Summary
Här presenterar vi ett alternativt protokoll för att aktivt inducera experimentell autoimmun encefalomyelit hos C57BL/6-möss, med användning av det immunogena epitopmyelinoligodendrocytglykoproteinet (MOG)35-55 suspenderat i ofullständig Freunds adjuvans innehållande den värmedödade Mycobacterium avium-underarten paratuberkulos.
Abstract
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) inducerad av myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) kräver immunisering av en MOG-peptid emulgerad i fullständigt Freunds adjuvans (CFA) innehållande inaktiverad Mycobacterium tuberculosis. De antigena komponenterna i mykobakterien aktiverar dendritiska celler för att stimulera T-celler att producera cytokiner som främjar Th1-svaret via tollliknande receptorer. Därför är mängden och arten av mykobakterier som finns under den antigena utmaningen direkt relaterade till utvecklingen av EAE. Detta metodpapper presenterar ett alternativt protokoll för att inducera EAE i C57BL / 6-möss med hjälp av en modifierad ofullständig Freunds adjuvans innehållande den värmedödade Mycobacterium avium-underarten paratuberculosis stam K-10.
M. paratuberculosis, en medlem av Mycobacterium avium-komplexet, är orsakssambandet till Johnes sjukdom hos idisslare och har identifierats som en riskfaktor för flera humana T-cellmedierade störningar, inklusive multipel skleros. Sammantaget visade möss immuniserade med Mycobacterium paratuberculosis tidigare debut och större sjukdomssvårighetsgrad än möss immuniserade med CFA innehållande stammen av M. tuberculosis H37Ra vid samma doser på 4 mg / ml. De antigena determinanterna för Mycobacterium avium-underarten paratuberculosis (MAP) stam K-10 kunde inducera ett starkt Th1-cellulärt svar under effektorfasen, kännetecknat av signifikant högre antal T-lymfocyter (CD4 + CD27 +), dendritiska celler (CD11c + I-A / I-E +) och monocyter (CD11b + CD115 +) i mjälten jämfört med möss immuniserade med CFA. Vidare verkade det proliferativa T-cellssvaret på MOG-peptiden vara högst hos M. paratuberkulosimmuniserade möss. Användning av en encefalitogen (t.ex. MOG35-55) emulgerad i ett adjuvans innehållande M. paratuberculosis i formuleringen kan vara en alternativ och validerad metod för att aktivera dendritiska celler för priming av myelinepitopspecifika CD4+ T-celler under induktionsfasen av EAE.
Introduction
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en vanlig modell för studier av humana demyeliniserande störningar1. Det finns flera modeller av EAE: aktiv immunisering med olika myelinpeptider i kombination med potenta adjuvanser, passiv immunisering genom in vitro-överföring av myelinspecifika CD4+ lymfocyter och transgena modeller av spontan EAE2. Var och en av dessa modeller har specifika funktioner som gör att olika aspekter av EAE kan studeras, såsom start, effektorfas eller kronisk fas. Myelinoligodendrocytglykoproteinmodellen (MOG) av EAE är en bra modell för att studera de immunmedierade mekanismerna för kronisk neuroinflammation och demyelinisering, eftersom den kännetecknas av mononukleär inflammatorisk infiltration, demyelinisering i perifer vit substans och minskad återhämtning efter sjukdomen topp1.
MOG-EAE induceras genom immunisering av känsliga möss med peptiden MOG35-55 i fullständigt Freunds adjuvans (CFA), följt av en intraperitoneal injektion av kikhostetoxin. Detta ökar permeabiliteten hos blod-hjärnbarriären och tillåter myelinspecifika T-celler aktiverade i periferin att nå centrala nervsystemet (CNS), där de kommer att reaktiveras3. CFA spelar en nyckelroll i induktionen av EAE genom att förbättra antigenupptaget av antigenpresenterande celler och uttrycket av cytokiner relaterade till humoral- och cellmedierade svar4. Denna mekanism beror huvudsakligen på närvaron av dödad Mycobacterium tuberculosis emulgerad i olja, vars komponenter ger en stark stimulans för immunsystemet5. Faktum är att induktionen av EAE är direkt relaterad till mängden mykobakterie närvarande under den antigena utmaningen6.
Tillägg av andra dödade mykobakterier, såsom Mycobacterium butyricum, till ofullständig Freunds adjuvans7, liksom effekten av adjuvanskombinationer8, kan modulera det kliniska förloppet av EAE och följaktligen påverka resultatens reproducerbarhet. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), det etiologiska medlet för Johnes sjukdom hos idisslare, har associerats med inflammatoriska störningar i humant CNS 9, eftersom dess antigena komponenter kan framkalla ett starkt humoralt och cellmedierat svar hos patienter med multipel skleros och neuromyelit optica spectrum disorder9. Därför visar vi i detta protokoll en alternativ och reproducerbar metod för att inducera MOG-EAE genom att ersätta M. tuberculosis i CFA med M. paratuberculosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla musförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Juntendo University School of Medicine (godkännandenummer 290238) och genomfördes i enlighet med National Institutes of Health Guidelines for Animal Experimentation.
1. Allmänna kommentarer om experimentet
- Inhysa mössen i enskilda burar i djuranläggningen under kontrollerade, patogenfria förhållanden vid 23 °C ± 2 °C med 50 % ± 10 % luftfuktighet och en 12 timmars ljus/mörk cykel med fri tillgång till mat och vatten.
- Injicera mössen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan antigen och CFA och använd dem som negativa respektive positiva kontroller.
2. Beredning av mykobakteriella antigener
- Odla M. paratuberculosis K-10-stammen i Middlebrook flytande medium 7H9 berikad med 10% OADC (oljesyra, albumin, dextros, katalas), 0,005% Tween 80 och 2 mg / L mykobaktin J i 2 veckor i T25-vävnadsodlingskolvar vid 37 ° C. Bedöm kolonitillväxten regelbundet genom visuell inspektion.
VARNING: Hantera M. paratuberculosis i en biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) anläggning. - Odla anrikningskulturen i 500 ml Erlenmeyerkolv med en suspension av 1,7 ×10 5 kolonibildande enheter (CFU)/ml i en slutlig volym på 200 ml (samma medium som steg 2.1) i en skakinkubator i 1 vecka.
OBS: Eftersom förorenande organismer kan påverka resultaten måste bakterierna inokuleras på Middlebrook 7H10 fasta medier för att bestämma kolonimorfologi och för att verifiera renhet med konventionella polymeraskedjereaktionssatser (PCR) för M. paratuberculosis. - Inaktivera bakteriesuspensionerna i 5–10 minuter vid 70 °C och centrifugera vid 3 000 × g i 10 minuter. Tvättade den vägda pelleten i PBS två gånger, stör genom ultraljudsbehandling och förvaras vid -20 ° C.
- Överför pelleten till en steril behållare och frys den med torris eller flytande kväve. Överför omedelbart till en frystorkningskammare.
- Frystorka (4 timmar vid -50 °C under vakuum) M. paratuberkulos enligt maskinhandboken.
- I slutet av lyofilisering, ta bort behållaren i rostfritt stål från frystorken och överför den till en biorengöringsbänk. Använd en spatel av rostfritt stål för att lossa de torkade MAP-klumparna som sitter fast på innerväggen i behållaren av rostfritt stål och pulverisera dem så fint som möjligt.
- Väg de pulveriserade cellerna med hjälp av en elektronisk våg och placera dem manuellt i en aseptisk 10 ml injektionsflaska i en koncentration av 10 mg/ml.
OBS: Celldensiteten kvantifierades som gram torrvikt per liter prov. Efter 3 veckor innehåller 1 mg (våtvikt) bakteriecellpellet cirka 2,5 × 108 CFU.
3. Framställning av MOG 35-55 emulsion
- Mal innehållet i en injektionsflaska med torkad M. paratuberculosis (10 mg) till ett fint pulver med mortel och mortelstöt och tillsätt 10 ml till ofullständigt Adjuvans från Freund så att en 10 mg/ml stamlösning erhålls. Förvaras vid -4 °C.
- Före immunisering späds stamlösningen till en slutlig koncentration på 4 mg/ml.
- Späd peptiden MOG35-55 iddH2Otill en slutlig koncentration på 2 mg/ml och förvara vid -20 °C.
- Använd en homogenisator och blanda MOG35-55-lösningen (2 mg/ml) med en lika stor volym adjuvans (4 mg/ml) från steg 3.2 i ett 5 ml rör tills en tjock emulsion bildas. Efter varje 10 s blandning, placera lösningen på is i 20 sekunder och snurra röret för att återvinna all lösning.
- Överför emulsionen till en 1 ml spruta, ta bort all luft och tillsätt en 27 G nål. Emulsionen är nu klar för injektion.
NOT. Eftersom en viss förlust av den viskösa emulsionen av MOG35-55 inträffar under beredningen är det bäst att förbereda 1,5 gånger den mängd som behövs.
4. Immunisering av djur
- Bedöva djuren med inandning av isofluran för att minimera stress på djuren.
- Injicera emulsionen (200 μL innehållande 200 μg/mus MOG35-55) subkutant i nedre delen av ryggen.
- Administrera en dos kikhostetoxin (100 μl innehållande 200 ng/mus) intraperitonealt dag 0 och 2 efter immunisering.
VARNING: kikhostetoxin har en multipel undertryckande effekt på immunsystemet; Undvik förtäring och kontakt med ögon och hud.
5. Klinisk granskning
- Övervaka mössen dagligen för vikt och kliniska tecken. Använd följande poängsystem: 0 = inga kliniska tecken; 1 = slapp svans; 2 = försämring av rätningsreflexen och svaghet i bakbenen; 3 = fullständig förlamning av bakbenen; 4 = fullständig förlamning av bakbenen med partiell förlamning av frambenen; 5 = döende.
OBS: Vid den första observationen av kliniska tecken får djuren ökad tillgång till vatten och mat. Gnagare chow mjukas och fuktas och placeras sedan på burgolvet från matbehållaren. När det gäller dehydrerade djur administreras subkutant vätsketillskott, eller en gnagaruppslamning ges via oral sondmatning. Om en mus kräver denna typ av hjälp i över 3 dagar kommer eutanasi att genomföras. - För att undvika eller minimera djurs smärta och ångest, använd följande humana endpoints: viktminskning större än 20%, klinisk poäng ≥4,0, frånvaro av rätningsreflex vid poäng 3 och när djuret inte kan få tillgång till foder eller vatten i 24 timmar.
OBS: Mössen avlivades på dag 30 efter EAE-induktion genom intraperitoneala injektioner av pentobarbital (≥150 mg/kg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grupper av C57BL/6-möss (totalt n = 15/grupp) immuniserades med MOG35-55 i en emulsion innehållande M. paratuberculosis eller med den vanliga metoden med CFA. Alla grupper av möss manifesterade en akut monofasisk sjukdom som kännetecknades av en enda topp av funktionshinder observerad vid 14-17 dagar, följt av en partiell återhämtning av symtom under de närmaste 10 dagarna (figur 1A). Möss immuniserade med adjuvansen innehållande M. paratuberculosis, oavsett kön, visade en tidigare debut från 8 till 9 dagar efter immunisering och större svårighetsgrad i den akuta fasen än möss immuniserade med CFA (figur 1B). Det fanns ingen signifikant skillnad i kroppsvikt mellan grupperna (figur 1C). Cytofluorimetrisk analys av mjältceller från EAE-möss och proliferativ aktivitet av T-lymfocyter utvärderad genom 3H-tymidinininkorporering utfördes, som tidigare publicerats11. Alla mjältceller hos EAE-möss, oavsett vilket adjuvans som användes, visade ett starkt proliferativt svar på peptiden MOG35-55, medan de inte prolifererade som svar på kontrollpeptiden ovalbumin (figur 1D). M. paratuberkulosimmuniserade EAE-möss visade en ökad andel T-lymfocyter (CD4 + CD27 +), dendritiska celler (CD11c + I-A / I-E +) och monocyter (CD11b + CD115 +) i mjälten jämfört med CFA-immuniserade möss under den akuta fasen av EAE (figur 1E). Histologisk analys med hematoxylin-eosin avslöjade en typisk perivaskulär och meningeal mononukleär inflammatorisk infiltration i hjärnan och ryggmärgen (figur 1F).
Figur 1: Representativa EAE-resultat . a) Kliniska poäng för möss utvärderas dagligen. b) skillnader i sjukdomsförlopp, c) kroppsvikt, (D) T-cells proliferativa svar på MOG35-55-peptiden ; e) immuncellspopulationer i splenetocyter under den akuta fasen, (F) histologiska bilder av ryggmärgssnitt (4x förstoring) färgade med hematoxylin-eosin (skalbar = 200 μm) under den akuta fasen. Pilar indikerar inflammatoriska infiltrat. Data visar kombinerade resultat från tre oberoende experiment (n = 5 möss/grupp/experiment). Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse beräknad med hjälp av en enkelriktad ANOVA följt av Bonferronis post hoc-test eller Mann-Whitney U-test. Förkortningar: EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; MOG = myelinoligodendrocytglykoprotein; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; CFA = komplett Freunds adjuvans. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerade ett robust alternativt protokoll för att aktivt inducera svår EAE i C57BL / 6J-möss med peptiden MOG35-55 emulgerad i ett adjuvans innehållande M. paratuberculosis10. Induktionen av EAE med denna metod resulterade i en allvarligare sjukdom än den som inducerades av det gemensamma protokollet med CFA. Denna skillnad kan bero på de olika lipidkomponenterna i mykobakteriernas cellvägg11. I själva verket, till skillnad från andra mykobakterier, producerar M. paratuberculosis ett lipopentapeptidantigen på cellväggsytan istället för glykopeptidolipider11. Denna lipopentapeptid korsreagerade inte med andra närbesläktade arter och har visat sig vara ett mål för ett starkt specifikt humoralt svar hos patienter med autoimmuna sjukdomar12. Mykobakterier har patogenassocierade molekylära mönster som spelar olika roller i immunsvar9. Till exempel har vi nyligen visat att oral immunisering med M. paratuberculosis ökar svårighetsgraden av MOG-EAE13, medan vaccination med bacillus Calmette-Guerin (BCG)-Tokyo-172 verkar ha en skyddande roll i utvecklingen av aktiva och spontana EAE-modeller14.
Potentiella begränsningar av protokollet inkluderar det självbegränsade monofasiska förloppet av EAE, vilket kan bli kroniskt om koncentrationerna av mykobakterier i adjuvans- och kikhostetoxinet fördubblas. Denna aspekt är mycket viktig att överväga, särskilt när man studerar den neurodegenerativa aspekten av EAE med hjälp av knockoutmöss, eftersom frånvaron av återhämtningsfas kan orsakas av de höga doserna av de reagens som används och inte av bristen på funktion hos vissa gener. Även om protokollet som beskrivs ovan kan tillämpas på andra EAE-protokoll genom att variera stammar och ålder hos möss eller typ och mängd protein, för att säkerställa att EAE-experiment utförs på ett metodologiskt korrekt sätt, måste experimentgrupper matchas för ålder och kön.
Eftersom förekomsten av sjukdomen kan variera är rekommendationer för felsökning: den optimala M. paratuberculosis-koncentrationen kan variera från 2 till 4 mg / ml och en trevägskontakt kan användas för att blanda små volymer av antigenet i vattenfasen. Vi har beskrivit en metod för framställning av emulsionen med hjälp av en homogenisator; En alternativ och enkel metod för blandning av små volymer antigen i vattenfasen, i oljefasen, innefattar emellertid användning av en trevägskontaktbeslag, till vilken två glassprutor är anslutna. Sammanfattningsvis identifierade vi M. paratuberculosis som en potent adjuvanskandidat vid induktion av aktiv EAE. Ytterligare studier av verkningsmekanismen och typen av immunitet inducerad hos olika djurarter kommer att öka förtroendet för möjligheten att anta denna alternativa metod för att förstå mekanismen för neuroinflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd från ett bidrag från Japanese Society for the promotion of Science (bidrag nr. JP 23K14675).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G.
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
