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Immunology and Infection

प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस के दौरान ऑटोएंटीजन की इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाने में माइकोबैक्टीरियम पैराट्यूबरकुलोसिस की सहायक गतिविधि

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65422
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,3
1Department of Neurology, Juntendo University, 2Biomedical Research Core Facilities, Juntendo University, 3Neurodegenerative Disorders Collaborative laboratory, RIKEN Center for Brain Science

Summary

यहां, हम सी 57बीएल /6 चूहों में प्रयोगात्मक ऑटोम्यून्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस को सक्रिय रूप से प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें इम्युनोजेनिक एपिटोप माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) 35-55 का उपयोग किया जाता है, जो अपूर्ण फ्रायंड के सहायक में निलंबित होता है जिसमें गर्मी से मारे गए माइकोबैक्टीरियम एवियम उप-प्रजाति पैराट्यूबरकुलोसिस होते हैं।

Abstract

माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) द्वारा प्रेरित प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) को निष्क्रिय माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस युक्त पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) में एक एमओजी पेप्टाइड इमल्सीफाइड द्वारा टीकाकरण की आवश्यकता होती है। माइकोबैक्टीरियम के एंटीजेनिक घटक टी-कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए डेंड्राइटिक कोशिकाओं को सक्रिय करते हैं ताकि साइटोकिन्स का उत्पादन किया जा सके जो टोल-जैसे रिसेप्टर्स के माध्यम से टीएच 1 प्रतिक्रिया को बढ़ावा देते हैं। इसलिए, एंटीजेनिक चुनौती के दौरान मौजूद माइकोबैक्टीरिया की मात्रा और प्रजातियां सीधे ईएई के विकास से संबंधित हैं। यह विधि पत्र सी 57बीएल /6 चूहों में ईएई को प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें एक संशोधित अपूर्ण फ्रायंड के सहायक का उपयोग किया जाता है जिसमें गर्मी से मारे गए माइकोबैक्टीरियम एवियम उप-प्रजाति पैराट्यूबरकुलोसिस स्ट्रेन के -10 शामिल हैं।

पैराट्यूबरकुलोसिस, माइकोबैक्टीरियम एवियम कॉम्प्लेक्स का एक सदस्य, जुगाली करने वालों में जॉन की बीमारी का प्रेरक एजेंट है और मल्टीपल स्केलेरोसिस सहित कई मानव टी-सेल-मध्यस्थता विकारों के लिए जोखिम कारक के रूप में पहचाना गया है। कुल मिलाकर, माइकोबैक्टीरियम पैराट्यूबरकुलोसिस के साथ प्रतिरक्षित चूहों ने 4 मिलीग्राम / एमएल की समान खुराक पर एम ट्यूबरकुलोसिस एच 37 आरए के तनाव वाले सीएफए के साथ प्रतिरक्षित चूहों की तुलना में पहले शुरुआत और अधिक बीमारी की गंभीरता दिखाई। माइकोबैक्टीरियम एवियम उप-प्रजाति पैराट्यूबरकुलोसिस (एमएपी) स्ट्रेन के -10 के एंटीजेनिक निर्धारक प्रभावक चरण के दौरान एक मजबूत टीएच 1 सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रेरित करने में सक्षम थे, जो टी-लिम्फोसाइटों (सीडी 4 + सीडी 27 +), डेंड्राइटिक कोशिकाओं (सीडी 11 सी + आई-ए / आई-ई +), और मोनोसाइट्स (सीडी 11 बी + सीडी 115 +) सीएफए के साथ प्रतिरक्षित चूहों की तुलना में प्लीहा में। इसके अलावा, एमओजी पेप्टाइड के लिए प्रोलिफेरेटिव टी-सेल प्रतिक्रिया एम पैराट्यूबरकुलोसिस-प्रतिरक्षित चूहों में सबसे अधिक दिखाई दी। फॉर्मूलेशन में एम. पैराट्यूबरकुलोसिस युक्त सहायक में इमल्सीफाइड एन्सेफेलिटोजेन (जैसे, एमओजी35-55) का उपयोग ईएई के प्रेरण चरण के दौरान माइलिन एपिटोप-विशिष्ट सीडी 4 + टी-कोशिकाओं को प्राइमिंग के लिए डेंड्राइटिक कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए एक वैकल्पिक और मान्य विधि हो सकती है।

Introduction

प्रायोगिक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मानव डिमाइलेटिंगविकारों के अध्ययन के लिए एक सामान्य मॉडल है। ईएई के कई मॉडल हैं: शक्तिशाली सहायक दवाओं के साथ संयोजन में विभिन्न माइलिन पेप्टाइड्स का उपयोग करके सक्रिय टीकाकरण, माइलिन-विशिष्ट सीडी 4 + लिम्फोसाइटों के इन विट्रो ट्रांसफर द्वारा निष्क्रिय टीकाकरण, और सहज ईएई2 के ट्रांसजेनिक मॉडल। इनमें से प्रत्येक मॉडल में विशिष्ट विशेषताएं हैं जो ईएई के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने की अनुमति देती हैं, जैसे कि शुरुआत, प्रभावकारक चरण या पुरानी चरण। ईएई का माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) मॉडल क्रोनिक न्यूरोइन्फ्लेमेशन और डिमाइलिनेशन के प्रतिरक्षा-मध्यस्थता तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है, क्योंकि यह मोनोन्यूक्लियर भड़काऊ घुसपैठ, परिधीय सफेद पदार्थ में विघटन और रोग के चरम1 के बाद कम वसूली की विशेषता है।

एमओजी-ईएई को पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) में पेप्टाइड एमओजी35-55 के साथ अतिसंवेदनशील चूहों के टीकाकरण से प्रेरित किया जाता है, इसके बाद पर्टुसिस विष का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन होता है। यह रक्त-मस्तिष्क बाधा की पारगम्यता को बढ़ाता है और परिधि में सक्रिय माइलिन-विशिष्ट टी-कोशिकाओं को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) तक पहुंचने की अनुमति देता है, जहां उन्हें फिरसे सक्रिय किया जाएगा। सीएफए एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं द्वारा एंटीजन अपटेक को बढ़ाकर और ह्यूमरल- और सेल-मध्यस्थताप्रतिक्रियाओं से संबंधित साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर ईएई के प्रेरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह तंत्र मुख्य रूप से तेल में मारे गए माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस इमल्सीफाइड की उपस्थिति के कारण है, जिसके घटकप्रतिरक्षा प्रणाली के लिए एक मजबूत उत्तेजना प्रदान करते हैं। वास्तव में, ईएई का प्रेरण सीधे एंटीजेनिक चुनौती6 के दौरान मौजूद माइकोबैक्टीरियम की मात्रा से संबंधित है।

अपूर्ण फ्रायंड के सहायक7 के साथ-साथ सहायक संयोजन8 के प्रभाव में माइकोबैक्टीरियम ब्यूटिरिकम जैसे अन्य मारे गए माइकोबैक्टीरिया के अलावा, ईएई के नैदानिक पाठ्यक्रम को संशोधित कर सकते हैं और परिणामस्वरूप परिणामों की प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं। माइकोबैक्टीरियम एवियम उप-प्रजाति पैराट्यूबरकुलोसिस (एमएपी), जुगाली करने वालों में जॉन की बीमारी का ईटियोलॉजिकल एजेंट, मानव सीएनएस 9 के भड़काऊ विकारों से जुड़ा हुआ है, क्योंकि इसके एंटीजेनिक घटक मल्टीपल स्केलेरोसिस और न्यूरोमाइलाइटिस ऑप्टिका स्पेक्ट्रम विकार9 वाले रोगियों में एक मजबूत ह्यूमर- और सेल-मध्यस्थता प्रतिक्रिया प्राप्त करने में सक्षम हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हम सीएफए में एम. ट्यूबरकुलोसिस को एम. पैराट्यूबरकुलोसिस के साथ बदलकर एमओजी-ईएई को प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि दिखाते हैं।

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Protocol

सभी माउस प्रयोगों को जुन्टेंडो यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (अनुमोदन संख्या 290238) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और पशु प्रयोग के लिए स्वास्थ्य दिशानिर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया था।

1. प्रयोग पर सामान्य टिप्पणियाँ

  1. जानवरों की सुविधा में अलग-अलग पिंजरों में चूहों को नियंत्रित, रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में 23 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस पर 50% ± 10% आर्द्रता के साथ रखें, और भोजन और पानी तक पहुंच के साथ 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र।
  2. एंटीजन और सीएफए के बिना फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ चूहों को इंजेक्ट करें, और उन्हें क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें।

2. माइकोबैक्टीरियल एंटीजन की तैयारी

  1. मिडलब्रुक तरल माध्यम 7एच9 में एम. पैराट्यूबरकुलोसिस के-10 स्ट्रेन को 10% ओएडीसी (ओलिक एसिड, एल्ब्यूमिन, डेक्सट्रोज, कैटालेज), 0.005% ट्वीन 80 और 2 मिलीग्राम/लीटर माइकोबैक्टिन जे से समृद्ध 2 सप्ताह के लिए टी 25 टिशू कल्चर फ्लास्क में 37 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करें। दृश्य निरीक्षण द्वारा नियमित रूप से कॉलोनी के विकास का आकलन करें।
    सावधानी: जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) सुविधा में एम पैराट्यूबरकुलोसिस को संभालें।
  2. 1 सप्ताह के लिए हिलाने वाले इनक्यूबेटर में 200 एमएल (चरण 2.1 के समान माध्यम) की अंतिम मात्रा में 1.7 × 105 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू)/एमएल के निलंबन के साथ 500 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में संवर्धन संवर्धन विकसित करें।
    नोट: चूंकि दूषित जीव परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए बैक्टीरिया को कॉलोनी आकृति विज्ञान निर्धारित करने और एम. पैराट्यूबरकुलोसिस के लिए पारंपरिक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) डिटेक्शन किट द्वारा शुद्धता को सत्यापित करने के लिए मिडलब्रुक 7 एच 10 ठोस मीडिया पर टीका लगाया जाना चाहिए।
  3. 70 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन को निष्क्रिय करें और 10 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। पीबीएस में तौले गए छर्रों को दो बार धोया, सोनिकेशन द्वारा बाधित किया, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया।
  4. गोली को एक बाँझ कंटेनर में स्थानांतरित करें और इसे सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीज करें। तुरंत फ्रीज-सुखाने वाले कक्ष में स्थानांतरित करें।
  5. फ्रीज-ड्राई (वैक्यूम के तहत -50 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे) मशीन मैनुअल के अनुसार एम।
  6. लियोफिलाइजेशन के अंत में, फ्रीज-ड्रायर से स्टेनलेस-स्टील कंटेनर को हटा दें और इसे जैव-सफाई बेंच में स्थानांतरित करें। स्टेनलेस-स्टील कंटेनर की आंतरिक दीवार का पालन करने वाले सूखे एमएपी गांठों को हटाने के लिए स्टेनलेस-स्टील स्पैटुला का उपयोग करें और उन्हें यथासंभव बारीक पीस लें।
  7. एक इलेक्ट्रॉनिक संतुलन का उपयोग करके पल्वराइज्ड कोशिकाओं का वजन करें और मैन्युअल रूप से उन्हें 10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर एक सड़न रोकनेवाला 10 एमएल शीशी में रखें।
    नोट: सेल घनत्व को प्रति लीटर नमूने में सूखे वजन के ग्राम के रूप में निर्धारित किया गया था। 3 सप्ताह के बाद, बैक्टीरियल सेल गोली के 1 मिलीग्राम (गीले वजन) में लगभग 2.5 × 108 सीएफयू होता है।

3. एमओजी 35-55 इमल्शन की तैयारी

  1. सूखे एम. पैराट्यूबरकुलोसिस (10 मिलीग्राम) की एक शीशी की सामग्री को मोर्टार और मूसल के साथ एक बारीक पाउडर में पीस लें और 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए अपूर्ण फ्रायंड के सहायक में 10 मिलीलीटर जोड़ें। -4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. टीकाकरण से पहले, स्टॉक समाधान को 4 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें।
  3. डीडीएच 2 ओ में पेप्टाइड एमओजी35-55 को2मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. होमोजिनाइज़र का उपयोग करके, एमओजी35-55 समाधान (2 मिलीग्राम / एमएल) को 5 एमएल ट्यूब में चरण 3.2 से सहायक (4 मिलीग्राम / एमएल) की समान मात्रा के साथ मिलाएं जब तक कि एक मोटी इमल्शन न बन जाए। मिश्रण के हर 10 सेकंड के बाद, घोल को 20 सेकंड के लिए बर्फ पर रखें, और सभी घोल को पुनर्प्राप्त करने के लिए ट्यूब को स्पिन करें।
  5. इमल्शन को 1 एमएल सिरिंज में स्थानांतरित करें, सभी हवा को हटा दें, और 27 ग्राम सुई जोड़ें। इमल्शन अब इंजेक्शन के लिए तैयार है।
    नोट। चूंकि एमओजी35-55 के चिपचिपे इमल्शन का कुछ नुकसान तैयारी के दौरान होता है, इसलिए आवश्यक मात्रा का 1.5 गुना तैयार करना सबसे अच्छा है।

4. पशु टीकाकरण

  1. जानवरों पर तनाव को कम करने के लिए आइसोफ्लुरेन के साँस लेने के साथ जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
  2. इमल्शन (200 μL जिसमें MOG35-55 के 200 μg / माउस होते हैं) को पीठ के निचले हिस्से में चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
  3. टीकाकरण के बाद 0 और 2 दिनों में पर्टुसिस टॉक्सिन (100 μL जिसमें 200 ng / माउस होता है) की एक खुराक इंट्रापरिटोनियल रूप से दें।
    सावधानी: पर्टुसिस विष का प्रतिरक्षा प्रणाली पर कई दमनकारी प्रभाव पड़ता है; आंखों और त्वचा के साथ अंतर्ग्रहण और संपर्क से बचें।

5. नैदानिक मूल्यांकन

  1. वजन और नैदानिक संकेतों के लिए रोजाना चूहों की निगरानी करें। निम्नलिखित स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग करें: 0 = कोई नैदानिक संकेत नहीं; 1 = फ्लेसिड पूंछ; 2 = दाएं प्रतिवर्त की हानि और पिछले अंगों की कमजोरी; 3 = पिछले अंगों का पूर्ण पक्षाघात; 4 = पिछले अंगों का पूर्ण पक्षाघात और अग्रअंगों का आंशिक पक्षाघात; 5 = मृतप्राय है।
    नोट: नैदानिक संकेतों के प्रारंभिक अवलोकन पर, जानवरों को पानी और भोजन तक बढ़ी हुई पहुंच प्रदान की जाती है। कृंतक चाउ को नरम और नम किया जाता है, फिर खाद्य हॉपर से पिंजरे के फर्श पर रखा जाता है। निर्जलित जानवरों के मामले में, चमड़े के नीचे द्रव पूरकता प्रशासित की जाती है, या मौखिक गैवेज के माध्यम से एक कृंतक चाउ घोल दिया जाता है। यदि एक माउस को 3 दिनों से अधिक समय तक इस प्रकार की सहायता की आवश्यकता होती है, तो इच्छामृत्यु आयोजित की जाएगी।
  2. जानवरों के दर्द और संकट से बचने या कम करने के लिए, निम्नलिखित मानव समापन बिंदुओं का उपयोग करें: शरीर के वजन में 20% से अधिक की कमी, नैदानिक स्कोर ≥4.0, स्कोर 3 पर राइटिंग रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति, और जब जानवर 24 घंटे के लिए फ़ीड या पानी तक पहुंचने में असमर्थ है।
    नोट: चूहों को पैंटोबार्बिटल (≥ 150 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा ईएई प्रेरण के बाद 30 वें दिन इच्छामृत्यु दी गई थी।

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Representative Results

C57BL/6 चूहों (कुल n = 15/समूह) के समूहों को M. पैराट्यूबरकुलोसिस युक्त इमल्शन में MOG35-55 के साथ या CFA के साथ सामान्य विधि द्वारा प्रतिरक्षित किया गया था। चूहों के सभी समूहों ने 14-17 दिनों में देखी गई विकलांगता के एकल शिखर की विशेषता वाले एक तीव्र मोनोफैसिक रोग को प्रकट किया, इसके बाद अगले 10 दिनों में लक्षणों की आंशिक वसूली हुई (चित्रा 1 ए)। एम पैराट्यूबरकुलोसिस युक्त सहायक के साथ प्रतिरक्षित चूहों, लिंग के बावजूद, टीकाकरण के 8 से 9 दिनों के बाद पहले शुरुआत हुई और सीएफए के साथ प्रतिरक्षित चूहों की तुलना में तीव्र चरण में अधिक गंभीरता दिखाई दी (चित्रा 1 बी)। समूहों के बीच शरीर के वजन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (चित्रा 1 सी)। ईएई चूहों से प्लीहा कोशिकाओं का साइटोफ्लोरिमेट्रिक विश्लेषण और 3एच-थाइमिडीन निगमन द्वारा मूल्यांकन किए गए टी-लिम्फोसाइटों की प्रोलिफेरेटिव गतिविधि का प्रदर्शन किया गया था, जैसा कि पहले प्रकाशित11 में प्रकाशित किया गया था। ईएई चूहों की सभी प्लीहा कोशिकाओं, उपयोग किए गए सहायक की परवाह किए बिना, पेप्टाइड एमओजी35-55 के लिए एक मजबूत प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया दिखाई, जबकि वे नियंत्रण पेप्टाइड ओवएल्ब्यूमिन (चित्रा 1 डी) के जवाब में प्रसार नहीं करते थे। पैराट्यूबरकुलोसिस-प्रतिरक्षित ईएई चूहों ने ईएई के तीव्र चरण के दौरान सीएफए-प्रतिरक्षित चूहों की तुलना में प्लीहा में टी-लिम्फोसाइट्स (सीडी 4 + सीडी 27 +), डेंड्राइटिक कोशिकाओं (सीडी 11 सी + आई-ए / आई-ई +), और मोनोसाइट्स (सीडी 11 बी + सीडी 115 +) के अनुपात में वृद्धि देखी (चित्रा 1 ई)। हेमटोक्सिलिन-ईओसिन द्वारा हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में एक विशिष्ट पेरिवास्कुलर और मेनिंगियल मोनोन्यूक्लियर भड़काऊ घुसपैठ का खुलासा किया (चित्रा 1 एफ)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि ईएई परिणाम। (ए) चूहों के नैदानिक स्कोर का दैनिक मूल्यांकन किया जाता है; (बी) रोग पाठ्यक्रम में अंतर; (सी) शरीर का वजन; (डी) एमओजी35-55 पेप्टाइड के लिए टी-सेल प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया; (ई) तीव्र चरण के दौरान स्प्लेनोसाइट्स में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी; (एफ) तीव्र चरण के दौरान हेमटोक्सिलिन-ईओसिन (स्केल बार = 200 μm) से सना रीढ़ की हड्डी के वर्गों (4x आवर्धन) की हिस्टोलॉजिकल छवियां। तीर भड़काऊ घुसपैठ का संकेत देते हैं। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों (एन = 5 चूहों / समूह / प्रयोग) के संयुक्त परिणाम दिखाता है। डेटा को एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके गणना की गई मानक विचलन ± औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है, जिसके बाद बोनफेरोनी का पोस्ट हॉक टेस्ट या मैन-व्हिटनी यू परीक्षण होता है। संक्षेप: ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस; एमओजी = माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; सीएफए = फ्रायंड का पूर्ण सहायक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमने एम. पैराट्यूबरकुलोसिस10 युक्त सहायक में पेप्टाइड एमओजी35-55 इमल्सीफाइड का उपयोग करके सी 57बीएल /6 जे चूहों में गंभीर ईएई को सक्रिय रूप से प्रेरित करने के लिए एक मजबूत वैकल्पिक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। इस विधि द्वारा ईएई के प्रेरण के परिणामस्वरूप सीएफए के साथ सामान्य प्रोटोकॉल द्वारा प्रेरित होने की तुलना में अधिक गंभीर बीमारी हुई। यह अंतर माइकोबैक्टीरिया11 की कोशिका भित्ति में विभिन्न लिपिडिक घटकों के कारण हो सकता है। वास्तव में, अन्य माइकोबैक्टीरिया के विपरीत, एम पैराट्यूबरकुलोसिस ग्लाइकोपेप्टिडोलिपिड्स11 के बजाय सेल की दीवार की सतह पर एक लिपोपेंटापेप्टाइड एंटीजन का उत्पादन करता है। इस लिपोपेंटापेप्टाइड ने अन्य निकटता से संबंधित प्रजातियों के साथ क्रॉस-प्रतिक्रिया नहीं की और ऑटोइम्यूनविकारों वाले रोगियों में एक मजबूत विशिष्ट ह्यूमोरल प्रतिक्रिया के लिए एक लक्ष्य दिखाया गया है। माइकोबैक्टीरिया में रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न होते हैं जोप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में विभिन्न भूमिका निभाते हैं। उदाहरण के लिए, हमने हाल ही में दिखाया है कि एम पैराट्यूबरकुलोसिस के साथ मौखिक टीकाकरण एमओजी-ईएई13 की गंभीरता को बढ़ाता है, जबकि बैसिलस कैलमेट-गुएरिन (बीसीजी)-टोक्यो -172 के साथ टीकाकरण सक्रिय और सहज ईएई मॉडल14 की प्रगति में सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है।

प्रोटोकॉल की संभावित सीमाओं में ईएई का स्व-सीमित मोनोफैसिक कोर्स शामिल है, जो सहायक और पर्टुसिस विष में माइकोबैक्टीरियम की सांद्रता दोगुनी होने पर क्रोनिक हो सकता है। इस पहलू पर विचार करना बहुत महत्वपूर्ण है, खासकर जब नॉकआउट चूहों का उपयोग करके ईएई के न्यूरोडीजेनेरेटिव पहलू का अध्ययन किया जाता है, क्योंकि वसूली चरण की अनुपस्थिति उपयोग किए गए अभिकर्मकों की उच्च खुराक के कारण हो सकती है और कुछ जीनों के कार्य की कमी के कारण नहीं हो सकती है। इसके अलावा, हालांकि ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल को चूहों के उपभेदों और उम्र या प्रोटीन के प्रकार और मात्रा को बदलकर अन्य ईएई प्रोटोकॉल पर लागू किया जा सकता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि ईएई प्रयोग ों को पद्धतिगत रूप से सही तरीके से किया जाता है, प्रयोगात्मक समूहों को उम्र और लिंग के लिए मिलान किया जाना चाहिए।

चूंकि रोग की घटनाएं भिन्न हो सकती हैं, समस्या निवारण के लिए सिफारिशें हैं: इष्टतम एम पैराट्यूबरकुलोसिस एकाग्रता 2 से 4 मिलीग्राम / एमएल तक हो सकती है, और जलीय चरण में एंटीजन की छोटी मात्रा को मिलाने के लिए तीन-तरफा कनेक्टर का उपयोग किया जा सकता है। हमने होमोजिनाइज़र का उपयोग करके इमल्शन तैयार करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है; हालांकि, तेल चरण में, जलीय चरण में एंटीजन की छोटी मात्रा को मिलाने के लिए एक वैकल्पिक और सरल विधि में तीन-तरफा कनेक्टर फिटिंग का उपयोग शामिल है, जिससे दो ग्लास सिरिंज जुड़े हुए हैं। अंत में, हमने सक्रिय ईएई के प्रेरण में एक शक्तिशाली सहायक उम्मीदवार के रूप में एम पैराट्यूबरकुलोसिस की पहचान की। कार्रवाई के तरीके और विभिन्न जानवरों की प्रजातियों में प्रेरित प्रतिरक्षा के प्रकार पर आगे के अध्ययन से न्यूरोइन्फ्लेमेशन के तंत्र को समझने के लिए इस वैकल्पिक विधि को अपनाने की संभावना में विश्वास बढ़ेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को विज्ञान के प्रचार के लिए जापानी सोसायटी से अनुदान से समर्थन मिला (अनुदान संख्या 10)। जेपी 23K14675)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-mouse CD115 antibody Biolegend, USA 135505 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody Biolegend, USA 101215 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody Biolegend, USA 117313 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody Biolegend, USA 101302 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody Biolegend, USA 116004 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody Biolegend, USA 100753 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody Biolegend, USA 107635 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody Biolegend, USA 128023 for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment Thermo Fisher Scientific, USA BD 211886 for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice Charles River Laboratory, Japan 3 weeks old, male and female
FBS 10279-106 Gibco Life Techologies, USA 42F9155K for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine Eyela, Tokyo, Japan FDU-1200 for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant Difco Laboratories, MD, USA 263810 for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth Difco Laboratories, MD, USA 90003-876 help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 ATCC, USA BAA-968 bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated BD Biosciences, USA 743-26880-EA for use in adjuvant
Mycobactin J Allied Laboratory, MO, USA growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 AnaSpec, USA AS-60130-10 encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264) Sigma-Aldrich, USA S7951-1MG negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution Fujifilm Wako, Osaka Japan 168-22471 From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100 Kinematica for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine Gibco Life Techologies, USA 11875093 For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi PerkinElmer, Waltham, MA, USA NET027W001MC for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend, USA 423105  cytofluorimetry, for cell viability

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  3. Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
  4. Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114 (2013).
  5. Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
  6. Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
  7. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
  8. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
  9. Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
  10. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
  11. Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
  12. Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
  13. Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
  14. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).

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Cossu, D., Tomizawa, Y., Momotani, E., Yokoyama, K., Hattori, N. Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (195), e65422, doi:10.3791/65422 (2023).

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