Summary
Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.
Abstract
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) induzida pela glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) requer imunização por um peptídeo MOG emulsionado em adjuvante de Freund completo (CFA) contendo Mycobacterium tuberculosis inativado. Os componentes antigênicos da micobactéria ativam células dendríticas para estimular as células T a produzir citocinas que promovem a resposta Th1 via receptores toll-like. Portanto, a quantidade e a espécie de micobactérias presentes durante o desafio antigênico estão diretamente relacionadas ao desenvolvimento das EAE. Este trabalho de método apresenta um protocolo alternativo para induzir EAE em camundongos C57BL/6 usando um adjuvante de Freund incompleto modificado contendo a cepa K-10 da subespécie Paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.
M. paratuberculosis, membro do complexo Mycobacterium avium, é o agente causador da doença de Johne em ruminantes e tem sido identificado como um fator de risco para várias doenças mediadas por células T humanas, incluindo esclerose múltipla. Em geral, camundongos imunizados com Mycobacterium paratuberculosis apresentaram início mais precoce e maior gravidade da doença do que camundongos imunizados com CFA contendo a cepa H37Ra de M. tuberculosis nas mesmas doses de 4 mg/mL. Os determinantes antigênicos da cepa K-10 de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir uma forte resposta celular Th1 durante a fase efetora, caracterizada por números significativamente maiores de linfócitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) e monócitos (CD11b+ CD115+) no baço em comparação com camundongos imunizados com CFA. Além disso, a resposta proliferativa de células T ao peptídeo MOG pareceu ser maior em camundongos imunizados com M. paratuberculosis. O uso de um encefalitogênio (por exemplo, MOG35-55) emulsionado em um adjuvante contendo M. paratuberculosis na formulação pode ser um método alternativo e validado para ativar células dendríticas para priming de células T CD4+ específicas para epítopos de mielina durante a fase de indução do EAE.
Introduction
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo comum para o estudo de doenças desmielinizantes humanas1. Existem vários modelos de EAE: imunização ativa usando diferentes peptídeos de mielina em combinação com adjuvantes potentes, imunização passiva por transferência in vitro de linfócitos CD4+ específicos da mielina e modelos transgênicos de EAE2 espontâneo. Cada um desses modelos possui características específicas que permitem o estudo de diferentes aspectos do EAE, como o início, a fase efetora ou a fase crônica. O modelo de glicoproteína de miodendrócitos (MOG) de EAE é um bom modelo para estudar os mecanismos imunomediados de neuroinflamação crônica e desmielinização, pois é caracterizado por infiltrado inflamatório mononuclear, desmielinização na substância branca periférica e recuperação reduzida após o pico da doença1.
O MOG-EAEA é induzido pela imunização de camundongos suscetíveis com o peptídeo MOG35-55 em adjuvante de Freund completo (CFA), seguido por uma injeção intraperitoneal de toxina pertussis. Isso aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica e permite que as células T mielina-específicas ativadas na periferia cheguem ao sistema nervoso central (SNC), onde serão reativadas3. O CFA desempenha um papel fundamental na indução de EAE, aumentando a captação de antígenos pelas células apresentadoras de antígenos e a expressão de citocinas relacionadas a respostas humorais e mediadas por células4. Esse mecanismo deve-se principalmente à presença de Mycobacterium tuberculosis morto emulsionado em óleo, cujos componentes fornecem um forte estímulo para o sistema imune5. De fato, a indução de EAE está diretamente relacionada à quantidade de micobactéria presente durante o desafioantigênico6.
A adição de outras micobactérias mortas, como Mycobacterium butyricum, ao adjuvante de Freundincompleto7, bem como o efeito de combinações adjuvantes8, podem modular o curso clínico das EAE e, consequentemente, influenciar a reprodutibilidade dos resultados. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), agente etiológico da doença de John em ruminantes, tem sido associado a doenças inflamatórias do SNC humano9, uma vez que seus componentes antigênicos são capazes de provocar forte resposta humoral e celular em pacientes com esclerose múltiplae desordem do espectro da neuromielite óptica9. Portanto, neste protocolo, mostramos um método alternativo e reprodutível para induzir MOG-EAE substituindo M. tuberculosis em CFA por M. paratuberculosis.
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Protocol
Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Juntendo (Aprovação Número 290238) e foram conduzidos de acordo com as Diretrizes do National Institutes of Health para Experimentação Animal.
1. Observações gerais sobre a experiência
- Alojar os camundongos em gaiolas individuais no biotério sob condições controladas e livres de patógenos a 23 °C ± 2 °C com 50% ± 10% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso ad libitum a alimentos e água.
- Injetar os camundongos com solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem antígeno e CFA, e usá-los como controles negativos e positivos, respectivamente.
2. Preparação de antígenos micobacterianos
- Cultivar a cepa K-10 de M. paratuberculosis em meio líquido Middlebrook 7H9 enriquecido com 10% de OADC (ácido oleico, albumina, dextrose, catalase), 0,005% Tween 80 e 2 mg/L de micobactina J por 2 semanas em frascos de cultura de tecidos T25 a 37 °C. Avaliar o crescimento da colônia regularmente por inspeção visual.
CUIDADO: Manusear M. paratuberculosis em uma instalação de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2). - Cultivar a cultura de enriquecimento em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL com uma suspensão de 1,7 × 105 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL em um volume final de 200 mL (mesmo meio do passo 2.1) em uma incubadora de agitação por 1 semana.
NOTA: Como os organismos contaminantes podem afetar os resultados, as bactérias devem ser inoculadas em meio sólido Middlebrook 7H10 para determinar a morfologia da colônia e verificar a pureza por kits convencionais de detecção de reação em cadeia da polimerase (PCR) para M. paratuberculosis. - Inative as suspensões bacterianas por 5-10 min a 70 °C e centrifuja a 3.000 × g por 10 min. Lave o pellet pesado em PBS duas vezes, interrompa por sonicação e armazene a -20 °C.
- Transfira o pellet para um recipiente estéril e congele-o com gelo seco ou nitrogênio líquido. Transfira imediatamente para uma câmara de liofilização.
- Liofilizado (4 h a -50 °C sob vácuo) M. paratuberculosis de acordo com o manual da máquina.
- Ao final da liofilização, retire o recipiente de aço inoxidável do liofilizador e transfira-o para uma bancada de biolimpeza. Use uma espátula de aço inoxidável para desalojar os grumos MAP secos aderidos à parede interna do recipiente de aço inoxidável e pulverizá-los o mais finamente possível.
- Pesar as células pulverizadas utilizando uma balança electrónica e colocá-las manualmente num frasco asséptico de 10 ml na concentração de 10 mg/ml.
NOTA: A densidade celular foi quantificada em gramas de peso seco por litro de amostra. Após 3 semanas, 1 mg (peso úmido) de pellet de células bacterianas contém aproximadamente 2,5 × 108 UFC.
3. Preparação da emulsão MOG 35-55
- Triturar o conteúdo de um frasco para injetáveis de M. paratuberculosis seco (10 mg) para um pó fino com uma argamassa e pilão e adicionar 10 ml ao adjuvante de Freund incompleto para obter uma solução-mãe de 10 mg/ml. Conservar a -4 °C.
- Antes da imunização, diluir a solução-estoque até uma concentração final de 4 mg/mL.
- Diluir o peptídeo MOG35-55 em ddH 2 O até uma concentração final de2mg/mL e armazenar a -20 °C.
- Usando um homogeneizador, misturar a solução MOG35-55 (2 mg/mL) com um volume igual de adjuvante (4 mg/mL) a partir do passo 3.2 em um tubo de 5 mL até formar uma emulsão espessa. Após cada 10 s de mistura, coloque a solução no gelo por 20 s e gire o tubo para recuperar toda a solução.
- Transfira a emulsão para uma seringa de 1 mL, remova todo o ar e adicione uma agulha de 27 G. A emulsão está agora pronta para injeção.
NOTA. Uma vez que alguma perda da emulsão viscosa de MOG35-55 ocorre durante a preparação, é melhor preparar 1,5 vezes a quantidade necessária.
4. Imunização animal
- Anestesiar os animais com inalação de isoflurano para minimizar o estresse sobre os animais.
- Injectar a emulsão (200 μL contendo 200 μg/rato de MOG35-55) por via subcutânea na parte inferior das costas.
- Administrar uma dose de toxina pertussis (100 μL contendo 200 ng/rato) por via intraperitoneal nos dias 0 e 2 após a imunização.
CUIDADO: A toxina pertussis tem um efeito supressor múltiplo no sistema imunológico; Evite a ingestão e o contato com os olhos e a pele.
5. Avaliação clínica
- Monitore os camundongos diariamente quanto ao peso e sinais clínicos. Utilizar o seguinte sistema de pontuação: 0 = ausência de sinais clínicos; 1 = cauda flácida; 2 = comprometimento do reflexo de retificação e fraqueza dos membros pélvicos; 3 = paralisia completa dos membros pélvicos; 4 = paralisia completa dos membros pélvicos com paralisia parcial dos membros torácicos; 5 = moribundo.
OBS: Após a observação inicial dos sinais clínicos, os animais recebem maior acesso a água e ração. A ração dos roedores é amolecida e umedecida, depois colocada no chão da gaiola a partir do funil de alimentos. No caso de animais desidratados, é administrada suplementação de fluido subcutâneo ou uma pasta de ração de roedores é administrada por gavagem oral. Se um rato necessitar deste tipo de assistência por mais de 3 dias, a eutanásia será realizada. - Para evitar ou minimizar a dor e o sofrimento do animal, utilizar os seguintes desfechos humanos: perda de peso corporal maior que 20%, escore clínico ≥4,0, ausência do reflexo de retificação no escore 3 e quando o animal não tiver acesso à ração ou água por 24 h.
NOTA: Os camundongos foram eutanasiados no 30º dia após a indução de EAE por injeções intraperitoneais de pentobarbital (≥150 mg/kg).
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Representative Results
Grupos de camundongos C57BL/6 (n total = 15/grupo) foram imunizados com MOG35-55 em emulsão contendo M. paratuberculosis ou pelo método comum com CFA. Todos os grupos de camundongos manifestaram uma doença monofásica aguda caracterizada por um único pico de incapacidade observado aos 14-17 dias, seguido por uma recuperação parcial dos sintomas nos 10 dias seguintes (Figura 1A). Camundongos imunizados com o adjuvante contendo M. paratuberculosis, independentemente do sexo, apresentaram início mais precoce de 8 a 9 dias após a imunização e maior gravidade na fase aguda do que camundongos imunizados com CFA (Figura 1B). Não houve diferença significativa no peso corporal entre os grupos (Figura 1C). Foram realizadas análises citofluorimétricas de células esplênicas de camundongos EAE e atividade proliferativa de linfócitos T avaliada pela incorporação de 3H-timidina, conforme previamente publicado11. Todas as células esplênicas de camundongos EAE, independentemente do adjuvante utilizado, apresentaram forte resposta proliferativa ao peptídeo MOG35-55, enquanto não proliferaram em resposta ao peptídeo controle ovalbumina (Figura 1D). Camundongos EAE imunizados com M. paratuberculosis mostraram uma proporção aumentada de linfócitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+I-A/I-E+) e monócitos (CD11b+CD115+) no baço em comparação com camundongos imunizados com CFA durante a fase aguda do EAE (Figura 1E). A análise histológica pela hematoxilina-eosina revelou infiltrado inflamatório mononuclear meníngeo e perivascular típico no encéfalo e na medula espinhal (Figura 1F).
Figura 1: Resultados representativos do EAE. (A) Escores clínicos de camundongos avaliados diariamente; (B) diferenças no curso da doença; (C) peso corporal; (D) resposta proliferativa de células T ao peptídeo MOG35-55 ; (E) populações de células imunes em esplenócitos durante a fase aguda; (F) imagens histológicas de cortes medulares (aumento de 4x) corados com hematoxilina-eosina (barra de escala = 200 μm) na fase aguda. As setas indicam infiltrados inflamatórios. Os dados mostram resultados combinados de três experimentos independentes (n = 5 camundongos/grupo/experimento). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão calculados por ANOVA one-way, seguida pelo teste post hoc de Bonferroni ou teste U de Mann-Whitney. Abreviações: EAE = encefalomielite autoimune experimental; MOG = glicoproteína de oligodendrócitos de mielina; PBS = solução salina tamponada com fosfato; CFA = adjuvante de Freund completo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós demonstramos um protocolo alternativo robusto para induzir ativamente EAE grave em camundongos C57BL/6J usando o peptídeo MOG35-55 emulsionado em um adjuvante contendo M. paratuberculosis10. A indução de EAE por esse método resultou em uma doença mais grave do que a induzida pelo protocolo comum com CFA. Essa diferença pode ser devida aos diferentes componentes lipídicos na parede celular dasmicobactérias11. De fato, ao contrário de outras micobactérias, M. paratuberculosis produz um antígeno lipopentapeptídeo na superfície da parede celular em vez de glicopeptidolipídios11. Esse lipopentapeptídeo não reagiu de forma cruzada com outras espécies intimamente relacionadas e demonstrou ser um alvo para uma forte resposta humoral específica em pacientes com doenças autoimunes12. As micobactérias possuem padrões moleculares associados a patógenos que desempenham diferentes papéis nas respostas imunes9. Por exemplo, recentemente demonstramos que a imunização oral com M. paratuberculosis aumenta a gravidade do MOG-EAE13, enquanto a vacinação com o bacilo Calmette-Guérin (BCG)-Tokyo-172 parece ter um papel protetor na progressão de modelos de EAE ativo e espontâneo14.
Potenciais limitações do protocolo incluem o curso monofásico autolimitado do EAE, que pode se tornar crônico se as concentrações de micobactéria na toxina adjuvante e pertussis forem duplicadas. Esse aspecto é muito importante de ser considerado, principalmente quando se estuda o aspecto neurodegenerativo do EAE utilizando camundongos knockout, pois a ausência da fase de recuperação pode ser causada pelas altas doses dos reagentes utilizados e não pela falta de função de determinados genes. Além disso, embora o protocolo descrito acima possa ser aplicado a outros protocolos de EAE variando as cepas e a idade dos camundongos ou o tipo e a quantidade de proteína, para garantir que os experimentos de EAE sejam realizados de maneira metodologicamente correta, os grupos experimentais devem ser pareados por idade e sexo.
Como a incidência da doença pode variar, as recomendações para solução de problemas são: a concentração ideal de M. paratuberculosis pode variar de 2 a 4 mg/mL, e um conector de três vias pode ser usado para misturar pequenos volumes do antígeno na fase aquosa. Descrevemos um método de preparação da emulsão usando um homogeneizador; No entanto, um método alternativo e simples para misturar pequenos volumes de antígeno na fase aquosa, na fase oleosa, envolve o uso de um encaixe de conector de três vias, ao qual duas seringas de vidro são conectadas. Em conclusão, identificamos M. paratuberculosis como um potente candidato adjuvante na indução de EAE ativo. Novos estudos sobre o modo de ação e o tipo de imunidade induzida em diferentes espécies animais aumentarão a confiança na possibilidade de adoção deste método alternativo para entender o mecanismo da neuroinflamação.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho recebeu apoio de uma bolsa da Sociedade Japonesa para a promoção da Ciência (bolsa nº. JP 23K14675).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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