स्थिर आर्द्रता बनाए रखेगा। सहायक तापमान और आर्द्रता नियंत्रण प्रणाली के ब्लूप्रिंट जो अधिकांश इनक्यूबेटरों को फिट करेंगे, लेखकों द्वारा विकसित किए गए हैं और अनुशंसित हैं। इस इन-हाउस-निर्मित सेंसर / नियंत्रण इकाई के इलेक्ट्रॉनिक्स, हार्डवेयर और कोड विवरण एक डेटा रिपॉजिटरी26 में प्रदान किए जाते हैं। इनक्यूबेशन के दौरान अंडों के निरंतर कोमल झटकों (घूर्णन) से भ्रूण की इष्टतम स्थिति हो सकती है और इस प्रकार "ऑपरेशन योग्य" भ्रूण का उच्च प्रतिशत हो सकता है। शेकिंग इस क्षमता वाले इनक्यूबेटरों के साथ भी काम कर सकती है और उत्पादकता को और बढ़ा सकती है।
  4. प्रक्रिया शुरू करने से पहले, 1.5 सेमी लंबी 10-0 सीवन में एक ढीली ओवरहैंड गाँठ बांधकर आवश्यक संख्या में गाँठ तैयार करें। सुनिश्चित करें कि गाँठ तंग नहीं है और ऑपरेशन के दौरान आसानी से अटरिया पर फिट होने के लिए पर्याप्त बड़ी है (चित्रा 2)।
    नोट: समय से पहले गांठों को बांधें और उपयोग करने से पहले उन्हें बाँझ चिक रिंगर समाधान में रखें। गाँठ बांधने के ऑपरेशन में चिमटी को समकालिक रूप से संचालित करने के लिए दो हाथों के उपयोग की आवश्यकता होती है। चूंकि यह प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण चरण है, इसलिए इस चरण का अभ्यास करने के लिए पुट्टी से एट्रियम का एक मॉडल बनाया जा सकता है (चित्रा 3)। यह स्टेशन 2 (चित्रा 4) पर चरण 3.2.3 करने के लिए आवश्यक त्रि-आयामी माइक्रोसर्जरी कौशल में सुधार करेगा।

2. स्टेशन 1 पर संचालन (चित्रा 4 ए)

  1. अंडे के कुंद छोर से एक खिड़की खोलें और बाहरी और आंतरिक झिल्ली दोनों को हटा दें15 (चित्रा 5 ए-डी)।
  2. चिमटी के विपरीत छोर से धीरे से क्रैक करके अंडे के छिलके को खोलें, जिसमें मुक्त उंगलियां अवांछित दरार प्रसार को कम करने के लिए अंडे का मजबूती से समर्थन करती हैं।
  3. चूंकि एलएएल एक लंबी प्रक्रिया है, भ्रूण के तापमान और आर्द्रता का संरक्षण करें, क्योंकि हृदय गति तापमान पर निर्भर करती है। इस प्रकार, सुनिश्चित करें कि प्रारंभिक शेल विंडो जितना संभव हो उतना छोटा बनाया गया है, बस संचालन को निष्पादित करने के लिए पर्याप्त है।
    नोट: ऑपरेशन के दौरान कोई आर्द्रता या तापमान नियंत्रण प्रणाली नियोजित नहीं की जाती है, लेकिन ये प्रणालियां, यदि उपलब्ध हैं, तो उपज को लाभ होगा। यदि संभव हो, तो प्रयोगशाला में एयर कंडीशनिंग सिस्टम को बंद कर दिया जाता है, और प्रक्रिया को उच्चतम कमरे के तापमान (आरटी) पर किया जाता है। भ्रूण की हृदय गति का अनुकूलन, जिसे ऑपरेशन के दौरान तापमान द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, की भी सिफारिश की जाती है। कुछ प्रयोगशालाएं एलएएल ऑपरेशन के दौरान तापमान नियंत्रण के माध्यम से 120 बीपीएम से थोड़ी कम दरों पर हृदय गति बनाए रखती हैं। इस प्रकार, सर्जिकल ज़ोन के आसपास नियोजित आर्द्रता नियंत्रण उपज को और बढ़ाएगा। अंडे के छिलके की खिड़कियां यथासंभव छोटी बनाई जाती हैं, बस सर्जिकल पहुंच की अनुमति देने के लिए पर्याप्त बड़ी होती हैं। यह मोटी बाहरी झिल्ली पर भी लागू होता है, जो आमतौर पर अंडे के छिलके से केवल भ्रूण की परिधि की सीमा तक छोटा होता है। ये भ्रूण के तापमान और आर्द्रता को बनाए रखना सुनिश्चित करते हैं। अंडे के कुंद छोर से एक खिड़की खोलते समय, छोटे खोल के टुकड़ों को साफ किया जाता है ताकि ये टुकड़े विटेलिन संवहनी अखंडता को नुकसान न पहुंचाएं या अवांछित कलाकृतियों को जन्म न दें। इसके अलावा, अन्य प्रयोगशालाएं खिड़कियां बनाने के लिए घुमावदार माइक्रो-सेरेटेड कैंची का उपयोग करती हैं। इसके अलावा, क्रैकिंग को नियंत्रित करने के लिए अंडे के छिलके को स्थिर करने के लिए स्कॉच टेप की दो चौड़ाई का उपयोग किया जा सकता है।
  4. माइक्रो कैंची का उपयोग करके केवल आवश्यक विटेलिन झिल्ली को हटा दें (पूरक वीडियो 1)।
  5. सामान्य भ्रूण विकास दाईं ओर है। एक बार जब भ्रूण विटेलिन झिल्ली से मुक्त हो जाता है, तो चिमटी को भ्रूण के पृष्ठीय खंड के नीचे बंद युक्तियों के साथ रखें और बाईं ओर (यानी, बाईं ओर के विन्यास) को उजागर करने के लिए भ्रूण को धीरे से पलटें (चित्रा 6 ए, बी; पूरक वीडियो 2)।
  6. सुनिश्चित करें कि बाएं एट्रियल कली अब उजागर हो गई है लेकिन अभी भी एक जटिल झिल्ली प्रणाली द्वारा कवर की गई है, जिसमें आमतौर पर पेरिकार्डियम की दोहरी परत होती है।
  7. एट्रियल कली के चारों ओर ठीक लोगों सहित झिल्ली को तुरंत हटा दें। यह एक और महत्वपूर्ण चरण है; मोटे झिल्ली से झिल्ली हटाने और बाएं एट्रियल कली के आसपास के महीन लोगों में प्रगति करें। बारीक झिल्ली को हटाने के लिए बेहतरीन चिमटी आरक्षित करें (पूरक वीडियो 3)।
  8. झिल्ली हटाने की प्रक्रिया के दौरान, भ्रूण को बाईं ओर की स्थिति में उन्मुख करें, ताकि चरण 3.2 में गाँठ प्लेसमेंट ऑपरेशन को आगे की पुनर्स्थापना के बिना किया जा सके। इसे प्राप्त करने के लिए, चरण 2.6 में झिल्ली का उपयोग करके भ्रूण को उठाएं और इसे अंडे के खोल से लटका दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि बाईं ओर का चेहरा ऊपर है।
    नोट: कुछ भ्रूण अंडे की परिधि के करीब स्थित हो सकते हैं और संचालित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। फिर भी, ये भ्रूण सबसे अधिक संभावना दाईं ओर उन्मुख होंगे और सामान्य व्यवहार प्रदर्शित करेंगे, और अध्ययन में शामिल किए जा सकते हैं। इन मामलों में, यदि आवश्यक हो, तो अस्पष्ट आलिंद को # 4 महीन चिमटी के साथ पेरिकार्डियल झिल्ली को धीरे से साफ करके और अंडे के छिलके को विपरीत दिशा में (खोल खोलने की ओर) हटाकर अधिक सुलभ बनाया जा सकता है। इन भ्रूणों को एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली के कुछ हिस्सों का उपयोग करके भी उठाया जा सकता है और झिल्ली के एक छोर (चिमटी छोर) को अंडे के छिलके से जोड़कर वांछित स्थिति में तय किया जा सकता है, इसकी प्राकृतिक चिपचिपाहट का उपयोग करके। इसके अतिरिक्त, अस्पष्ट आलिंद को प्रकट करने के लिए चिमटी की मदद से भ्रूण के सिर और रीढ़ की हड्डी के क्षेत्र के बीच की जगह का विस्तार किया जा सकता है।

3. स्टेशन 2 पर संचालन (चित्रा 4 बी)

  1. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, चरण 1.4 से पहले से तैयार गाँठ को भ्रूण के करीब एक सुलभ स्थान पर रखें (चित्रा 6 बी)। एट्रियल कली अब बांधने के लिए तैयार है (पूरक वीडियो 4)।
  2. पहले से तैयार खुली गाँठ को पुनः प्राप्त करें और इसे बाएं एट्रियल कली पर उन्मुख करें। लाल के काम करने के लिए, अंडे को एक विशिष्ट रूप से झुकाव वाले त्रि-आयामी अभिविन्यास में रखें।
    1. भ्रूण को नुकसान पहुंचाए बिना कसने की प्रक्रिया को निष्पादित करने के लिए गाँठ को सही ढंग से उन्मुख करें।
    2. धड़कते हुए दिल के प्रभाव को कम करने के लिए चरण 2.7 में ठीक झिल्ली को बेहतर ढंग से साफ करें।
    3. सीवन को कस ें (चित्रा 6 सी)। इस कदम के लिए, पुट्टी के साथ अभ्यास करना बहुत उपयोगी है। शाम भ्रूण के लिए, गाँठ को पकड़ने के लिए गाँठ को पर्याप्त कस लें।
  3. इसके बाद, सीवन के अतिरिक्त सिरों को कली के जितना संभव हो उतना काटने के लिए माइक्रो कैंची का उपयोग करें (पूरक वीडियो 5)।
  4. बहुत सावधान रहें कि बंधे हुए सीवन के नए कटे हुए छोर रोटेशन के दौरान या दिल की धड़कन के कारण आस-पास के जहाजों को पंचर करने की स्थिति में नहीं हैं।
  5. चिमटी का उपयोग करके, चरण 3.3 में काटे गए अतिरिक्त सीवन टुकड़ों को हटा दें।
  6. अंत में, बंद चिमटी का उपयोग करके, भ्रूण को उसकी मूल स्थिति में वापस लाएं, जैसा कि चरण 2.5 (पूरक वीडियो 6) में है।
  7. लाल प्रक्रिया पूरी करने के बाद, अंडे को पैराफिल्म की दोहरी परत के साथ कवर करें और इसे फिर से सेने दें। अंडे का एक तंग और बाँझ बंद होना जीवित रहने के लिए सर्वोपरि है, खासकर इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद। यदि दृश्य पहुंच भी वांछित है, तो ग्लास स्लाइड के साथ पैराफिन मोम का उपयोग करें।
    नोट: जैसा कि प्रारंभिक भ्रूण अवधि का अध्ययन किया जाता है, अंडे आमतौर पर 24-48 घंटे के लिए सेते हैं जब तक कि वे लगभग एचएच 25 या एचएच 27 तक नहीं पहुंच जाते। हालांकि, कोई सीमा नहीं है, और बाद के चरणों का अध्ययन किया जा सकता है, जैसा कि अन्य शोधकर्ताओं द्वारा प्रयास किया गया है। तेज ऑपरेशन गति के लिए, कम से कम दो-व्यक्ति टीम की सिफारिश की जाती है। एक व्यक्ति को अंडे खोलने, प्रारंभिक झिल्ली की सफाई, रोटेशन और बाएं एट्रियल कली के चारों ओर झिल्ली की सफाई के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए। दूसरा व्यक्ति केवल प्रारंभिक गाँठ की तैयारी, गाँठ प्लेसमेंट और कसाव के लिए ज़िम्मेदार है। अंतिम भ्रूण रोटेशन व्यक्ति 1 द्वारा किया जा सकता है। एक भ्रूण के लिए सर्जिकल ऑपरेशन में लगभग 4-5 मिनट लगते हैं।
  8. सर्जिकल ऑपरेशन से पहले या बाद में, बेंच-टॉप सतहों और उपकरणों को इथेनॉल के साथ साफ करें। भ्रूण के ऊतकों को छूने वाले धातु उपकरणों पर ताजा चिक रिंगर समाधान (NaCl, KCl, CaCl2, और NaHCO3)16,27 लागू करना सुनिश्चित करें।

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Representative Results

एलएएल हस्तक्षेप10 के कारण संरचनात्मक और रूपात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए उन्नत समय-संकल्प इमेजिंग तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, एलएएल नमूने आणविक और जैविक तरीकों19,28 के लिए भी उत्तरदायी हैं। तालिका 1 में, एलएएल मॉडल परिणामों को नियोजित करने वाले नमूना अध्ययन प्रदान किए गए हैं। इस संदर्भ में, एचएच 20-21 तक पहुंचने वाले चूजे के भ्रूण में एलएएल हस्तक्षेप किया गया था। एचएच 25-26 में भ्रूण से नियंत्रण (स्वस्थ) और लाल दिल दोनों को हटा दिया गया था। फिर, नमूने 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में 4 डिग्री सेल्सियस 6,15 पर तय किए गए थे। हटाए गए दिल के नमूनों को 1 घंटे के लिए बढ़ती सांद्रता (70%, 96%, और 100%) के इथेनॉल समाधान में निर्जलित किया गया था। अंत में, नमूने को 0.5 घंटे के लिए आरटी पर जाइलीन में रखा गया था, और पैराफिन एम्बेडिंग 10 μm मोटाई पर सेक्शनिंग से पहले किया गया था। ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित किए गए नमूने इलास्टिका वैन गिसन दाग से दागदार थे। अनुभागों की जांच एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत की गई थी, जहां वेंट्रिकल के अनुप्रस्थ व्यास को मापा गया था। हमनेकुछ नमूनों में एक त्रि-आयामी गैर-इनवेसिव विधि, ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी स्कैनिंग (ओसीटी) भी किया। एचएच 25-26 पर नियंत्रण और लाल दिल दोनों को आबकारी किया गया था, और उनके क्रॉस-लुमेन व्यास को ओसीटी के तहत मापा गया था।

परिणामों से पता चला है कि एलएएल के लिए, सामान्य विकास की तुलना में महत्वपूर्ण रूपात्मक परिवर्तनों के साथ एक अधिक कॉम्पैक्ट मायोकार्डियल संरचना हासिल की जाती है (चित्रा 7)। इसके अलावा, कोलेजन जैसे बाह्य मैट्रिक्स घटकों का जमाव, कार्डियक इंटरस्टिटियम के आसपास देखा जाता है, जो एचएलएचएस30 के समान मायोकार्डियल फाइब्रोसिस जैसा दिखता है। मायोकार्डियल मोटाई और ट्रेब्युलर संघनन को बेहतर ढंग से समझने के लिए, नियंत्रण और एलएएल दोनों नमूनों में मोर्फोमेट्रिक पोरसिटी माप किए गए थे। जैसा कि अपेक्षित था, एलएएल हस्तक्षेप के परिणामस्वरूप अंतर-त्रिकोणीय अवकाश को कसकर एक छोटा बाएं वेंट्रिकुलर गुहा और ट्रेब्युलर संघनन हुआ। ये निष्कर्ष इस परिकल्पना की पुष्टि करते हैं कि एलएएल स्वस्थ वेंट्रिकुलर आर्किटेक्चर को बदल देता है और ट्रैब्युलर पहलू22 को फिर से तैयार करता है। इसी तरह, एचएच 29 में एलएएल मॉडल के परिणामस्वरूप एक बढ़ा हुआ दायां वेंट्रिकुलर गुहा, परिवर्तित त्रिकोणीय वास्तुकला और मायोकार्डियल वॉल्यूम24 हुआ।

इस अध्ययन में प्राप्त परिणामों का समर्थन करने के लिए, ओसीटी इमेजिंग का उपयोग वेंट्रिकुलर लुमेन क्रॉस क्षेत्र और अक्षीय लंबाई (चित्रा 8) को मापने के लिए किया गया था। एलएएल ने नियंत्रण की तुलना में बाएं वेंट्रिकुलर आकार और व्यास में महत्वपूर्ण कमी दिखाई। जबकि केवल वेंट्रिकल्स यहां केंद्रित हैं, महाधमनी आर्क विकास पर एलएएल का प्रभावभी बताया गया है। हाल ही में हमने 3 डी में एक अध्ययन में योगदान दिया कि एचएच 2532 पर एलएएल के बाद दोनों वेंट्रिकल्स में मध्य-दीवार मायोकार्डियल उपभेदों में वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, एलएएल समूहों ने एचएच 25 पर नियंत्रण समूहों की तुलना में दीवार की मोटाई में वृद्धि का प्रदर्शन किया। यह अध्ययन टोबिता एट अल.25 द्वारा पिछले अध्ययन के अनुरूप है, जिसने एचएच 27 पर एलएएल एलवी में पीक सिस्टोलिक एपिकार्डियल परिधीय उपभेदों में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया।

Figure 1
चित्रा 1: भ्रूण के विकास के लिए इनक्यूबेशन प्रणाली। निषेचित सफेद लेगहॉर्न चिकन अंडे (गैलस गैलस) को निरंतर आर्द्रता (60%) और तापमान (37.5 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर में उगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: लाल गाँठ की तैयारी। 10-0 नायलॉन सर्जिकल सीवन का उपयोग करके कई समुद्री मील ~ 0.5-1 मिमी व्यास और 1-2 सेमी लंबे टुकड़े तैयार किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पुट्टी से बने भ्रूण बाएं आलिंद की प्रतिकृति। बाएं एट्रियल सेक्शन की एक प्रतिकृति दो चिमटी का उपयोग करके गाँठ अभिविन्यास और गाँठ बंद करने के चरणों को प्रशिक्षित करने और अभ्यास करने के लिए बनाई गई है। इसने हमें वास्तविक भ्रूण में इस कौशल को लागू करने से पहले कई परीक्षण करने और इन चरणों को पूरा करने की अनुमति दी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: स्टेशन की तैयारी । (ए, बी) माइक्रोसर्जरी के लिए सभी सामग्री और समाधान स्टेशन 1 और स्टेशन 2 के लिए स्वच्छ क्षेत्र में रखे गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: अंडे के कुंद छोर से एक खिड़की खोलना और बाहरी और आंतरिक झिल्ली दोनों को हटाना । (ए, बी) अंडे के छिलके पर माइक्रोसर्जिकल उपकरणों का उपयोग करके एक छोटी खिड़की खोली गई थी और एचएच 20-21 में पूरे भ्रूण को शामिल किया गया था। (सी) अंडे के छिलके के टुकड़े पहले क्रैकिंग चरण में हटा दिए गए थे। (D, E) एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली को भी माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदित किया गया था। (एफ) एलएएल प्रक्रिया पूरी होने के बाद, अंडे को पैराफिल्म की दोहरी परत के साथ कवर किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: ओवो लेफ्ट एट्रियल लिगेशन (एलएएल) सर्जरी का एक स्नैपशॉट। (ए) अपने सामान्य अभिविन्यास में चूजे के भ्रूण का पृष्ठीय दृश्य। एचएच 20-21 तक पहुंचने वाले भ्रूण वेंट्रिकल में एक आदिम सामान्य आलिंद (ए), वेंट्रिकल (वी), और बहिर्वाह पथ (ओटी) होता है। (बी) फ़्लिप, बाएं साइड-अप भ्रूण और गाँठ स्थान का एक क्लोज-अप पृष्ठीय दृश्य प्रदर्शित किया जाता है। (सी) सीवन गाँठ के साथ एलए। संक्षेप: एलए = बाएं आलिंद; एए = महाधमनी चाप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: नियंत्रण और लाल दिलों को हटाना और जांचना। एचएच 25-26 चरण तक पहुंचने वाले दोनों (ए) नियंत्रण और (बी) लाल दिल को भ्रूण से हटा दिया गया और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत जांच की गई। बार ग्राफ एलएएल समूह और नियंत्रण समूह के बीच अनुप्रस्थ हृदय व्यास में अंतर और कम से कम चार प्रतिकृतियों के औसत ± मानक विचलन (एसडी) को दर्शाता है। स्केल बार = 100 μM. (C) नियंत्रण में हृदय के ऊतकों की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा और (D) इलास्टिका वैन गिसन स्टेनिंग तकनीक का उपयोग करके लाल नमूने। बार ग्राफ एलएएल और नियंत्रण समूह के बीच मायोकार्डियल संपीड़न दिखाने के लिए सरंध्रता (%) में अंतर दिखाता है, और कम से कम दो प्रतिकृतियों के एसडी ± औसत दिखाता है। ** पी < 0.01. ग्राफपैड प्रिज्म संस्करण 9.5.1 सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। स्केल बार = 50 μM. संक्षेप: LAL = बाएं एट्रियल बंधाव; एलए = बाएं आलिंद; आरए = दाएं आलिंद; आरवी = दाएं वेंट्रिकल; एलवी = बाएं वेंट्रिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी। (A) नियंत्रण और (B) HH25-26 तक पहुंचने वाले लाल दिलों की जांच OCT द्वारा की गई थी। (C, D) वेंट्रिकल्स के लुमेन क्रॉस के आकार और लंबाई को क्रमशः पैनल (C) और (D) में दर्शाया गया है। हिस्टोग्राम कम से कम तीन दोहराव के साथ एसडी ± औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। * पी < 0.05; ** पी < 0.01; ग्राफपैड प्रिज्म संस्करण 9.5.1 सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। स्केल बार = 100 μM. संक्षेप: LAL = बाएं एट्रियल बंधाव; आरवी = दाएं वेंट्रिकल; एलवी = बाएं वेंट्रिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: एवियन भ्रूण 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33 में बाएं एट्रियल लिगेशन (एलएएल) मॉडल को नियोजित करने वाले शोध अध्ययनों की समीक्षा।
लगभग सभी पत्रों में, एलए एचएच 21 पर बंधा हुआ है। एलएएल के प्रभाव की जांच बाद के एचएच चरणों (मूल्यांकन चरण) में की जाती है। संक्षेप: एवीसी = एट्रियोवेंट्रिकुलर कुशन; एलएवी = बाएं एट्रियोवेंट्रिकुलर नहर; आरएवी = दाएं एट्रियोवेंट्रिकुलर नहर; आरए = राइट अटरिया; एलए = बाएं अटरिया; आरवी = दाएं वेंट्रिकल; एलवी = बाएं वेंट्रिकल; एसईएन = सबएंडोकार्डियम; आईवीएस = इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम; माइक्रो-सीटी = माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: एचएच 21 में बनाए गए बाएं एट्रियल लिगेशन (एलएएल) मॉडल की विशिष्ट प्रभावशीलता और एचएच 25 तक इनक्यूबेट किया गया। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो 1: एवियन भ्रूण के बाहरी और आंतरिक झिल्ली दोनों को हटा दिया जाता है। फिर, केवल विटेलिन झिल्ली को हटा दिया जाता है, जैसा कि माइक्रो कैंची का उपयोग करके दिखाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 2: चिमटी को दाईं ओर के भ्रूण के पृष्ठीय खंड के नीचे रखा जाता है और इसके बाएं एट्रियल कली को उजागर करने के लिए सावधानीपूर्वक फ्लिप किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 3: बाएं एट्रियल कली के आसपास की झिल्ली धीरे-धीरे साफ हो जाती है। एट्रियम थोड़ा फैलता है, जिससे गाँठ लगाना और बांधना संभव हो जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 4: भ्रूण के पास लगभग 0.1-0.3 मिमी लंबी सीवन को तैनात किया जाता है और दो चिमटी का उपयोग करके इसके चारों ओर कस दिया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 5: गाँठ के अतिरिक्त सीवन सिरों को सूक्ष्म कैंची का उपयोग करके सावधानीपूर्वक काटा जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 6: भ्रूण को धीरे से अपने सामान्य अभिविन्यास में वापस कर दिया जाता है। लाल पूरा हो गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एचएलएचएस में, संरचनात्मक दोषों के कारण रक्त प्रवाह बदल जाता है, जिससे बाईं ओर असामान्य आकृति विज्ञान 4,6 हो जाता है। वर्तमान मॉडल एचएलएचएस की प्रगति को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक व्यावहारिक प्रयोगात्मक प्रणाली प्रदान करता है और यहां तक कि इसके रोगजनन8 की नकल भी कर सकता है। हालांकि, पूरी तरह से चिकित्सकीय रूप से समकक्ष एचएलएचएस पशु मॉडल स्थापित करना एक चुनौतीपूर्ण कार्य है। यहां प्रस्तुत एवियन लाल मॉडल के अलावा, चूहों, भ्रूण भेड़ और मेंढकों में हाल के अध्ययनों ने एचएलएचएस रोग निदान की रूपात्मक, हेमोडायनामिक और पैथोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं को दोहराने का प्रयास किया है। चूहों के भ्रूण में, यांत्रिक लोडिंग को भ्रूण दिवस (ईडी) 14.5 (चूजा भ्रूण में लगभग एचएच 40-41) 34 पर भ्रूण के हस्तक्षेप के माध्यम से एलए में इंजेक्ट किए गए एक एम्बोलीजिंग एजेंट के माध्यम से बदल दिया जाता है। कुल 48% भ्रूण जो सकारात्मक रूप से एम्बोलीज़ किए गए थे, वे छोटे एलवी और प्रतिगामी महाधमनी प्रवाह के साथ गर्भधारण तक जीवित रहे। लंबी गर्भधारण अवधि, शुरुआती समय के बिंदुओं पर हस्तक्षेप में आगे की चुनौतियां, और चुनौतीपूर्ण भ्रूण सर्जरी इस मॉडल की व्यवहार्यता को सीमित कर सकती है। एलवी हाइपोप्लासिया को गुब्बारा कैथेटर35 के माध्यम से सिलिकॉन रबर के साथ एलए को भरकर भ्रूण के मेमने के मॉडल में भी नकल की गई थी। इस बड़े पशु मॉडल में, एलवी की मात्रा पर्याप्त रूप से कम हो जाती है, लेकिन जीवित रहने का समय लंबा नहीं होता है, जिसके परिणामस्वरूप कम रोग प्रवेश होता है। एक वैकल्पिक हस्तक्षेप दृष्टिकोण पर्क्यूटेनियस ट्रांसहेपेटिक कैथीटेराइजेशन के माध्यम से फोरमेन ओवल को रोकना है, जैसा कि भ्रूण के मेमने36 में प्रयास किया गया है, भले ही ओक्लुसिव स्टेंट को फोरमेन ओवल में निर्देशित करना बहुत चुनौतीपूर्ण है। सामान्य रूप से भेड़ मॉडल उनके पहले से मौजूद संवहनी आकृति विज्ञान और प्रतिकूल फुफ्फुसीय शरीर विज्ञान के कारण बहुत चुनौतीपूर्ण हैं। जैसे, मौसमी प्रजनन की आवश्यकता, बाद में गर्भकालीन आयु, और छोटे नमूना आकार इस मॉडल को और सीमित करते हैं। अंत में, जेनोपस भ्रूण को मानव हृदय रोग37 की नकल करने के लिए एक और सुविधाजनक मॉडल के रूप में भी पेश किया गया है, इसके तीन-कक्ष हृदय के साथ एकल वेंट्रिकल और तंत्रिका शिखा कोशिका पैटर्न में अंतर के बावजूद। पूर्ण जीनोम-स्थापित माइक्रोइंजेक्शन और माइक्रोसर्जिकल हस्तक्षेप की उपलब्धता और लंबे समय तक जीवित रहने का समय भी इस मॉडल को आकर्षक बनाता है।

पिछले अध्ययनों में, 39 संचालित एवियन भ्रूणों में से छह के रोग प्रवेश को एलएएल मॉडल34 में 15% के रूप में प्रस्तुत किया गया था। हालांकि, चूजे के भ्रूण मॉडल का औसत एचएलएचएस प्रवेश जिसे हमने प्रारंभिक चरण (एचएच 25 और एचएच 27 तक पहुंचने) में जांच की थी, 66% (18 संचालित एवियन भ्रूण में से 12) था। सेडमेरा ने बताया कि भ्रूण का औसत जीवित रहने का समय एचएच 40 (ईडी 14)19 हो सकता है। नियमित रूप से इस बंधाव को करने वाले अन्य समूहों ने शुरुआती समय बिंदुओं पर उच्च सफलता दर की सूचना दी है (उदाहरण के लिए, एचएच 29 तक 75%, एचएच 34 तक 50%, और एचएच 38 तक 20%)। हालांकि, बाद के चरणों में, एक अलग फेनोटाइप उभरता है और मृत्यु दर बढ़ जाती है। यद्यपि चूजा भ्रूण में रोग प्रवेश अपेक्षाकृत कम हो सकता है, इस मॉडल का लक्ष्य प्रसवपूर्व एचएलएचएस के एटियलजि और पैथोलॉजी की बेहतर जांच करना है, खासकर शुरुआती चरणों में।

प्रारंभिक चरण के चूजे के भ्रूण के बहुत छोटे आकार के कारण, पूर्व और पोस्टऑपरेटिव एलएएल हस्तक्षेप कई जटिलताओं को जन्म दे सकता है। संदूषण को रोकने के उपाय के रूप में, अंडे के छिलके और बेंचों को 70% इथेनॉल के साथ साफ किया जाता है, और दस्ताने का उपयोग पूरी प्रक्रिया में किया जा सकता है। एलएएल प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम पूरे पेरिकार्डियल झिल्ली को हटाना है ताकि बाएं एट्रियल कली के चारों ओर गाँठ का एक अच्छा फिट हो सके। इसके अलावा, हमने दो-व्यक्ति टीम को बेहद उपयोगी पाया है, विशेष रूप से प्रोटोकॉल चरणों के दौरान आवश्यक एक विशिष्ट कौशल सेट में प्रशिक्षण और विशेषज्ञता में। यह दृष्टिकोण प्रक्रिया और इसके सीखने की अवस्था को गति देता है। जैसे, रक्तस्राव और संदूषण का जोखिम द्वितीयक है और प्रस्तावित मित्र प्रणाली के लाभों से अधिक है। बाँझ चिक रिंगर समाधान में संग्रहीत एक पूर्व-तैयार सीवन के उपयोग की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, उच्च भ्रूण उपज के लिए सीवन की कम कसने की ताकत बनाए रखना भी महत्वपूर्ण है। एचएच 21 में लागू एट्रियल कली पर तंग गांठ एलवी की समयपूर्व विफलता का कारण बन सकती है जो चालन, कोरोनरी और माध्यमिक मायोआर्किटेक्चर रीमॉडेलिंग दोषों के नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण जुड़ाव को विस्तृत करने में असमर्थ है, जिसेपिछले अध्ययनों में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। विशेष रूप से, कुछ चरणों में बेहतरीन और अप्रयुक्त चिमटी और कैंची का उपयोग करना और दूसरों पर अपेक्षाकृत कुंद लोगों का उपयोग आकस्मिक रक्तस्राव को कम कर सकता है। अंत में, गाँठ के पूरा होने के तुरंत बाद, भ्रूण को तेजी से अपनी मूल स्थिति में बदल दिया जाना चाहिए, और अंडे की खिड़की को इसके तापमान और आर्द्रता को संरक्षित करने के लिए पैराफिल्म की दोहरी परत के साथ बंद कर दिया जाना चाहिए। एचएच 25 तक पहुंचने वाले एलएएल मॉडल के लिए विशिष्ट उपज तालिका 2 में प्रस्तुत की गई है। वेंट्रिकुलर आकार में कमी के अलावा, वाल्वुलर विकृतियां भी विकसित हो सकती हैं, जैसे कि माइट्रल / महाधमनी एट्रेसिया। इन घावों की गंभीरता बाद के चरणों में रुग्णता को बढ़ाती है, जैसा कि एचएलएचएस में होता है। यहां चर्चा की गई चुनौतियों के कारण, चूजा भ्रूण में किए गए अन्य यांत्रिक हस्तक्षेपों की तुलना में, जैसे कि कोनोट्रंकल बैंडिंग, एलएएल मॉडल के परिणामस्वरूप बहुत कम उपज का स्तर होता है। हमारा मानना है, यहां प्रस्तुत सावधानियों के माध्यम से, 50% उपज प्राप्त करने योग्य है।

एवियन भ्रूण अपनी रूपात्मक संरचना, आकार, कम लागत, संस्कृति में आसानी और हेरफेर38,39 के कारण कार्डियोवैस्कुलर विकास पर शोध के लिए एक आदर्श कशेरुक पशु मॉडल है। यह मॉडल रोगजनकों40 के खिलाफ प्राकृतिक सुरक्षा भी प्रदान करता है। इंस्ट्रूमेंटेड भ्रूण का उपयोग विवो इमेजिंग और स्थानीय सीआरएनए हेरफेर में उन्नत में किया जा सकता है। इस प्रकार, मानव और चिकन के संरक्षित जीन क्षेत्र सेंगर शॉटगन अनुक्रमण और भौतिक-आधारित मानचित्रण39 के माध्यम से उपलब्ध हैं, जिससे उन्नत मेकेनोसेंसिटिव अध्ययन19 हो सकते हैं। इसके अलावा, क्रेजी एट अल द्वारा लागू माइक्रोएरे दृष्टिकोण का उपयोग मायोकार्डियल संरचना में हेमोडायनामिक परिवर्तनों की संभावित रिवर्सबिलिटी के बारे में सफलता को मापने के लिए किया गया है। इस प्रकार, बाएं और दाएं वेंट्रिकल के बीच अलग-अलग व्यक्त जीन की पहचान को हस्तक्षेप की आदर्श अवधि के लिए एक मानदंड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब अपरिवर्तनीयपरिवर्तन शुरू होते हैं।

निष्कर्ष में, चूजा भ्रूण मॉडल में माइक्रोसर्जिकल अनुप्रयोगों के लिए संभावित भविष्य की दिशाओं में विशिष्ट मैट्रिक्स जीन और आणविक सिग्नलिंग मार्गों पर ध्यान केंद्रित करने वाली कार्डियोवैस्कुलर जीन संपादन तकनीकों का उपयोग शामिल है, जो ऊतक-कोशिका संस्कृति औरइमेजिंग प्रौद्योगिकियों में प्रगति का समर्थन करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम धन प्रदान करने वाले तुबीटक 2247 ए प्रमुख शोधकर्ता पुरस्कार 120 सी 139 को स्वीकार करते हैं। लेखक पाकतावुक गिडा को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। ए.एस., इस्तांबुल, तुर्की, उपजाऊ अंडे प्रदान करने और कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान का समर्थन करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 nylon surgical suture Ethicon
Elastica van Gieson staining kit Sigma-Aldrich 115974 For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute Interlab 64-17-5 For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A AZYSS600-110
Kimwipes Interlab 080.65.002
Microscissors World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 555640S Vannas STR 82 mm
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793-1EA Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk Leica Biosystems  39602012 Tissue embedding medium
Stereo Microscope Zeiss Stemi 508  Stemi 508 Used at station 1
Stereo Microscope Zeiss Stemi 2000-C Stemi 2000-C Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) Adumont & Fils, Switzerland Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)  World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 501985 Used to remove the membranes on the embryo

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बाएं एट्रियल बंधाव एवियन भ्रूण परिवर्तित हेमोडायनामिक लोडिंग प्रारंभिक संवहनी विकास कार्डियोवैस्कुलर विकास जन्मजात हृदय दोष यांत्रिक हस्तक्षेप बाएं विटेलिन नस बंधाव कोनोट्रंकल बैंडिंग ओवो एलएएल में हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम एचएलएचएस माइक्रोसर्जिकल ऑपरेशन नमूना पैदावार रोगजनन प्रोटोकॉल
प्रारंभिक संवहनी विकास के दौरान परिवर्तित हेमोडायनामिक लोडिंग के लिए एक मॉडल के रूप में एवियन भ्रूण में बाएं एट्रियल लिगेशन
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Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas,… More

Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas, F., Pekkan, K. Left Atrial Ligation in the Avian Embryo as a Model for Altered Hemodynamic Loading During Early Vascular Development. J. Vis. Exp. (196), e65330, doi:10.3791/65330 (2023).

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