Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein alternatives Protokoll vor, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in C57BL/6-Mäusen aktiv zu induzieren, indem wir das immunogene Epitop Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)35-55 verwenden, das in einem unvollständigen Freund-Adjuvans suspendiert ist, das die hitzeabgetötete Mycobacterium avium-Subspezies paratuberculosis enthält.
Abstract
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), die durch Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) induziert wird, erfordert eine Immunisierung durch ein MOG-Peptid, das in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) mit inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis emulgiert ist. Die antigenen Bestandteile des Mykobakteriums aktivieren dendritische Zellen, um T-Zellen zur Produktion von Zytokinen anzuregen, die die Th1-Antwort über Toll-like-Rezeptoren fördern. Daher stehen die Menge und Art der Mykobakterien, die während der antigenen Herausforderung vorhanden sind, in direktem Zusammenhang mit der Entwicklung von EAE. In dieser Arbeit wird ein alternatives Protokoll zur Induktion von EAE in C57BL/6-Mäusen unter Verwendung eines modifizierten unvollständigen Freund-Adjuvans vorgestellt, das den hitzeabgetöteten Mycobacterium avium-Subspezies Paratuberculosis-Stamm K-10 enthält.
M. paratuberculosis, ein Mitglied des Mycobacterium avium-Komplexes, ist der Erreger der Johne-Krankheit bei Wiederkäuern und wurde als Risikofaktor für mehrere menschliche T-Zell-vermittelte Erkrankungen, einschließlich Multipler Sklerose, identifiziert. Insgesamt zeigten Mäuse, die mit Mycobacterium paratuberculosis immunisiert wurden, einen früheren Krankheitsbeginn und einen höheren Schweregrad der Erkrankung als Mäuse, die mit CFA immunisiert wurden, die den Stamm von M. tuberculosis H37Ra in der gleichen Dosis von 4 mg/ml enthielt. Die antigenen Determinanten des Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) Stammes K-10 waren in der Lage, während der Effektorphase eine starke Th1-Zellantwort zu induzieren, die durch eine signifikant höhere Anzahl von T-Lymphozyten (CD4+, CD27+), dendritischen Zellen (CD11c+, I-A/I-E+) und Monozyten (CD11b+, CD115+) gekennzeichnet war) in der Milz im Vergleich zu Mäusen, die mit CFA immunisiert wurden. Darüber hinaus schien die proliferative T-Zell-Antwort auf das MOG-Peptid in M. paratuberculosis-immunisierten Mäusen am höchsten zu sein. Die Verwendung eines Enzephalitogens (z. B. MOG35-55), das in einem Adjuvans emulgiert ist, das M. paratuberculosis in der Formulierung enthält, kann eine alternative und validierte Methode sein, um dendritische Zellen für das Priming von Myelinepitop-spezifischen CD4+ T-Zellen während der Induktionsphase von EAE zu aktivieren.
Introduction
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein gängiges Modell für die Untersuchung menschlicher demyelinisierender Erkrankungen1. Es gibt verschiedene Modelle der EAE: die aktive Immunisierung mit verschiedenen Myelinpeptiden in Kombination mit potenten Adjuvantien, die passive Immunisierung durch In-vitro-Transfer von myelinspezifischen CD4+ -Lymphozyten und transgene Modelle der spontanen EAE2. Jedes dieser Modelle verfügt über spezifische Merkmale, die es ermöglichen, verschiedene Aspekte der EAE zu untersuchen, wie z. B. den Beginn, die Effektorphase oder die chronische Phase. Das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Modell (MOG) der EAE ist ein gutes Modell, um die immunvermittelten Mechanismen der chronischen Neuroinflammation und Demyelinisierung zu untersuchen, da es durch mononukleäre entzündliche Infiltration, Demyelinisierung in der peripheren weißen Substanz und reduzierte Erholung nach dem Krankheitshöhepunktgekennzeichnet ist 1.
MOG-EAE wird durch Immunisierung empfänglicher Mäuse mit dem Peptid MOG35-55 im vollständigen Freund'schen Adjuvans (CFA) induziert, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von Pertussis-Toxin. Dadurch erhöht sich die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke und Myelin-spezifische T-Zellen, die in der Peripherie aktiviert werden, gelangen ins zentrale Nervensystem (ZNS), wo sie reaktiviert werden3. CFA spielt eine Schlüsselrolle bei der Induktion von EAE, indem es die Antigenaufnahme durch antigenpräsentierende Zellen und die Expression von Zytokinen im Zusammenhang mit humoralen und zellvermittelten Reaktionen erhöht4. Dieser Mechanismus ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von abgetötetem Mycobacterium tuberculosis zurückzuführen, das in Öl emulgiert ist und dessen Bestandteile einen starken Reiz für das Immunsystem darstellen5. Tatsächlich steht die Induktion von EAE in direktem Zusammenhang mit der Menge an Mykobakterien, die während der Antigen-Provokation vorhanden ist6.
Die Zugabe anderer abgetöteter Mykobakterien, wie z.B. Mycobacterium butyricum, zu unvollständigem Freund-Adjuvans7 sowie die Wirkung von Adjuvanskombinationen8 können den klinischen Verlauf der EAE modulieren und somit die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflussen. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), der ätiologische Erreger der Johne-Krankheit bei Wiederkäuern, wurde mit entzündlichen Erkrankungen des menschlichen ZNS in Verbindung gebracht 9, da seine antigenen Komponenten in der Lage sind, bei Patienten mit Multipler Sklerose und Neuromyelitis-optica-Spektrum-Störungeine starke humorale und zellvermittelte Reaktion hervorzurufen9. Daher zeigen wir in diesem Protokoll eine alternative und reproduzierbare Methode zur Induktion von MOG-EAE, indem M. tuberculosis in CFA durch M. paratuberculosis ersetzt wird.
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Protocol
Alle Mausversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Juntendo University School of Medicine genehmigt (Zulassungsnummer 290238) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health für Tierversuche durchgeführt.
1. Allgemeine Bemerkungen zum Experiment
- Die Mäuse werden in Einzelkäfigen in der Tierhaltung unter kontrollierten, erregerfreien Bedingungen bei 23 °C ± 2 °C mit 50 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser untergebracht.
- Injizieren Sie den Mäusen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Antigen und CFA und verwenden Sie sie als Negativ- bzw. Positivkontrolle.
2. Herstellung von mykobakteriellen Antigenen
- Der Stamm M. paratuberculosis K-10 wird in Middlebrook flüssigem Medium 7H9 angereichert mit 10 % OADC (Ölsäure, Albumin, Dextrose, Katalase), 0,005 % Tween 80 und 2 mg/l Mycobactin J 2 Wochen lang in T25-Gewebekulturflaschen bei 37 °C gezüchtet. Beurteilen Sie das Wachstum der Kolonie regelmäßig durch Sichtprüfung.
VORSICHT: Behandeln Sie M. paratuberculosis in einer Einrichtung der biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL-2). - Den 500 ml Erlenmeyerkolben mit einer Suspension von 1,7 ×10 5 koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml in einem Endvolumen von 200 ml (gleiches Medium wie Schritt 2.1) 1 Woche lang in einem Schüttelinkubator züchten.
HINWEIS: Da kontaminierende Organismen die Ergebnisse beeinflussen können, müssen die Bakterien auf festem Middlebrook 7H10-Medium inokuliert werden, um die Koloniemorphologie zu bestimmen und die Reinheit mit herkömmlichen PCR-Nachweiskits (Polymerase-Kettenreaktion) für M. paratuberculosis zu überprüfen. - Die Bakteriensuspensionen 5-10 min bei 70 °C inaktivieren und bei 3.000 × g 10 min zentrifugieren. Das gewogene Pellet wurde zweimal in PBS gewaschen, durch Beschallung unterbrochen und bei -20 °C gelagert.
- Übertragen Sie das Pellet in einen sterilen Behälter und frieren Sie es mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff ein. Sofort in eine Gefriertrocknungskammer überführen.
- Gefriertrocknen (4 h bei -50 °C unter Vakuum) M. paratuberculosis gemäß Maschinenhandbuch.
- Am Ende der Gefriertrocknung nehmen Sie den Edelstahlbehälter aus dem Gefriertrockner und geben ihn auf eine Bioreinigungsbank. Verwenden Sie einen Edelstahlspatel, um die getrockneten MAP-Klumpen, die an der Innenwand des Edelstahlbehälters haften, zu entfernen und so fein wie möglich zu pulverisieren.
- Wiegen Sie die pulverisierten Zellen mit einer elektronischen Waage und geben Sie sie manuell in eine aseptische 10-ml-Durchstechflasche mit einer Konzentration von 10 mg/ml.
HINWEIS: Die Zelldichte wurde als Gramm Trockengewicht pro Liter Probe quantifiziert. Nach 3 Wochen enthält 1 mg (Nassgewicht) bakterielles Zellpellet ca. 2,5 × 108 KBE.
3. Herstellung der MOG 35-55 Emulsion
- Mahlen Sie den Inhalt einer Durchstechflasche mit getrocknetem M. paratuberculosis (10 mg) mit einem Mörser und Stößel zu einem feinen Pulver und fügen Sie 10 ml zu unvollständigem Freund-Adjuvans hinzu, um eine 10 mg/ml Stammlösung zu erhalten. Bei -4 °C lagern.
- Vor der Immunisierung wird die Stammlösung auf eine Endkonzentration von 4 mg/ml verdünnt.
- Das Peptid MOG35-55 wird inddH2Oauf eine Endkonzentration von 2 mg/ml verdünnt und bei -20 °C gelagert.
- Mischen Sie mit einem Homogenisator die MOG35-55-Lösung (2 mg/ml) mit einem gleichen Volumen Adjuvans (4 mg/ml) aus Schritt 3.2 in einem 5-ml-Röhrchen, bis eine dickflüssige Emulsion entsteht. Geben Sie die Lösung nach jeweils 10 Sekunden des Mischens für 20 Sekunden auf Eis und drehen Sie das Röhrchen, um die gesamte Lösung zurückzugewinnen.
- Übertragen Sie die Emulsion in eine 1-ml-Spritze, entfernen Sie die gesamte Luft und fügen Sie eine 27-g-Nadel hinzu. Die Emulsion ist nun bereit für die Injektion.
ANMERKUNG. Da bei der Herstellung ein gewisser Verlust der viskosen Emulsion von MOG35-55 auftritt, ist es am besten, das 1,5-fache der benötigten Menge herzustellen.
4. Impfung von Tieren
- Betäuben Sie die Tiere mit Inhalation von Isofluran, um den Stress für die Tiere zu minimieren.
- Injizieren Sie die Emulsion (200 μl mit 200 μg/Maus MOG35-55) subkutan in den unteren Rücken.
- Verabreichen Sie eine Dosis Pertussistoxin (100 μl mit 200 ng/Maus) intraperitoneal an den Tagen 0 und 2 nach der Immunisierung.
ACHTUNG: Pertussis-Toxin hat eine mehrfach unterdrückende Wirkung auf das Immunsystem; Vermeiden Sie das Verschlucken und den Kontakt mit Augen und Haut.
5. Klinische Bewertung
- Überwachen Sie die Mäuse täglich auf Gewicht und klinische Symptome. Verwenden Sie das folgende Bewertungssystem: 0 = keine klinischen Symptome; 1 = schlaffer Schwanz; 2 = Beeinträchtigung des Aufrichtungsreflexes und Schwäche der Hintergliedmaßen; 3 = vollständige Lähmung der Hintergliedmaßen; 4 = vollständige Lähmung der Hintergliedmaßen mit teilweiser Lähmung der Vordergliedmaßen; 5 = moribund.
HINWEIS: Nach der ersten Beobachtung klinischer Symptome erhalten die Tiere einen verbesserten Zugang zu Wasser und Futter. Nagetierfutter wird aufgeweicht und angefeuchtet und dann aus dem Futterbehälter auf den Käfigboden gelegt. Bei dehydrierten Tieren wird eine subkutane Flüssigkeitsergänzung verabreicht oder eine Nagetier-Chow-Aufschlämmung über eine orale Sonde verabreicht. Wenn eine Maus diese Art von Hilfe länger als 3 Tage benötigt, wird eine Euthanasie durchgeführt. - Um Schmerzen und Leiden des Tieres zu vermeiden oder zu minimieren, verwenden Sie die folgenden menschlichen Endpunkte: Körpergewichtsverlust von mehr als 20 %, klinischer Wert ≥4,0, Fehlen des Aufrichtungsreflexes bei Punktzahl 3 und wenn das Tier 24 Stunden lang keinen Zugang zu Futter oder Wasser hat.
HINWEIS: Die Mäuse wurden am 30. Tag nach der EAE-Induktion durch intraperitoneale Injektionen von Pentobarbital (≥150 mg/kg) euthanasiert.
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Representative Results
Gruppen von C57BL/6-Mäusen (gesamt n = 15/Gruppe) wurden mit MOG35-55 in einer M. paratuberculosis-haltigen Emulsion oder mit der üblichen Methode mit CFA immunisiert. Alle Gruppen von Mäusen zeigten eine akute monophasische Erkrankung, die durch einen einzigen Höhepunkt der Behinderung nach 14-17 Tagen gekennzeichnet war, gefolgt von einer teilweisen Erholung der Symptome in den nächsten 10 Tagen (Abbildung 1A). Mäuse, die mit dem M. paratuberculosis-haltigen Adjuvans immunisiert wurden, zeigten unabhängig vom Geschlecht einen früheren Beginn von 8 bis 9 Tagen nach der Immunisierung und einen höheren Schweregrad in der akuten Phase als Mäuse, die mit CFA immunisiert wurden (Abbildung 1B). Es gab keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht zwischen den Gruppen (Abbildung 1C). Wie bereits publiziert, wurden zytofluorimetrische Analysen von Milzzellen von EAE-Mäusen und die proliferative Aktivität von T-Lymphozyten durchgeführt, die durch 3H-Thymidin-Einbau bestimmt wurden11. Alle Milzzellen von EAE-Mäusen, unabhängig vom verwendeten Adjuvans, zeigten eine starke proliferative Antwort auf das Peptid MOG35-55, während sie auf das Kontrollpeptid Ovalbumin nicht proliferierten (Abbildung 1D). M. paratuberculosis-immunisierte EAE-Mäuse zeigten einen erhöhten Anteil an T-Lymphozyten (CD4+, CD27+), dendritischen Zellen (CD11c+I-A/I-E+) und Monozyten (CD11b+CD115+) in der Milz im Vergleich zu CFA-immunisierten Mäusen während der akuten Phase der EAE (Abbildung 1E). Die histologische Analyse mittels Hämatoxylin-Eosin ergab eine typische perivaskuläre und meningeale mononukleäre inflammatorische Infiltration im Gehirn und Rückenmark (Abbildung 1F).
Abbildung 1: Repräsentative EAE-Ergebnisse. (A) Klinische Scores von Mäusen, die täglich ausgewertet werden; (B) Unterschiede im Krankheitsverlauf; (C) Körpergewicht; (D) proliferative T-Zell-Antwort auf das MOG35-55-Peptid ; (E) Immunzellpopulationen in Milzzellen während der akuten Phase; (F) histologische Aufnahmen von Rückenmarksschnitten (4-fache Vergrößerung), die während der akuten Phase mit Hämatoxylin-Eosin (Maßstabsbalken = 200 μm) gefärbt wurden. Pfeile zeigen entzündliche Infiltrate an. Die Daten zeigen kombinierte Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten (n = 5 Mäuse/Gruppe/Experiment). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, die mit einer einfaktoriellen ANOVA berechnet wird, gefolgt von Bonferroni-Post-hoc-Test oder Mann-Whitney-U-Test. Abkürzungen: EAE = experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis; MOG = Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; CFA = vollständiges Freund-Adjuvans. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Wir demonstrierten ein robustes alternatives Protokoll zur aktiven Induktion schwerer EAE in C57BL/6J-Mäusen unter Verwendung des Peptids MOG35-55 , das in einem Adjuvans mit M. paratuberculosis10 emulgiert wurde. Die Induktion von EAE durch diese Methode führte zu einer schwereren Erkrankung als diejenige, die durch das gemeinsame Protokoll mit CFA induziert wurde. Dieser Unterschied könnte auf die unterschiedlichen Lipidkomponenten in der Zellwand der Mykobakterien zurückzuführen sein11. Tatsächlich produziert M. paratuberculosis im Gegensatz zu anderen Mykobakterien ein Lipopentapeptid-Antigen auf der Zellwandoberfläche anstelle von Glykopeptidolipiden11. Dieses Lipopentapeptid reagierte nicht mit anderen eng verwandten Spezies und hat sich bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen als Ziel für eine starke spezifische humorale Reaktion erwiesen12. Mykobakterien besitzen pathogen-assoziierte molekulare Muster, die unterschiedliche Rollen bei der Immunantwort spielen9. So konnten wir kürzlich zeigen, dass eine orale Immunisierung mit M. paratuberculosis den Schweregrad von MOG-EAE13 erhöht, während die Impfung mit Bacillus Calmette-Guerin (BCG)-Tokyo-172 eine schützende Rolle bei der Progression aktiver und spontaner EAE-Modelle zu haben scheint14.
Zu den möglichen Einschränkungen des Protokolls gehört der selbstlimitierende monophasische Verlauf der EAE, der chronisch werden kann, wenn die Konzentrationen von Mykobakterien im Adjuvans und Pertussis-Toxin verdoppelt werden. Dieser Aspekt ist sehr wichtig zu berücksichtigen, insbesondere bei der Untersuchung des neurodegenerativen Aspekts von EAE an Knockout-Mäusen, da das Fehlen der Erholungsphase durch die hohen Dosen der verwendeten Reagenzien und nicht durch die mangelnde Funktion bestimmter Gene verursacht werden kann. Obwohl das oben beschriebene Protokoll auf andere EAE-Protokolle angewendet werden kann, indem die Stämme und das Alter der Mäuse oder die Art und Menge des Proteins variiert werden, müssen die Versuchsgruppen nach Alter und Geschlecht abgeglichen werden, um sicherzustellen, dass EAE-Experimente methodisch korrekt durchgeführt werden.
Da die Inzidenz der Krankheit variieren kann, werden Empfehlungen zur Fehlerbehebung wie folgt empfohlen: Die optimale Konzentration von M. paratuberculosis kann zwischen 2 und 4 mg/ml liegen, und ein Drei-Wege-Konnektor kann zum Mischen kleiner Volumina des Antigens in der wässrigen Phase verwendet werden. Wir haben ein Verfahren zur Herstellung der Emulsion unter Verwendung eines Homogenisators beschrieben; Ein alternatives und einfaches Verfahren zum Mischen kleiner Mengen von Antigen in der wässrigen Phase, in der Ölphase, beinhaltet jedoch die Verwendung einer Drei-Wege-Anschlussverschraubung, an die zwei Glasspritzen angeschlossen sind. Zusammenfassend konnten wir M. paratuberculosis als potenten adjuvanten Kandidaten für die Induktion aktiver EAE identifizieren. Weitere Studien über die Wirkungsweise und die Art der Immunität, die bei verschiedenen Tierarten induziert wird, werden das Vertrauen in die Möglichkeit erhöhen, diese alternative Methode anzuwenden, um den Mechanismus der Neuroinflammation zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft unterstützt (Förder-Nr. JP 23K14675).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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