Summary
ここでは、鳥類の胚で左心房結紮(LAL)モデルを実行するための詳細なビジュアルプロトコルを紹介します。LALモデルは、心臓内の流れを変化させ、壁のせん断応力負荷を変化させ、左心低形成症候群を模倣します。この困難なマイクロサージェリーモデルの課題を克服するためのアプローチが提示されます。
Abstract
鳥類の胚は、その4室の成熟した心室構成、培養の容易さ、画像アクセス、および効率性により、心血管の発達を研究するための脊椎動物モデルとして好まれています。正常な発達と先天性心疾患の予後を理解することを目的とした研究では、このモデルが広く採用されています。顕微鏡手術技術を導入して、特定の胚の時点で通常の機械的負荷パターンを変更し、下流の分子および遺伝子カスケードを追跡します。最も一般的な機械的介入は、左硝子体静脈結紮術、コノトランカルバンディング、および左心房結紮術(LAL)であり、血流による壁内血管圧と壁面せん断応力を調節します。LALは、特に ovoで実施された場合、最も困難な介入であり、非常に細かい逐次顕微鏡手術のために非常に小さなサンプル収量があります。その高いリスクにもかかわらず、 卵子では 、低形成性左心症候群(HLHS)の病因を模倣するため、科学的に非常に価値があります。HLHSは、ヒトの新生児に見られる臨床的に関連性のある複雑な先天性心疾患です。 in ovo LALの詳細なプロトコルは、この論文に記載されています。簡単に説明すると、受精した鳥類の胚は、通常、ハンバーガー・ハミルトン(HH)ステージ20〜21に達するまで、37.5°C、60%の一定湿度でインキュベートされました。卵の殻を割って開き、外膜と内膜を取り除きました。胚を緩やかに回転させて、総心房の左心房球を露出させた。10-0ナイロン縫合糸から事前に組み立てられたマイクロノットを静かに配置し、左心房芽の周りに結びました。最後に、胚を元の位置に戻して、LALが完成しました。正常心室とLALで計装された心室は、組織の圧縮に統計学的に有意な差を示しました。効率的なLALモデル生成パイプラインは、心血管コンポーネントの胚発生中の同期した機械的および遺伝的操作に焦点を当てた研究に貢献します。同様に、このモデルは、組織培養研究と血管生物学のための摂動細胞源を提供します。
Introduction
先天性心疾患(CHD)は、胚発生の異常によって起こる構造的疾患です1。遺伝的状態に加えて、病因は機械的負荷の変化の影響を受けます2,3。先天性心疾患である左心低形成症候群(HLHS)は、出生時に心室/大動脈が未発達になり4、死亡率が高い5,6。その臨床管理の最近の進歩にもかかわらず、HLHSの血管の成長と発達のダイナミクスはまだ不明です7。正常な胚発生では、左心室(LV)心内膜および心筋は、初期胚性心臓管形成が進行するにつれて心臓前駆細胞に由来する。心筋線維柱帯、肥厚層、および心筋細胞増殖の段階的な存在が報告されています2。HLHSでは、線維柱帯リモデリングの変化と左心室の平坦化が観察され、異常な心筋細胞の移動による心筋形成不全にさらに寄与します2,8,9,10
心臓の発達を研究し、血行動態を理解するために広く使用されているモデル生物11の中で、鳥類の胚は、その4室の成熟した心臓と培養の容易さのために好まれています11,12,13,14。一方、ゼブラフィッシュの胚とトランスジェニック/ノックアウトマウスの高度なイメージングアクセスには、明確な利点があります11,12。鳥類の胚に対して、心血管成分の発達における壁内圧と壁せん断応力を変化させるさまざまな機械的介入がテストされています。これらのモデルには、左硝子体結紮術、コノトランカルバンディング15、および左心房結紮術(LAL)11,12,16が含まれます。機械的負荷の変化による結果の表現型は、早期予後に焦点を当てた研究における外科的介入の約24〜48時間後に観察できます11,13。LAL介入は、房室開口部の周囲に縫合糸ループを配置することにより、左心房(LA)の機能容積を狭める一般的な技術です。同様に、右心房結紮術(RAL)を標的とする顕微外科的介入も行われている17,18。同様に、一部の研究者は、LA19,20の体積を減らすために、マイクロクリップを使用して左心耳(LAA)を標的としています。いくつかの研究では、外科用ナイロン糸が房室リンパ節19,21に適用される。使用される介入の 1 つは LAL で、HLHS を模倣できますが、非常に細かい顕微鏡手術が必要なため、サンプル収量が非常に少ないため、実行が最も難しいモデルでもあります。私たちの研究室では、LALはハンバーガーハミルトン(HH)ステージ20と21の間の卵子で行われ、総心房が完全に中隔6,14,22,23になる前です。LAの周囲に外科的縫合糸を配置し、心臓内血流を変化させます。HLHSのLALモデルでは、心室壁の剛性の増加、筋線維の角度の変化、およびLV腔サイズの減少が観察されます14,24。
このビデオ記事では、 in ovo LALの詳細なプロトコルとアプローチが提供されています。簡単に言うと、受精した鳥類の胚を顕微鏡手術のためにインキュベートし、卵殻を割って開き、外膜と内膜をきれいにしました。その後、胚をゆっくりと回転させて、LAにアクセスできるようにしました。10-0ナイロン製の外科的縫合糸を心房芽に結び付け、胚を元の向きに戻して、LAL手順25を完了しました。LALと正常心室は、光干渉断層撮影法と基本的な組織学 を介して 、組織の圧縮と心室容積について比較されます。
本稿で説明したように、LALモデルパイプラインの運用に成功すれば、心血管系成分の胚発生に焦点を当てた基礎研究に貢献することが期待されます。このモデルは、遺伝子操作や高度なイメージングモダリティと組み合わせて使用することもできます。同様に、急性LALモデルは、組織培養実験のための病変血管細胞の安定した供給源です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
受精可能な白いレグホーンの卵は、信頼できるサプライヤーから入手し、大学が承認したガイドラインに従って孵化させます。ニワトリ胚、ステージ18(3日目)から24日目(4日目)(この論文で提示されたステージ)は、欧州連合(EU)指令2010/63 / EUおよび米国の施設動物管理および使用委員会(IACUC)ガイドラインでは生きた脊椎動物とは見なされません。ニワトリの胚は、米国の法律では孵化19日目以降に「生きた動物」とみなされますが、EUではそうではありません。各卵には孵化開始日が記載されており、孵化の10日目 までに孵化する予定です。卵が孵化した後、ひよこは孵卵器から取り出されます。このプロトコルは、2つのベンチトップ操作ステーション(ステーション1とステーション2)で実行され、特殊なモデル生成段階に焦点を当てています。
1.マイクロサージェリー前の準備
- 受精卵は、特定の病原体フリー(SPF)グレードのワクチン開発センターから、または信頼できる商業サプライヤーの農場を通じて、乾燥したポリスチレン容器に入った壊れやすい宅配便業者で入手してください。インキュベーションする前に、70%エタノールに浸した糸くずの出ないワイプで卵殻をやさしく洗浄し、汚染を取り除きます。
- 胚の包含/除外基準
- 輸送中にひびが入ったり損傷したりした卵は孵化させないでください。
- LAL手順中または再インキュベーション後に出血が認められた場合は、胚を使用しないでください。
- 血行動態の血流が通常の向きと異なる可能性があるため、左側を上にした状態で発育する胚は使用しないでください。
- 術前と術後の両方の処置で先天性欠損を伴うDıscard胚。
- HLHSをLALモデルとして模倣して、元の場所で発育する標的段階に達した胚を含めます。
- 受精したホワイトレグホーンニワトリ卵(Gallus gallus domesticus L.)を、平滑な末端で、通常はHH20-2115 (37.5°C、湿度60%、3.5日)で目的の段階までインキュベートします(図1)。
注意: 収量を増やすには、卵を一定の温度と湿度に保つことが重要です。インキュベーターのモデルによっては、蒸留水で満たされた鍋を追加すると、安定した湿度が維持されます。ほとんどのインキュベーターに適合する追加/補助の温度および湿度制御システムの青写真は、著者によって開発され、推奨されています。この自社製のセンサ/制御ユニットの電子回路、ハードウェア、およびコードの詳細は、データリポジトリ26で提供されます。孵化中に卵を穏やかに振る(回転させる)ことで、胚の最適な配置が可能になり、「手術可能な」胚の割合が高くなる可能性があります。振とうは、この容量を持つインキュベーターでも機能し、生産性をさらに向上させることができます。 - 手順を開始する前に、緩いオーバーハンドノットを長さ1.5cmの10-0縫合糸に結び付けて、必要な数の結び目を準備します。結び目がきつくなく、手術中に心房に簡単にフィットするのに十分な大きさであることを確認してください(図2)。
注意: 事前に結び目を結び、使用する前に滅菌ひよこリンガー溶液に保管してください。結び目を作る作業では、ピンセットを同期して操作するために両手を使用する必要があります。これはプロトコルの重要な段階であるため、このステップを練習するためのパテから心房のモデルを作成できます(図3)。これにより、ステーション 2 でステップ 3.2.3 を実行するために必要な 3 次元マイクロサージェリーのスキルが向上します (図 4)。
2. ステーション1での運用(図4A)
- 卵の鈍い端から窓を開け、外膜と内膜の両方を除去する15(図5A-D)。
- ピンセットの裏側で軽く割って卵の殻を開き、自由な指で卵をしっかりと支えて、不要な亀裂の伝播を減らします。
- LALは長時間の処置であるため、心拍数は温度に依存するため、胚の温度と湿度を温存してください。したがって、最初のシェルウィンドウは、操作を実行するのに十分な大きさで、できるだけ小さく作成してください。
注:動作中に湿度または温度制御システムは採用されませんが、これらのシステムがあれば、歩留まりが向上します。可能であれば、ラボの空調システムをシャットダウンし、可能な限り高い室温(RT)で手順を実行します。手術中の胎児の心拍数は、温度によって制御できる最適化も推奨されます。一部の検査室では、LAL操作中に温度制御 により 、心拍数を120bpmよりわずかに低いレートに維持しています。そのため、手術部位の周囲で湿度をコントロールすることで、歩留まりをさらに高めることができます。卵殻の窓はできるだけ小さく、外科手術が入るのに十分な大きさになっています。これは厚い外膜にも当てはまり、通常、卵殻よりも小さいのは胚の円周の範囲だけです。これらは、胚の温度と湿度を維持することを保証します。卵の鈍い端から窓を開けながら、小さな殻の破片を洗浄して、これらの破片が硝子体の血管の完全性を損なったり、不要なアーチファクトを引き起こしたりしないようにします。また、他の研究室では、湾曲したマイクロセレーションハサミを使って窓を作っています。また、2幅のセロハンテープを使用して卵殻を安定させ、ひび割れを抑えることができます。 - 必要なビテリン膜だけをマイクロハサミで除去します(補足動画1)。
- 正常な胚発生は右側を上にしています。胚が硝子膜から解放されたら、先端が閉じたピンセットを胚の背側部分の下に置き、胚を静かに裏返して左側を露出させます(つまり、左側を上にした構成)(図6A、B; 補足動画2)。
- 左心房芽が露出しているが、通常は心膜の二重層からなる複雑な膜システムで覆われていることを確認します。
- 心房芽の周りの膜を、細かいものも含めてすぐに取り除きます。これも重要な段階です。粗い膜から膜を取り除き、左心房芽の周りの細かい膜へと進みます。細かい膜を除去するために、最高級のピンセットを予約します(補足ビデオ3)。
- 膜除去プロセス中に、胚を左側を上にした位置に向け、ステップ3.2の結び目配置操作をそれ以上の再配置なしで実行できるようにします。これを行うには、ステップ2.6のメンブレンを使用して胚を持ち上げ、左側が上を向くように卵殻から吊るします。
注:一部の胚は卵殻の周辺部の近くに配置でき、操作が困難な場合があります。それでも、これらの胚は右側を上に向け、正常な行動を示す可能性が高く、研究に含めることができます。このような場合、必要に応じて、#4の細いピンセットで心膜を優しく洗浄し、卵殻を逆方向(殻の開口部に向かって)取り除くことで、不明瞭な心房にアクセスしやすくすることができます。これらの胚は、胚外膜の一部を使用して持ち上げ、膜の一端(ピンセットの端)を卵殻に取り付けることによって、その自然な粘着性を利用して目的の位置に固定することもできます。さらに、胚の頭部と脊髄領域の間の空間は、ピンセットの助けを借りて拡張し、不明瞭な心房を明らかにすることができます。
3. ステーション2での運用(図4B)
- 実体顕微鏡下で、ステップ1.4で事前に準備した結び目を、アクセス可能な場所の胚の近くに配置します(図6B)。これで、心房芽を縛る準備が整いました(補足動画4)。
- 事前に準備したオープンノットを取り出し、左心房芽に向けます。LALを機能させるには、卵を独自の傾斜した3次元方向に置きます。
- 胚を傷つけずに締め付けプロセスを実行するために、結び目を正しく向けます。
- ステップ2.7で微細な膜を最適に除去し、心臓の鼓動の影響を軽減します。
- 縫合糸を締めます(図6C)。このステップでは、パテで練習すると非常に便利です。偽胚の場合は、結び目を保持するのに十分なだけ結び目を締めます。
- 次に、マイクロハサミを使用して、縫合糸の余分な端をつぼみにできるだけ近づけて切ります(補足ビデオ5)。
- 結ばれた縫合糸の新しく切断された端が、回転中または心拍のために近くの血管に穴を開ける位置にないように十分に注意してください。
- ピンセットを使用して、手順3.3で切り取った余分な縫合糸片を取り除きます。
- 最後に、閉じたピンセットを使用して、ステップ2.5(補足ビデオ6)のように、胚を元の位置に戻します。
- LALプロセスが完了したら、卵をパラフィルムの二重層で覆い、再度インキュベートします。卵をしっかりと無菌で閉じることは、特に孵化の24時間以降の生存にとって最も重要です。目視でもアクセスしたい場合は、スライドガラスにパラフィンワックスを使用してください。
注:初期胚期が研究されているように、卵は通常、約HH25またはHH27に達するまで24〜48時間孵化します。しかし、限界はなく、他の研究者が試みたように、後の段階を研究することができます。操作速度を速くするには、少なくとも2人のチームをお勧めします。1人は、左心房芽の周りの卵の開卵、最初の膜のクリーンアップ、回転、および膜のクリーンアップの訓練を受け、責任を負う必要があります。相手は、最初の結び目の準備、結び目の配置、締め付けのみを担当します。最終胚の回転は、人1が行うことができる。単一の胚の外科手術には約4〜5分かかります。 - 外科手術の前後に、ベンチトップの表面と器具をエタノールで洗浄してください。新鮮なひよこリンガー溶液(NaCl、KCl、CaCl2、およびNaHCO3)16,27を、胚組織に触れる金属器具に必ず適用してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
高度な時間分解イメージング技術を使用して、LAL介入による構造的および形態学的変化を観察することができる10。さらに、LAL試料は分子生物学的方法にも従順である19,28。表1に、LALモデルの結果を採用したサンプル研究が提供されています。これに関連して、LAL介入はHH20-21に達したニワトリ胚で行われました。対照(健常)心臓とLAL心臓の両方がHH25-26で胚から除去された。次に、サンプルを4°Cの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定しました6,15。次に、除去した心臓サンプルを、濃度を上昇させたエタノール溶液(70%、96%、および100%)でそれぞれ1時間脱水しました。最後に、サンプルを室温でキシレン中に0.5時間保持し、パラフィン包埋を行った後、厚さ10 μmで切片化しました。スライドガラスに移されたサンプルは、Elastica van Gieson染色で染色されました。切片を実体顕微鏡で検査し、心室の横径を測定した。また、一部のサンプルでは、3次元非侵襲的方法である光干渉断層撮影スキャン(OCT)を実施しました11,29。HH25-26の対照心臓とLAL心臓の両方を切除し、それらの交差内腔径をOCTで測定した。
その結果、LALでは、正常な発達と比較して、形態学的に有意な変化を伴い、よりコンパクトな心筋構造が達成されることが示されました(図7)。さらに、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の沈着が心臓間質の周囲に観察され、HLHS30に類似した心筋線維症に類似している。心筋の肥厚と海綿の圧迫をよりよく理解するために、対照標本とLAL標本の両方で形態測定の空隙率測定を実施しました。予想通り、LAL介入により、左心室腔が小さくなり、小柱間くぼみが引き締まることにより、小柱が圧迫されました。これらの発見は、LALが健康な心室構造を変化させ、小柱の側面を再配向するという仮説を裏付けている22。同様に、HH29のLALモデルは、右心室腔の拡大、小柱構造の変化、および心筋容積をもたらしました24。
この研究で得られた結果を裏付けるために、OCTイメージングを使用して心室内腔の断面積と眼軸長を測定しました(図8)。LALは、対照群と比較して左心室の大きさと直径の有意な縮小を示した。ここでは心室のみに焦点を当てていますが、大動脈弓の発達に対するLALの影響も報告されています31。私たちが貢献した最近の研究では、HH2532でLAL後に両方の心室で中壁心筋の緊張が増加したことが3Dで報告されました。さらに、LAL群はHH25で対照群と比較して肉厚の増加を示した。この研究は、HH27でLAL LVの収縮期心外膜円周ひずみのピークが有意に増加したことを実証したTobitaらによる以前の研究と一致しています27。
図1:胚成長のためのインキュベーションシステム。 受精した白いレグホーン鶏の卵(Gallus gallus)を、一定の湿度(60%)および温度(37.5°C)のインキュベーターで孵化させた。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:LALノットの準備。 直径0.5~1mm、長さ1-2cmの複数の結び目が、10-0ナイロンの外科用縫合糸を使用して準備されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:パテで作られた胎児期の左心房のレプリカ。 左心房セクションのレプリカが作成され、2本のピンセットを使用して結び目の向きと結び目閉鎖の手順をトレーニングおよび練習します。これにより、実際の胚にこのスキルを実装する前に、多くの試行錯誤を行い、これらのステップを完成させることができました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ステーションの準備 。 (A,B) マイクロサージェリー用のすべての材料と溶液は、ステーション 1 とステーション 2 のクリーン エリアに配置されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:卵の鈍い端から窓を開け、外膜と内膜の両方を除去 する。 (A,B)卵殻にマイクロサージェリー器具を使用して小さな窓を開き、HH20-21の胚全体を含めました。(C)卵殻の破片は、最初の割れステップで除去されました。(D、E)胚外膜も顕微鏡で解剖した。(F)LALプロセスが完了した後、卵をパラフィルムの二重層で覆った。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:卵子内左心房結紮術(LAL)手術のスナップショット。 (A)ニワトリ胚の正体方向の背側図。HH20-21に達する胎児性心室は、原始的な共通心房(a)、心室(v)、および流出路(ot)を有する。(B)ひっくり返した左側を上にした胚と結び目の位置をクローズアップした背側図を表示する。(C)縫合糸の結び目のあるLA。略語:LA =左心房;AA = 大動脈弓。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:コントロール心臓とLAL心臓の除去と検査。 HH25-26期に達した(A)対照心臓と(B)LAL心臓の両方を胚から取り出し、実体顕微鏡で調べた。棒グラフは、LAL群と対照群の間の心臓横径の差と、少なくとも4回の反復の平均±標準偏差(SD)を示しています。スケールバー = 100 μM。 Elastica van Gieson染色技術を使用した(C)コントロールおよび(D)LALサンプル中の心臓組織の組織学的検査。棒グラフは、LAL群と対照群の間の心筋圧迫を示す空隙率(%)の差と、少なくとも2回の反復の平均±SDを示しています。**p < 0.01 です。統計解析にはGraphPad Prismバージョン9.5.1を使用しました。スケールバー = 50 μM。 略語: LAL = 左心房結紮術;LA =左心房;RA = 右心房;RV = 右心室;LV = 左心室。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:光干渉断層撮影。HH25-26に達する(A)コントロール心臓と(B)LAL心臓の両方をOCTで調べた。 (C、D)心室の内腔交差のサイズと長さは、それぞれパネル(C)と(D)に示されています。ヒストグラムは、少なくとも 3 回の繰り返しがある平均 ± SD を表します。*p < 0.05;**p < 0.01;統計解析にはGraphPad Prismバージョン9.5.1を使用しました。スケールバー = 100 μM。 略語: LAL = 左心房結紮術;RV = 右心室;LV = 左心室。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:鳥類胚6,10,12,14,22,24,27,30,32,33に左心房結紮(LAL)モデルを採用した調査研究のレビュー。
ほとんどすべての論文で、LAはHH21で結ばれています。LALの効果は、後のHH段階(評価段階)で調査されます。略語:AVC =房室クッション;LAV = 左房室管;RAV = 右房室管;RA =右心房;LA =左心房;RV = 右心室;LV = 左心室;SEN = 心内膜下;IVS = 心室中隔;マイクロCT=マイクロコンピュータ断層撮影。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:HH21で作成され、HH25までインキュベートされた左心房結紮(LAL)モデルの典型的な有効性。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画1:鳥類胚の外膜と内膜の両方を切除する。次に、マイクロハサミを使用して示すように、ビテリン膜のみを除去します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画2:ピンセットを右側を上にした胚の背側部分の下に置き、慎重に裏返して左の心房芽を露出させます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画3:左心房芽の周りの膜が徐々にきれいになります。吹き抜けが少し広がり、結び目の配置や結び方が可能になりました。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ4:長さ約0.1〜0.3mmの縫合糸を胚の近くに配置し、2本のピンセットを使用して胚の周りを締めます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画5:結び目の余分な縫合糸の端をマイクロハサミで丁寧にカットします。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画6:胚をゆっくりと正常な向きに戻す。LALが完成しました。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HLHSでは、構造的欠陥により血流が変化し、左側に異常な形態が生じます4,6。本モデルは、HLHSの進行をよりよく理解するための実用的な実験システムを提供し、その病因を模倣することさえできるかもしれません8。しかし、完全に臨床的に同等のHLHS動物モデルを確立することは困難な作業です。ここで紹介した鳥類のLALモデルに加えて、マウス、ヒツジ胎児、およびカエルを用いた最近の研究では、HLHS予後の形態学的、血行動態的、および病態生理学的特徴の再現が試みられています。マウスの胚では、胚発生日(ED)14.5(ニワトリ胚では約HH40-41)の胎児介入によりLAに注入された塞栓剤によって機械的負荷が変化する34。陽性塞栓術を受けた胎児の48%は、小さなLVと逆行性大動脈の流れで妊娠まで生存した。妊娠期間が長いこと、早期の時点での介入がさらに困難であること、および胎児手術が困難であることから、このモデルの実現可能性は限られている。LV形成不全は、バルーンカテーテル35を通してLAをシリコーンゴムで満たすことによって、胎児の子羊モデルでも模倣された。この大型動物モデルでは、LV体積は十分に減少しますが、生存期間が長くないため、疾患の浸透性が低くなります。別の介入アプローチは、胎児の子羊で試みられたように、経皮的経肝カテーテル法を介して卵孔を閉塞することです36、閉塞性ステントを卵孔に向けることは非常に困難ですが。一般的にヒツジのモデルは、既存の血管形態と有害な肺生理機能のために非常に困難です。そのため、季節的な繁殖の必要性、在胎週数の遅さ、およびサンプルサイズの小ささが、このモデルをさらに制限します。最後に、Xenopus胚は、単一の心室を持つ3室の心臓と神経堤細胞パターンの違いにもかかわらず、ヒトの心臓病を模倣するための別の便利なモデルとして紹介されています37。また、フルゲノムで確立されたマイクロインジェクションやマイクロサージェリーによる介入が可能であることや、生存期間が長いことも、このモデルを魅力的なものにしています。
以前の研究では、手術された39羽の鳥類胚のうち6羽の疾患浸透率は、LALモデル34で15%と提示された。しかし、初期段階(HH25およびHH27に達する)で調査したニワトリ胚モデルの平均HLHS浸透率は66%(手術された鳥類胚18個中12個)でした。Sedmera教授は、胚の平均生存期間がHH40(ED14)である可能性があると報告しました19。このライゲーションを定期的に実施している他のグループは、初期の時点で高い成功率を報告しています(例えば、HH29まで75%、HH34まで50%、HH38まで20%)30。しかし、後の段階では、明確な表現型が現れ、死亡率が増加します。ニワトリ胚では疾患の浸透率が比較的低い可能性がありますが、このモデルの目標は、特に初期段階での出生前HLHSの病因と病理をよりよく調べることです。
初期段階のニワトリ胚のサイズが非常に小さいため、術前および術後のLAL介入はいくつかの合併症を引き起こす可能性があります。汚染を防ぐための救済策として、卵殻とベンチは70%エタノールで洗浄され、手順全体を通して手袋を使用できます。LALプロトコルの重要なステップは、左心房芽の周りの結び目がうまくフィットするように心膜全体を除去することです。さらに、2人のチームは、特にプロトコルのステップで必要な特定のスキルセットをトレーニングし、専門化する上で非常に役立つことがわかりました。このアプローチにより、手順とその学習曲線がスピードアップします。そのため、出血や汚染のリスクは二次的なものであり、提案されたバディシステムの利点を上回ります。滅菌ひよこリンガー溶液に保存された事前に準備された縫合糸の使用が推奨されます。さらに、縫合糸の締め付け強度を低く維持することも、胚の収量を増やすために重要です。HH21で適用された心房芽の結び目がきつくなると、LVの早期障害につながる可能性があります 以前の研究でよく説明されている伝導、冠状動脈、および二次筋構造リモデリング欠陥の臨床的に重要な関与を詳述することはできません22。具体的には、細い未使用のピンセットとハサミを特定のステップで使用し、比較的鈍いステップを使用すると、偶発的な出血を減らすことができます。最後に、結び目が完成した直後に、胚を元の位置にすばやく回転させ、卵殻の窓をパラフィルムの二重層で閉じて、温度と湿度を維持する必要があります。HH25に達するLALモデルの典型的な収率を 表2に示します。心室サイズの減少に加えて、僧帽弁/大動脈閉鎖症などの弁膜奇形も発症する可能性があります。これらの病変の重症度は、HLHSのように、後の段階で罹患率を増加させます。ここで論じた課題のため、ニワトリ胚で行われる他の機械的介入(コノトランカルバンディングなど)と比較して、LALモデルははるかに低い収量レベルをもたらします。ここで紹介した予防策により、50%の利回りは達成可能であると考えています。
鳥類の胚は、その形態学的構造、サイズ、低コスト、培養の容易さ、および操作のために、心血管の発達を研究するための理想的な脊椎動物モデルです38,39。このモデルは、病原体に対する自然な保護も提供します40。インストゥルメント化された胚は、高度なin vivoイメージングや局所siRNA操作に利用できます。このように、ヒトとニワトリの保存された遺伝子領域は、サンガーショットガンシーケンシングと物理ベースのマッピング39を通じて利用可能であり、高度な機械感受性研究19につながります。さらに、Krejčíらによって適用されたマイクロアレイアプローチは、心筋構造における血行動態の変化の潜在的な可逆性に関する成功を測定するために使用されています。したがって、左心室と右心室の間で差動的に発現する遺伝子の同定は、不可逆的な変化が始まる介入の理想的な期間の基準として使用することができる33。
結論として、ニワトリ胚モデルにおける顕微外科的応用の潜在的な将来の方向性には、特定のマトリックス遺伝子と分子シグナル伝達経路に焦点を当てた心血管遺伝子編集技術の使用が含まれ、組織細胞培養およびイメージング技術の進歩を支えている32。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
Tubitak 2247A主任研究者賞120C139に資金提供をいただいたことに感謝いたします。また、PakTavuk Gıda氏にも感謝の意を表します。A. S., Istanbul, Turkey, 受精卵の提供と心臓血管研究の支援
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D.
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
