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Developmental Biology

Ligadura auricular izquierda en embrión aviar como modelo de carga hemodinámica alterada durante el desarrollo vascular temprano

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65330
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences and Engineering, Koc University, 2Department of Mechanical Engineering, Koc University
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo visual detallado para ejecutar el modelo de ligadura auricular izquierda (LAL) en el embrión aviar. El modelo LAL altera el flujo intracardíaco, lo que cambia la carga de tensión de cizallamiento de la pared, imitando el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico. Se presenta un enfoque para superar los desafíos de este difícil modelo de microcirugía.

Abstract

Debido a su configuración ventricular madura de cuatro cámaras, facilidad de cultivo, acceso a imágenes y eficiencia, el embrión aviar es un modelo animal vertebrado preferido para estudiar el desarrollo cardiovascular. Los estudios que tienen como objetivo comprender el desarrollo normal y el pronóstico de las cardiopatías congénitas adoptan ampliamente este modelo. Se introducen técnicas quirúrgicas microscópicas para alterar los patrones normales de carga mecánica en un punto de tiempo embrionario específico y rastrear la cascada molecular y genética posterior. Las intervenciones mecánicas más comunes son la ligadura de la vena vitelina izquierda, la banda conotruncal y la ligadura auricular izquierda (LAL), modulando la presión vascular intramural y el esfuerzo de cizallamiento de la pared debido al flujo sanguíneo. La LAL, especialmente si se realiza en ovo, es la intervención más difícil, con rendimientos de muestra muy pequeños debido a las operaciones microquirúrgicas secuenciales extremadamente finas. A pesar de su alto riesgo, el LAL in ovo es muy valioso científicamente, ya que imita la patogénesis del síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS). La HLHS es una cardiopatía congénita compleja clínicamente relevante que se observa en recién nacidos humanos. En este documento se documenta un protocolo detallado para la LAL in ovo . Brevemente, los embriones aviares fertilizados se incubaron a 37,5 °C y 60% de humedad constante, por lo general, hasta que alcanzaron las etapas 20 a 21 de Hamburger-Hamilton (HH). Las cáscaras de huevo se abrieron y se quitaron las membranas externas e internas. El embrión se rotó suavemente para exponer el bulbo auricular izquierdo de la aurícula común. Los micronudos preensamblados de suturas de nailon 10-0 se colocaron suavemente y se ataron alrededor de la yema auricular izquierda. Finalmente, el embrión fue devuelto a su posición original y se completó la LAL. Los ventrículos normales e instrumentados por LAL demostraron diferencias estadísticamente significativas en la compactación tisular. Una línea eficiente de generación de modelos LAL contribuiría a los estudios centrados en la manipulación mecánica y genética sincronizada durante el desarrollo embrionario de los componentes cardiovasculares. Del mismo modo, este modelo proporcionará una fuente celular perturbada para la investigación de cultivos de tejidos y biología vascular.

Introduction

Los defectos cardíacos congénitos (CC) son trastornos estructurales que ocurren debido a un desarrollo embrionario anormal1. Además de las condiciones genéticas, la patogenia está influenciada por la alteración de la carga mecánica 2,3. El síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS), una cardiopatía congénita, da lugar a un ventrículo/aorta subdesarrollado al nacer4 con una alta tasa de mortalidad 5,6. A pesar de los recientes avances en su manejo clínico, la dinámica de crecimiento y desarrollo vascular del HLHS aún no está clara7. En el desarrollo embrionario normal, el endocardio y el miocardio del ventrículo izquierdo (VI) se originan a partir de progenitores cardíacos a medida que avanza la formación temprana del tubo cardíaco embrionario. Se reporta la presencia gradual de trabeculación miocárdica, engrosamiento de capas y proliferación de cardiomiocitos2. Para el HLHS, se observa alteración del remodelado trabecular y aplanamiento del ventrículo izquierdo, lo que contribuye aún más a la hipoplasia miocárdica debido a la migración anormal de los cardiomiocitos 2,8,9,10

Entre los organismos modelo ampliamente utilizados para estudiar el desarrollo del corazón y comprender las condiciones hemodinámicas 11, se prefiere el embrión aviar debido a su corazón maduro de cuatro cámaras y su facilidad de cultivo11,12,13,14. Por otro lado, el acceso avanzado a la obtención de imágenes de embriones de pez cebra y ratones transgénicos/knockout proporciona claras ventajas11,12. Se han probado varias intervenciones mecánicas para el embrión aviar que alteran la presión intramural y el estrés de cizallamiento de la pared en el desarrollo de componentes cardiovasculares. Estos modelos incluyen la ligadura vitelina izquierda, la banda conotruncal15 y la ligadura auricular izquierda (LAL)11,12,16. El fenotipo resultante debido a la alteración de la carga mecánica se puede observar aproximadamente 24-48 h después de la intervención quirúrgica en estudios centrados en el pronóstico precoz11,13. La intervención LAL es una técnica popular para estrechar el volumen funcional de la aurícula izquierda (AI) mediante la colocación de un asa de sutura alrededor de la abertura auriculoventricular. Asimismo, también se han realizado intervenciones microquirúrgicas dirigidas a la ligadura auricular derecha (RAL)17,18. Del mismo modo, algunos investigadores se dirigen a la orejuela auricular izquierda (AIF) utilizando microclips para reducir el volumen de la AI19,20. En algunos estudios, se aplica un hilo de nylon quirúrgico en el nódulo auriculoventricular19,21. Una de las intervenciones utilizadas es la LAL, que puede imitar el HLHS, pero también es el modelo más difícil de realizar, con rendimientos de muestra muy pequeños debido a las operaciones microquirúrgicas extremadamente finas que se requieren. En nuestro laboratorio, la LAL se realiza in ovo entre los estadios 20 y 21 de Hamburger-Hamilton (HH), antes de que la aurícula común esté completamente septada 6,14,22,23. Se coloca una sutura quirúrgica alrededor de la AI, que altera las corrientes de flujo sanguíneo intracardíaco. En los modelos LAL de HLHS, se observa un aumento de la rigidez de la pared del ventrículo, una alteración de los ángulos de las miofibras y una disminución del tamaño de la cavidad del VI14,24.

En este artículo de video, se proporciona un protocolo detallado y un enfoque para LAL in ovo . Brevemente, los embriones aviares fertilizados se incubaron para microcirugía, se abrió la cáscara del huevo y se limpiaron las membranas externa e interna. A continuación, el embrión se rotó lentamente para que el LA fuera accesible. Se ató una sutura quirúrgica de nylon 10-0 a la yema auricular y el embrión fue devuelto a su orientación original, completando el procedimiento LAL25. La LAL y los ventrículos normales se comparan para la compactación tisular y el volumen del ventrículo mediante tomografía de coherencia óptica e histología básica.

Un modelo de LAL ejecutado con éxito, como se describe aquí, contribuirá a los estudios básicos centrados en el desarrollo embrionario de los componentes cardiovasculares. Este modelo también se puede utilizar junto con manipulaciones genéticas y modalidades avanzadas de imagen. Del mismo modo, el modelo LAL agudo es una fuente estable de células vasculares enfermas para experimentos de cultivo de tejidos.

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Protocol

Los huevos fértiles de Livorno blanco se obtienen de proveedores confiables y se incuban de acuerdo con las pautas aprobadas por la universidad. Los embriones de pollo, estadios 18 (día 3) a 24 (día 4) (los estadios presentados en este artículo) no se consideran animales vertebrados vivos por la directiva 2010/63/UE de la Unión Europea (UE) y las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en los Estados Unidos. Los embriones de pollo se consideran "animales vivos" después del día 19 de incubación según las leyes de EE. UU., pero no para la UE. Cada huevo está etiquetado con la fecha de inicio de la eclosión y está programado para eclosionar a más tardar eldécimo día de incubación. Después de que los huevos eclosionan, los pollitos se retiran de la incubadora. El protocolo se realiza en dos estaciones de operación de sobremesa (Estación 1 y Estación 2), centrándose en etapas especializadas de generación de modelos.

1. Preparación antes de la microcirugía

  1. Obtenga óvulos fertilizados de un centro de desarrollo de vacunas con un grado específico libre de patógenos (SPF) o a través de una granja de proveedores comerciales de confianza por un mensajero de entrega frágil en contenedores de poliestireno seco. Antes de la incubación, limpie suavemente la cáscara del huevo con toallitas sin pelusa empapadas en etanol al 70% para eliminar la contaminación.
  2. Criterios de inclusión/exclusión embrionaria
    1. No incube huevos que se hayan agrietado o dañado durante el transporte.
    2. Si se observa sangrado durante el procedimiento de LAL o después de la reinincubación, no utilice el embrión.
    3. No utilice embriones que se desarrollen en la posición del lado izquierdo hacia arriba, ya que el flujo sanguíneo hemodinámico puede diferir de la orientación normal.
    4. Embriones Dıscard que se desarrollan con defectos congénitos tanto en procedimientos pre como postquirúrgicos.
    5. Incluir embriones que alcancen la etapa deseada desarrollándose en su ubicación original, imitando el HLHS como modelo LAL.
  3. Incubar los huevos fertilizados de gallina blanca de Livorno (Gallus gallus domesticus L.), con el extremo romo hacia arriba, hasta la etapa deseada, típicamente a HH20-2115 (37,5 °C, 60% de humedad, 3,5 días) (Figura 1).
    NOTA: Es importante mantener los huevos a una temperatura y humedad constantes para aumentar el rendimiento. Dependiendo del modelo de incubadora, la adición de una olla llena de agua destilada mantendrá una humedad estable. Los autores desarrollan y recomiendan los planos de un sistema de control de temperatura y humedad adicional/auxiliar que se adaptaría a la mayoría de las incubadoras. Los detalles electrónicos, de hardware y de código de esta unidad de sensor/control de fabricación propia se proporcionan en un repositorio de datos26. La agitación suave y continua (rotación) de los huevos durante la incubación puede permitir un posicionamiento óptimo del embrión y, por lo tanto, conducir a un mayor porcentaje de embriones "operables". Shaking también puede trabajar con incubadoras con esta capacidad y aumentar aún más la productividad.
  4. Antes de comenzar el procedimiento, prepare el número requerido de nudos atando un nudo suelto en una sutura 10-0 de 1,5 cm de largo. Asegúrese de que el nudo no esté apretado y que sea lo suficientemente grande como para caber fácilmente sobre las aurículas durante la operación (Figura 2).
    NOTA: Haga los nudos con anticipación y manténgalos en una solución estéril de timbre para pollitos antes de usar. La operación de atado de nudos requiere el uso de las dos manos para operar las pinzas de forma sincronizada. Dado que esta es una etapa crítica en el protocolo, se puede hacer un modelo de la aurícula con masilla para practicar este paso (Figura 3). Esto mejorará las habilidades de microcirugía tridimensional necesarias para realizar el paso 3.2.3 en la Estación 2 (Figura 4).

2. Operaciones en la Estación 1 (Figura 4A)

  1. Abra una ventana desde el extremo romo del huevo y retire las membranas externa e interna15 (Figura 5A-D).
  2. Abra la cáscara del huevo rompiéndola suavemente con el extremo inverso de las pinzas, con los dedos libres sosteniendo firmemente el huevo para reducir la propagación no deseada de grietas.
  3. Dado que la LAL es un procedimiento largo, se debe conservar la temperatura y la humedad del embrión, ya que la frecuencia cardíaca depende de la temperatura. Por lo tanto, asegúrese de que la ventana de shell inicial se cree lo más pequeña posible, lo suficiente para ejecutar las operaciones.
    NOTA: No se emplean sistemas de control de humedad o temperatura durante la operación, pero estos sistemas, si están disponibles, beneficiarían el rendimiento. Si es posible, se apaga el sistema de aire acondicionado del laboratorio y el procedimiento se realiza a la temperatura ambiente más alta posible. También se recomienda la optimización de la frecuencia cardíaca embrionaria, que puede controlarse mediante la temperatura, durante la operación. Algunos laboratorios mantienen la frecuencia cardíaca a frecuencias ligeramente inferiores a 120 lpm mediante el control de la temperatura durante el funcionamiento de LAL. Como tal, el control de la humedad empleado alrededor de la zona quirúrgica aumentaría aún más el rendimiento. Las ventanas de cáscara de huevo se crean lo más pequeñas posible, lo suficientemente grandes como para permitir el acceso quirúrgico. Esto también es aplicable a la membrana externa gruesa, que suele ser más pequeña que la cáscara del huevo solo en la medida de la circunferencia del embrión. Estos aseguran mantener la temperatura y la humedad del embrión. Al abrir una ventana desde el extremo romo del huevo, los pequeños fragmentos de cáscara se limpian para que estos trozos no dañen la integridad vascular vitelina ni den lugar a artefactos no deseados. Además, otros laboratorios utilizan tijeras curvas microdentadas para hacer ventanas. Además, se pueden usar dos anchos de cinta adhesiva para estabilizar la cáscara de huevo y controlar el agrietamiento.
  4. Retire solo la membrana vitelina necesaria con unas microtijeras (Video complementario 1).
  5. El desarrollo embrionario normal es del revés. Una vez que el embrión esté libre de la membrana vitelina, coloque la pinza con las puntas cerradas debajo del segmento dorsal del embrión y voltee suavemente el embrión para exponer el lado izquierdo (es decir, la configuración del lado izquierdo hacia arriba) (Figura 6A, B; Video complementario 2).
  6. Asegúrese de que la yema auricular izquierda esté ahora expuesta, pero aún cubierta por un complejo sistema de membranas, que generalmente consiste en una doble capa del pericardio.
  7. Retire las membranas, incluidas las finas, inmediatamente alrededor de la yema auricular. Esta es otra etapa crítica; Realice la extracción de membranas gruesas y progrese a las finas alrededor de la yema auricular izquierda. Reserve las pinzas más finas para retirar la membrana fina (Video complementario 3).
  8. Durante el proceso de extracción de la membrana, oriente el embrión en posición hacia arriba, de modo que la operación de colocación del nudo en el paso 3.2 se pueda realizar sin necesidad de reposicionarlo. Para ello, levanta el embrión con las membranas del paso 2.6 y cuélgalo de la cáscara del huevo, asegurándote de que el lado izquierdo quede hacia arriba.
    NOTA: Algunos embriones pueden estar ubicados cerca de la periferia de la cáscara del huevo y pueden ser difíciles de operar. Aun así, lo más probable es que estos embriones estén orientados hacia arriba y muestren un comportamiento normal, y pueden incluirse en el estudio. En estos casos, si es necesario, la aurícula oscurecida se puede hacer más accesible limpiando suavemente la membrana pericárdica con pinzas finas # 4 y retirando la cáscara del huevo en la dirección inversa (hacia la abertura de la cáscara). Estos embriones también pueden levantarse utilizando partes de las membranas extraembrionarias y fijarse en la posición deseada uniendo un extremo de la membrana (el extremo de la pinza) a la cáscara del huevo, utilizando su pegajosidad natural. Además, el espacio entre la cabeza y la región de la médula espinal del embrión se puede expandir con la ayuda de pinzas para revelar la aurícula oscurecida.

3. Operaciones en la Estación 2 (Figura 4B)

  1. Bajo el microscopio estereoscópico, coloque el nudo preparado previamente del paso 1.4 cerca del embrión en un lugar accesible (Figura 6B). La yema auricular ya está lista para ser atada (Video complementario 4).
  2. Recupere el nudo abierto preparado previamente y oriéntelo sobre la yema auricular izquierda. Para que el LAL funcione, coloque el huevo en una orientación tridimensional inclinada de manera única.
    1. Orientar correctamente el nudo para ejecutar el proceso de apriete sin dañar los embriones.
    2. Limpie las membranas finas de manera óptima en el paso 2.7 para reducir el efecto de un corazón latiendo.
    3. Apriete la sutura (Figura 6C). Para este paso, practicar con la masilla es muy útil. En el caso de los embriones falsos, aprieta el nudo lo suficiente como para sostenerlo.
  3. A continuación, utilice las microtijeras para cortar los extremos sobrantes de la sutura lo más cerca posible de la yema (Vídeo complementario 5).
  4. Tenga mucho cuidado de que los extremos recién cortados de la sutura atada no estén en condiciones de perforar los vasos cercanos durante la rotación o debido a los latidos del corazón.
  5. Con las pinzas, retire el exceso de piezas de sutura cortadas en el paso 3.3.
  6. Por último, con unas pinzas cerradas, devolver el embrión a su posición original, como en el paso 2.5 (Vídeo complementario 6).
  7. Después de completar el proceso LAL, cubra el huevo con una doble capa de parafilm y vuelva a incubarlo. Un cierre hermético y estéril de los huevos es primordial para la supervivencia, especialmente después de las 24 h de incubación. Si también desea acceso visual, use cera de parafina con portaobjetos de vidrio.
    NOTA: A medida que se estudia el período embrionario temprano, los huevos generalmente se incuban durante 24-48 h hasta que alcanzan aproximadamente HH25 o HH27. Sin embargo, no hay límite, y se pueden estudiar estadios posteriores, como han intentado otros investigadores. Para velocidades de operación rápidas, se recomienda al menos un equipo de dos personas. Una persona debe estar capacitada y es responsable de la apertura del huevo, la limpieza inicial de la membrana, la rotación y la limpieza de la membrana alrededor de la yema auricular izquierda. La otra persona es responsable solo de la preparación inicial del nudo, la colocación del nudo y el apriete. La rotación embrionaria final puede ser realizada por la Persona 1. La operación quirúrgica de un solo embrión dura unos 4-5 minutos.
  8. Antes y después de las operaciones quirúrgicas, limpie las superficies de sobremesa y los instrumentos con etanol. Asegúrese de aplicar una solución fresca de anillador de pollitos (NaCl, KCl, CaCl2 y NaHCO3)16,27 a los instrumentos metálicos que tocan los tejidos embrionarios.

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Representative Results

Se pueden emplear técnicas avanzadas de imagen resueltas en el tiempo para observar los cambios estructurales y morfológicos debidos a la intervención de LAL10. Además, las muestras de LAL también son susceptibles a métodos moleculares y biológicos19,28. En la Tabla 1, se proporcionan los resultados de los estudios de muestra que emplearon el modelo LAL. En este contexto, se realizó la intervención de LAL en embriones de pollo que alcanzaron HH20-21. Tanto los corazones de control (sanos) como los LAL se extrajeron del embrión en HH25-26. Luego, las muestras se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C 6,15. Las muestras de corazón extraídas se deshidrataron en soluciones de etanol de concentraciones crecientes (70%, 96% y 100%) durante 1 h cada una. Finalmente, las muestras se mantuvieron en xileno a RT durante 0,5 h, y se realizó la inclusión en parafina antes del corte a un espesor de 10 μm. Las muestras transferidas al portaobjetos de vidrio se tiñeron con tinción de Elastica van Gieson. Las secciones se examinaron bajo un microscopio estereoscópico, donde se midió el diámetro transversal del ventrículo. También se realizó un método tridimensional no invasivo, la tomografía de coherencia óptica (OCT), en algunas muestras11,29. Se extirparon tanto los corazones de control como los de LAL en HH25-26, y sus diámetros de luz cruzada se midieron bajo OCT.

Los resultados mostraron que para la LAL se logra una estructura miocárdica más compacta con cambios morfológicos significativos en comparación con el desarrollo normal (Figura 7). Además, se observa el depósito de componentes de la matriz extracelular, como el colágeno, alrededor del intersticio cardíaco, asemejándose a la fibrosis miocárdica similar a la HLHS30. Para comprender mejor el engrosamiento miocárdico y la compactación trabecular, se realizaron mediciones morfométricas de la porosidad tanto en muestras de control como en muestras de LAL. Como era de esperar, la intervención de LAL resultó en una cavidad ventricular izquierda más pequeña y compactación trabecular al estrechar los recesos intertrabeculares. Estos hallazgos confirman la hipótesis de que la LAL altera la arquitectura ventricular sana y reorienta el aspecto trabecular22. Asimismo, el modelo LAL en HH29 resultó en un aumento de tamaño de la cavidad ventricular derecha, alteración de la arquitectura trabecular y del volumen miocárdico24.

Para respaldar los resultados obtenidos en este estudio, se utilizó la OCT para medir el área transversal de la luz ventricular y la longitud axial (Figura 8). La LAL mostró una reducción significativa en el tamaño y diámetro del ventrículo izquierdo en comparación con el control. Si bien aquí solo se enfocan los ventrículos, también se reporta la influencia del LAL en el desarrollo del arco aórtico31. Un estudio reciente en el que contribuimos informó en 3D que las distensiones miocárdicas de la pared media aumentaron en ambos ventrículos después de LAL en HH2532. Además, los grupos LAL mostraron un aumento en el grosor de la pared en comparación con los grupos de control en HH25. Este estudio es consistente con el estudio previo de Tobita et al.25, que demostró un aumento significativo de las deformaciones circunferenciales epicárdicas sistólicas máximas en el LAL VI en HH27.

Figure 1
Figura 1: Sistema de incubación para el crecimiento embrionario. Los huevos de gallina blanca de Livorno (Gallus gallus) fertilizados se incubaron en una incubadora a una humedad (60%) y temperatura constantes (37,5 °C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparación del nudo LAL. Se prepararon múltiples nudos de ~0,5-1 mm de diámetro y piezas de 1-2 cm de largo utilizando suturas quirúrgicas de nylon 10-0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Réplica de la aurícula izquierda embrionaria hecha de masilla. Se crea una réplica de la sección auricular izquierda para entrenar y practicar la orientación del nudo y los pasos de cierre del nudo con dos pinzas. Esto nos permitió hacer muchas pruebas y perfeccionar estos pasos antes de implementar esta habilidad en el embrión real. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Preparación de la estación . (A,B) Todos los materiales y soluciones para microcirugía se colocaron en el área limpia de la Estación 1 y la Estación 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Apertura de una ventana desde el extremo romo del huevo y extracción de las membranas externa e interna. (A,B) Se abrió una pequeña ventana utilizando instrumentos microquirúrgicos en la cáscara del huevo e incluyendo el embrión completo en HH20-21. (C) Los fragmentos de la cáscara del huevo se eliminaron en el primer paso de agrietamiento. (D,E) Las membranas extraembrionarias también fueron disecadas bajo el microscopio. (F) Después de que se completó el proceso de LAL, el huevo se cubrió con una doble capa de parafilm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Instantánea de la cirugía in ovo de ligadura auricular izquierda (LAL). (A) Vista dorsal del embrión de pollo en su orientación normal. El ventrículo embrionario que alcanza HH20-21 tiene una aurícula común primitiva (a), un ventrículo (v) y un tracto de salida (ot). (B) Se muestra una vista dorsal de primer plano del embrión volteado con el lado izquierdo hacia arriba y la ubicación del nudo. (C) LA con el nudo de sutura. Abreviaturas: LA = aurícula izquierda; AA = arco aórtico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Extracción y examen de los corazones control y LAL. Tanto los corazones de control (A) como los corazones de LAL (B) que alcanzaron la etapa HH25-26 se extrajeron del embrión y se examinaron bajo un microscopio estereoscópico. El gráfico de barras muestra las diferencias en el diámetro transversal del corazón entre el grupo LAL y el grupo control, y la media ± desviación estándar (DE) de al menos cuatro repeticiones. Barra de escala = 100 μM. Examen histológico de los tejidos cardíacos en muestras de control (C) y (D) LAL mediante la técnica de tinción de Elastica van Gieson. El gráfico de barras muestra las diferencias en la porosidad (%) para mostrar la compresión miocárdica entre el LAL y el grupo control, y la media ± DE de al menos dos repeticiones. **p < 0,01. Para el análisis estadístico se utilizó GraphPad Prism versión 9.5.1. Barra de escala = 50 μM. Abreviaturas: LAL = ligadura auricular izquierda; LA = aurícula izquierda; AR = aurícula derecha; VD = ventrículo derecho; VI = ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Tomografía de coherencia óptica. Tanto los corazones de control (A) como los corazones LAL (B) que alcanzaron HH25-26 fueron examinados por OCT. (C,D) El tamaño y la longitud de la cruz lumínica de los ventrículos se indican en los paneles (C) y (D), respectivamente. Los histogramas representan la media ± SD con al menos tres repeticiones. *p < 0,05; **p < 0,01; Para el análisis estadístico se utilizó GraphPad Prism versión 9.5.1. Barra de escala = 100 μM. Abreviaturas: LAL = ligadura auricular izquierda; VD = ventrículo derecho; VI = ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Revisión de estudios de investigación que emplean el modelo de ligadura auricular izquierda (LAL) en embriones aviares 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
En casi todos los periódicos, la LA está empatada en HH21. El efecto de la LAL se investiga en etapas posteriores de HH (etapa de evaluación). Abreviaturas: AVC = cojín auriculoventricular; LAV = canal auriculoventricular izquierdo; RAV = canal auriculoventricular derecho; AR = aurículas derechas; AI = aurículas izquierdas; VD = ventrículo derecho; VI = ventrículo izquierdo; NEE = subendocardio; IVS = tabique interventricular; micro-CT = microtomografía computarizada. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Efectividad típica del modelo de ligadura auricular izquierda (LAL) creado en HH21 e incubado hasta HH25. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Video complementario 1: Se extirpan las membranas externas e internas del embrión aviar. Luego, solo se retira la membrana vitelina, como se muestra con microtijeras. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 2: Se colocan pinzas debajo del segmento dorsal del embrión del lado derecho hacia arriba y se voltean cuidadosamente para exponer su yema auricular izquierda. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 3: Las membranas alrededor de la yema auricular izquierda se limpian gradualmente. El atrio se expande ligeramente, lo que hace posible la colocación y el atado de nudos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 4: Se coloca una sutura de aproximadamente 0,1-0,3 mm de largo cerca del embrión y se aprieta alrededor de él con dos pinzas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 5: Los extremos de sutura sobrantes del nudo se cortan cuidadosamente con microtijeras. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 6: El embrión vuelve suavemente a su orientación normal. LAL se ha completado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

En el HLHS, el flujo sanguíneo se altera debido a defectos estructurales, lo que lleva a una morfología anormal en el lado izquierdo 4,6. El presente modelo proporciona un sistema experimental práctico para comprender mejor la progresión del HLHS e incluso puede imitar su patogenia8. Sin embargo, establecer un modelo animal de HLHS totalmente equivalente desde el punto de vista clínico es una tarea difícil. Además del modelo de LAL aviar que se presenta aquí, estudios recientes en ratones, ovejas fetales y ranas han intentado replicar las características morfológicas, hemodinámicas y fisiopatológicas del pronóstico de HLHS. En embriones de ratón, la carga mecánica se altera a través de un agente embolizante inyectado en el AI a través de una intervención fetal en el día embrionario (DE) 14,5 (aproximadamente HH40-41 en embriones de pollo)34. Un total de 48% de los fetos que fueron embolizados positivamente sobrevivieron a la gestación con VI pequeños y flujo aórtico retrógrado. El largo período de gestación, los desafíos adicionales en las intervenciones en los primeros momentos y la cirugía fetal desafiante pueden limitar la viabilidad de este modelo. La hipoplasia VI también fue imitada en los modelos fetales de cordero rellenando la AI con caucho de silicona a través de un catéter balón35. En este modelo animal grande, el volumen del VI se reduce lo suficiente, pero el tiempo de supervivencia no es largo, lo que resulta en una baja penetración de la enfermedad. Un enfoque de intervención alternativo es ocluir el agujero oval mediante cateterismo transhepático percutáneo, como se intentó en el cordero fetal36, aunque dirigir el stent oclusivo al agujero oval es muy difícil. Los modelos de ovejas en general son muy desafiantes debido a sus morfologías vasculares preexistentes y fisiología pulmonar adversa. Como tal, la necesidad de cría estacional, una edad gestacional más tardía y un tamaño de muestra pequeño limitan aún más este modelo. Finalmente, el embrión de Xenopus también se presenta como otro modelo conveniente para imitar la enfermedad cardíaca humana37, a pesar de su corazón de tres cámaras con un solo ventrículo y diferencias en los patrones de las células de la cresta neural. La disponibilidad de microinyecciones e intervenciones microquirúrgicas de genoma completo establecidas y el largo tiempo de supervivencia también hacen que este modelo sea atractivo.

En estudios previos, la penetración de la enfermedad en seis de los 39 embriones aviares operados se presentó como del 15% en el modelo LAL34. Sin embargo, la penetración promedio de HLHS en el modelo de embrión de pollo que examinamos en la etapa inicial (alcanzando HH25 y HH27) fue del 66% (12 de 18 embriones aviares operados). El Prof. Sedmera informó que el tiempo promedio de supervivencia de los embriones podría ser de HH40 (ED14)19. Otros grupos que realizan regularmente esta ligadura han reportado altas tasas de éxito en los primeros momentos (p. ej., 75% hasta HH29, 50% hasta HH34 y 20% hasta HH38)30. Sin embargo, en etapas posteriores, emerge un fenotipo distinto y aumenta la mortalidad. Aunque la penetración de la enfermedad puede ser relativamente baja en embriones de pollo, el objetivo de este modelo es examinar mejor la etiología y la patología del HLHS prenatal, especialmente en las primeras etapas.

Debido al tamaño muy pequeño del embrión de pollo en etapa temprana, la intervención pre y postoperatoria de LAL puede conducir a varias complicaciones. Como remedio para evitar la contaminación, las cáscaras de huevo y los bancos se limpian con etanol al 70%, y se pueden usar guantes durante todo el procedimiento. Un paso crítico en el protocolo de LAL es la extirpación de toda la membrana pericárdica para permitir un buen ajuste del nudo alrededor de la yema auricular izquierda. Además, hemos encontrado que el equipo de dos personas es extremadamente útil, particularmente en la capacitación y especialización en un conjunto de habilidades específicas necesarias durante los pasos del protocolo. Este enfoque acelera el procedimiento y su curva de aprendizaje. Como tal, el riesgo de sangrado y contaminación es secundario y supera los beneficios del sistema de compañeros propuesto. Se recomienda el uso de una sutura preparada previamente y almacenada en una solución estéril de anillador de pollitos. Además, mantener una baja fuerza de apriete de la sutura también es fundamental para un mayor rendimiento embrionario. Los nudos más apretados en la yema auricular aplicados en HH21 pueden conducir a una falla prematura del VI que es incapaz de elaborar el compromiso clínicamente crítico de los defectos de remodelación de la conducción, coronaria y mioarquitectura secundaria, que han sido bien descritos en estudios previos22. Específicamente, el uso de las pinzas y tijeras más finas y sin usar en ciertos pasos y las relativamente desafiladas en otros puede reducir el sangrado accidental. Finalmente, inmediatamente después de completar el nudo, el embrión debe girarse rápidamente a su posición original y la ventana de la cáscara del huevo debe cerrarse con una doble capa de parafilm para preservar su temperatura y humedad. En la Tabla 2 se presenta el rendimiento típico para el modelo LAL que alcanza HH25. Además de la disminución del tamaño ventricular, también pueden desarrollarse malformaciones valvulares, como atresia mitral/aórtica. La severidad de estas lesiones aumenta la morbilidad en estadios más tardíos, como en el HLHS. Debido a los desafíos discutidos aquí, en comparación con otras intervenciones mecánicas realizadas en embriones de pollo, como el anillamiento conotruncal, el modelo LAL da como resultado niveles de rendimiento mucho más bajos. Creemos que, a través de las precauciones presentadas aquí, se puede lograr un rendimiento del 50%.

El embrión aviar es un modelo animal vertebrado ideal para la investigación del desarrollo cardiovascular debido a su estructura morfológica, tamaño, bajo costo, facilidad de cultivo y manipulación38,39. Este modelo también proporciona una protección natural contra los patógenos40. Los embriones instrumentados se pueden utilizar en imágenes in vivo avanzadas y en la manipulación local de siRNA. Como tal, las regiones genéticas conservadas del ser humano y del pollo están disponibles a través de la secuenciación de escopeta Sanger y el mapeo basado en la física39, lo que lleva a estudios mecanosensibles avanzados19. Además, se ha utilizado el enfoque de microarrays aplicado por Krejčí et al. para medir el éxito en cuanto a la potencial reversibilidad de los cambios hemodinámicos en la estructura miocárdica. Así, la identificación de genes expresados diferencialmente entre los ventrículos izquierdo y derecho puede ser utilizada como criterio para el período ideal de intervención cuando comienzan los cambios irreversibles33.

En conclusión, las posibles direcciones futuras para las aplicaciones microquirúrgicas en el modelo de embrión de pollo incluyen el uso de técnicas de edición de genes cardiovasculares centradas en genes específicos de la matriz y vías de señalización molecular, apoyando los avances en el cultivo de células de tejidos y tecnologías de imagen32.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos el premio al investigador principal 120C139 de Tubitak 2247A por proporcionar financiación. Los autores también quieren dar las gracias a PakTavuk Gıda. A. S., Estambul, Turquía, por proporcionar óvulos fértiles y apoyar la investigación cardiovascular.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 nylon surgical suture Ethicon
Elastica van Gieson staining kit Sigma-Aldrich 115974 For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute Interlab 64-17-5 For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A AZYSS600-110
Kimwipes Interlab 080.65.002
Microscissors World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 555640S Vannas STR 82 mm
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793-1EA Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk Leica Biosystems  39602012 Tissue embedding medium
Stereo Microscope Zeiss Stemi 508  Stemi 508 Used at station 1
Stereo Microscope Zeiss Stemi 2000-C Stemi 2000-C Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) Adumont & Fils, Switzerland Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)  World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 501985 Used to remove the membranes on the embryo

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Ligadura auricular izquierda en embrión aviar como modelo de carga hemodinámica alterada durante el desarrollo vascular temprano
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Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas, F., Pekkan, K. Left Atrial Ligation in the Avian Embryo as a Model for Altered Hemodynamic Loading During Early Vascular Development. J. Vis. Exp. (196), e65330, doi:10.3791/65330 (2023).

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