Justering af synkroniserede tidsseriedata ved hjælp af den karakteristiske synkroniseringsmodel for tab af cellecyklus til sammenligninger på tværs af eksperimenter

Summary

En udfordring ved at analysere synkroniserede tidsserieeksperimenter er, at eksperimenterne ofte adskiller sig i længden af genopretning fra synkronisering og cellecyklusperioden. Målingerne fra forskellige eksperimenter kan således ikke analyseres samlet eller let sammenlignes. Her beskriver vi en metode til justering af eksperimenter for at muliggøre fasespecifikke sammenligninger.

Abstract

Undersøgelse af cellecyklussen afhænger ofte af synkronisering af cellepopulationer for at måle forskellige parametre i en tidsserie, når cellerne krydser cellecyklussen. Men selv under lignende forhold viser replikerede eksperimenter forskelle i den tid, der kræves for at komme sig efter synkroni og krydse cellecyklussen, hvilket forhindrer direkte sammenligninger på hvert tidspunkt. Problemet med at sammenligne dynamiske målinger på tværs af eksperimenter forværres i mutante populationer eller i alternative vækstbetingelser, der påvirker synkroniseringsrestitutionstiden og/eller cellecyklusperioden.

Vi har tidligere udgivet en parametrisk matematisk model ved navn Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS), der overvåger, hvordan synkrone populationer af celler frigives fra synkroni og skrider frem gennem cellecyklussen. De lærte parametre fra modellen kan derefter bruges til at konvertere eksperimentelle tidspunkter fra synkroniserede tidsserieeksperimenter til en normaliseret tidsskala (livlinepunkter). I stedet for at repræsentere den forløbne tid i minutter fra eksperimentets start, repræsenterer livlineskalaen progressionen fra synkroni til cellecyklusindgang og derefter gennem cellecyklusfaserne. Da livlinepunkter svarer til fasen af den gennemsnitlige celle inden for den synkroniserede population, giver denne normaliserede tidsskala mulighed for direkte sammenligninger mellem eksperimenter, herunder dem med varierende perioder og restitutionstider. Desuden er modellen blevet brugt til at justere cellecykluseksperimenter mellem forskellige arter (f.eks. Saccharomyces cerevisiae og Schizosaccharomyces pombe), hvilket muliggør direkte sammenligning af cellecyklusmålinger, hvilket kan afsløre evolutionære ligheder og forskelle.

Introduction

Tidsseriemålinger foretaget på synkroniserede populationer af celler, når de skrider frem gennem cellecyklussen, er en standardmetode til undersøgelse af de mekanismer, der styrer cellecyklusprogression 1,2,3,4,5,6,7,8 . Evnen til at foretage sammenligninger på tværs af synkroni/frigivelsestidsserieeksperimenter er afgørende for vores forståelse af disse dynamiske processer. Brugen af replikate eksperimenter til at bekræfte resultaterne kan øge tilliden til reproducerbarheden af konklusionerne. Desuden kan sammenligninger mellem miljøforhold, på tværs af mutanter og endda mellem arter afdække mange nye indsigter i cellecyklusregulering. Intereksperimentel variabilitet i genopretningen fra synkroni og i hastigheden af cellecyklusprogression forringer imidlertid evnen til at foretage tidspunkt-til-tid-sammenligninger på tværs af replikater eller mellem eksperimenter med ændret cellecyklustiming. På grund af disse udfordringer er replikater ofte ikke inkluderet i fuldtidsserien (f.eks. Spellman et ^al.4). Når replikater for hele tidsserien indsamles, kan dataene ikke analyseres samlet, men snarere bruges en enkelt replikat til analyse, og andre replikater henvises ofte til supplerende tal (f.eks. Orlando et ^al.8). Desuden er sammenligninger mellem eksperimenter med forskellige restitutions- eller cellecyklusprogressionskarakteristika vanskelige. Målingerne af mindre intervaller mellem en hændelse af interesse og et cellecyklusmærke (f.eks. knoppefremkomst, S-faseindgang eller anafasedebut) kan hjælpe med at reducere fejl, hvis disse skelsættende hændelser spores 1,2,3,9,10,11,12. Imidlertid kan subtile, men vigtige forskelle forblive uopdagede eller tilslørede ved hjælp af disse ad hoc-metoder. Endelig giver enkeltcelleanalyser mulighed for at analysere cellecyklusprogression uden at stole på synkronisering eller justering¹³, selvom store målinger i enkeltcelleundersøgelser kan være udfordrende og dyre.

For at overvinde disse vanskeligheder udviklede vi CLOCCS-modellen (Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) for at hjælpe med analysen af tidsseriemålinger foretaget på synkroniserede populationer^14,15. CLOCCS er en fleksibel matematisk model, der beskriver fordelingen af synkroniserede celler på tværs af cellecyklusfaser, når de frigives fra synkronisering og skrider frem gennem cellecyklussen. Forgreningsprocesrammen gør det muligt for modellen at redegøre for de asymmetriske kvaliteter af moder- og datterceller efter deling, som observeret i S. cerevisiae, mens den stadig er nyttig for organismer, der deler sig ved fission, såsom S. pombe. Modellen kan tage input fra et forskelligt sæt måletyper for at angive cellecyklusfasen. Det kan indtage spirende cellecyklusfasedata, som inkluderer målinger af de procentudstødte celler over tid, hvilket giver mulighed for estimering af antallet af celler uden for den unbudded G1 fase^14,15. Modellen kan også indtage flowcytometriske data, der måler DNA-indholdet, hvilket muliggør vurdering af skelsættende overgange fra G1 til S, S til G2 og M til G1¹⁵. Fluorescerende morfologiske markører kan også bruges til at identificere cellecyklusfasen. Den fluorescerende mærkning af myosinringe, kerner og spindelpollegemer (SPB'er) kan bruges til at bestemme cellecyklusfasen, og disse blev indarbejdet i CLOCCS model¹¹; Disse målinger vil dog ikke blive beskrevet i denne protokol. Derudover blev septationsindekset brugt som input til modellering af data fra S. pombe¹⁴. Modellen kan således bruges til cellecyklusanalyser i en række forskellige organismer og kan udvides yderligere.

CLOCCS er en parametrisk model, der giver mulighed for den fulde bayesianske slutning af flere parametre fra inputdataene (f.eks. spirende procentdel, DNA-indhold). Disse parametre omfatter restitutionstiden fra synkroni, længden af cellecyklusperioden (estimeret separat for moder- og datterceller) og cellernes gennemsnitlige cellecyklusposition på hvert tidspunkt. Disse parametre repræsenterer adfærden af den gennemsnitlige celle i befolkningen, hvilket gør det muligt for forskeren at kortlægge hvert tidspunkt til en cellecyklusposition udtrykt som et livlinepunkt. Omregningen til livlinepunkter afhænger af CLOCCS-parametrene lambda (λ) og mu0 (μ₀)^14,15. Parameteren λ svarer til modercellernes gennemsnitlige cellecyklusperiode. På grund af mor-datter-forsinkelsen^14,15 er dette imidlertid ikke den gennemsnitlige cellecyklusperiode for hele befolkningen, der inkluderer både moder- og dattercellerne. CLOCCS udleder desuden parameteren delta (δ), som svarer til mor-datter-forsinkelsen og dermed gør det muligt at beregne den gennemsnitlige cellecyklusperiode for hele befolkningen. Endelig, fordi hvert eksperiment begynder efter frigivelse fra cellecyklussynkronisering, repræsenteres den tid, der kræves for at komme sig fra synkroniseringsmetoden, af CLOCCS-parameteren μ₀. CLOCCS tilpasser en model til inputcellecyklusfasedataene og udleder derefter disse parametre ved hjælp af en tilfældig gang Markov-kæde Monte Carlo-algoritme^14,15. Ved at kortlægge flere eksperimenter til en fælles cellecyklus livline tidsskala, kan der foretages direkte fasespecifikke sammenligninger mellem replikater eller eksperimenter, hvor restitutionstiden eller cellecyklusperioderne ikke er identiske 8,14,15.

Da synkroniserede populationer mister synkronisering med en vis hastighed i løbet af tidsserien^14,15,16,17, kan variabilitet i hastigheden af synkroniseringstab også hæmme kvantitative sammenligninger på tværs af eksperimenter. Ved at identificere placeringen af populationer og variansen i deres fordelinger tegner CLOCCS sig for forskelle i frekvenser af synkront tab. Dette kraftfulde værktøj giver mulighed for specifikke og detaljerede sammenligninger på tværs af eksperimenter, hvilket giver mulighed for direkte at foretage relevante sammenligninger ikke kun mellem replikater, men også mellem miljøforhold, mutanter og endda arter, der har dramatisk forskellige cellecyklustidspunkter^14,15.

Dette papir beskriver en metode, der bruger CLOCCS til at estimere parametre ved at tilpasse data fra synkron-/frigivelsestidsserieeksperimenter, kortlægge dataene til en fælles livlineskala og derefter foretage relevante sammenligninger mellem replikater eller eksperimenter. Justering af livliner giver mulighed for direkte fasespecifikke sammenligninger på tværs af disse eksperimenter, hvilket giver mulighed for aggregering og sammenligning af replikater og for at foretage mere relevante sammenligninger på tværs af eksperimenter med forskellige restitutionstider og cellecyklusperioder.

Protocol

1. Indsamling af cellecyklusfase og eksperimentelle data

1. Synkroniser cellerne med hensyn til cellecyklussen ved hjælp af den ønskede synkroniseringsmetode (f.eks. centrifugalelutriering som beskrevet i Leman et al.18 eller parringspomonarrest som beskrevet i Rosebrock 19; både Leman et al.18 og Rosebrock ¹⁹ inkluderer også metoder til frigivelse fra synkroni). Begynd prøveudtagning i hele tidsserien, og sørg for, at tidsserien er mindst to fulde cellecyklusperioder lang, og saml optimalt mindst 10 prøver pr. Cellecyklus. På hvert tidspunkt indsamles en prøve til cellecyklusfasedata (spirende eller flowcytometri) og en prøve til eksperimentelle data som beskrevet nedenfor.
2. Hvis du bruger spirende data som cellecyklusfasedata, skal du indsamle data om spirende til CLOCCS-justeringen.
   1. Prøve gennem hele tidsserien. For hvert tidspunkt skal du indsamle celler og rette dem ved at blande 200 μL sonikeret cellekultur med 200 μL fikseringsopløsning, som beskrevet i Leman et ^al.18.
   2. For standard spirende tælles mindst 200 celler pr. Tidspunkt ved hjælp af et transmitteret lysmikroskop med et 40x mål og et hæmocytometer. Celleprøven fra trin 1.2.1 tilsættes til hemocytometeret, og fortyndes, hvis densiteten forhindrer tælling. Optag antallet af knoppede og ikke-buddede celler på hvert tidspunkt. Beregn procentdelen af spirende celler, og plot for hvert tidspunkt i en spirende kurve.
      BEMÆRK: Andre metoder til angivelse af cellecyklusfaseoplysninger er tilgængelige, men disse er ikke beskrevet i denne protokol. De øvrige metoder er beskrevet i CLOCCS-readme og i et tidligere arbejde¹¹.
3. Hvis du bruger flowcytometriske DNA-indholdsdata som cellecyklusfasedata, skal du indsamle flowcytometri-DNA-farvningsdata til flowcytometrisk CLOCCS-justering.
   1. Prøve gennem hele tidsserien. For hvert tidspunkt skal du indsamle celler og rette dem som beskrevet i Haase og Reed²⁰.
   2. Plet DNA'et, og analyser ved hjælp af standard flowcytometrisk analyse. En anbefalet farvningsprotokol for S. cerevisiae er beskrevet i Haase og Reed²⁰.
4. Indsaml tilknyttede omics eller relaterede eksperimentelle data. For standard transkriptomiske data, indsamle som beskrevet i Leman et ^al.18 og Kelliher et ^al.21,22. Sørg for, at dataene er knyttet til tidspunkter, der indeholder cellecyklusfasedata for at muliggøre downstreamjustering. For optimal justering skal du sørge for, at hvert tidspunkt, der indeholder eksperimentelle data, også har fasedata tilknyttet.
   BEMÆRK: De eksperimentelle data kan antage mange former. Traditionelt bruger vi justeringsmetoden beskrevet til justering af tidsserier transkriptomiske eksperimenter. Imidlertid kan enhver type data, der er knyttet til tidspunkter, justeres (dvs. proteomics²²).

2. Installation af den nødvendige software

BEMÆRK: Dette afsnit forudsætter, at Conda, Java 19 og Git allerede er installeret (materialetabel).

1. Download CLOCCS_alignment repo ved at indtaste følgende kommando i terminalen:
   git klon git klon https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
2. Opret et Conda-miljø ved hjælp af filen conda_req.yml ved at indtaste følgende kommando i terminalen i den mappe, hvor CLOCCS_alignment-lageret blev klonet:
   conda env oprette -f conda_req.yml

3. Brug af CLOCCS til at parameterisere eksperimenterne

1. Dobbeltklik på filen cloccs_v2023.jar i mappen CLOCCS i CLOCCS_alignment repo, og vent på, at en grafisk brugergrænseflade åbnes. Denne skærm giver mulighed for indtastningsmuligheder for CLOCCS-kørslen og viser resultaterne, når de er kørt.
2. Indtast de generelle indstillinger.
   1. Indstil Sim Anneal, Burn In og Iterations ved at skrive i de tilknyttede tekstindtastningsfelter. Sim Anneal (simuleret udglødning) identificerer gode startparameterværdier, Burn In søger efter posteriore tilstande, og det sidste trin gør det muligt at drage alle bageste slutninger. Højere værdier øger kørselstiden, men øger også nøjagtigheden.
   2. Indtast de eksperimentelle betingelser ved at angive temperaturen i Celsius og synkroniseringsmetoden ved hjælp af tekstfeltet Temperatur og rullemenuen Synkroniser. Metode, henholdsvis.
   3. Du kan også konfigurere de avancerede indstillinger i menuen Avancerede indstillinger. De avancerede indstillinger gør det muligt at indstille priors for hver af parametrene ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      BEMÆRK: Du kan finde flere oplysninger om de avancerede indstillinger i vigtigt.txt i mappen CLOCCS i CLOCCS_alignment repo.
3. Indtast indstillingerne til brug med de spirende data.
   1. Vælg det relevante valg i rullemenuen Modeltype . Standardindstillingen Bud er til standard spirende information til spirende gær.
      BEMÆRK: Andre mere avancerede muligheder findes også i rullemenuen: Mutant til spirende information til mutanter, der gennemgår flere spirende cyklusser uden opdeling, BudSSLSMR til spirende information og yderligere spindelstanglegeme og myosinringinformation og BudNucDivNeck til spirende information og yderligere opdelings- og knoppehalskerneinformation. Disse avancerede muligheder er beskrevet i CLOCCS readme og i tidligere arbejde^11,14,15.
   2. Importer dataene ved hjælp af panelet Dataimport ved at skrive i tekstindtastningsfelterne eller ved at uploade en fil ved at klikke på knappen Vælg fil . Den første kolonne angiver tidspunkterne. De resterende to kolonner angiver de spirende data og kan bruge en af følgende indstillinger: antallet af ikke-buddede celler (No Bud), antallet af buddede celler (Bud) eller det samlede antal celler (Total).
4. Indtast indstillingerne til brug med flowcytometriske data. For hvert eksperiment skal du køre enten trin 3.3 eller trin 3.4.
   BEMÆRK: Flowcytometriske data og spirende data kan bruges sammen. Selvom vi tidligere beskrev at køre dem sammen¹⁵, skal de for dette værktøj køres uafhængigt og derefter sammenlignes.
   1. Konverter .fcs-filerne til det korrekte CLOCCS-inputformat til flowcytometri ved at følge instruktionerne i supplerende fil 1 (findes også i CLOCCS_alignment-lageret som CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
   2. Vælg valget Flow i rullemenuen Modeltype .
   3. Importer dataene ved hjælp af panelet Dataimport. Klik på Vælg fil, og vælg den fil, der blev genereret i trin 3.4.1.
   4. Vælg de tidspunkter, hvor en flowcytometrisk CLOCCS-tilpasning skal afbildes, ved at vælge tidspunkterne i feltet Tider for tilpasning .
5. Når alle input er valgt til enten spirende eller flowcytometri, skal du klikke på knappen Anvend og derefter klikke på knappen Sample øverst på skærmen.
6. Få vist spirende kurve- eller flowcytometriplots med de forudsagte tilpasninger ved at vælge fanen Forudsagte tilpasninger . Denne fane åbnes som standard umiddelbart efter det forrige trin.
7. Få vist parameterhistogrammerne for hver parameter ved at vælge fanen Parameterhistogrammer og derefter vælge den underfane, der svarer til den relevante parameter, blandt følgende indstillinger: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end osv.
8. Få vist plottet med den bageste score ved at vælge fanen Posterior score .
9. Se indstillingerne, og rediger dem yderligere ved at vælge fanen Indstillinger ; Få vist loggen for de tidligere kørsler ved at vælge fanen Log .
10. Hent CLOCCS-parametrene fra tilpasningen ved at vælge fanen Bageste parametre . Den resulterende tabel vil have følgende form: hver række består af en parameter, hvor den sidste række er den bageste. Kolonnerne består af den forudsagte parameter for middelværdien, det 2,5 % lavere konfidensinterval, det øvre konfidensinterval på 97,5 % og acceptraten.
    1. De parametre, der anvendes til justering for hvert forsøg, registreres: restitutionstiden fra synkroni (μ₀) og modercellernes gennemsnitlige cellecyklusperiode (λ).
    2. Beregn cellecyklusperioden ved at beregne gennemsnittet af modercelleperioden (λ) og dattercelleperioden (λ + δ), hvor δ er den datterspecifikke forsinkelse.
       BEMÆRK: Gentag afsnit 3 med alle de eksperimenter, der skal indgå i sammenligningerne.

4. Konvertering af tidspunkter til livlinepunkter ved hjælp af Python-konverteringsfunktionerne og CLOCCS-parametrene

BEMÆRK: Omregning mellem tidspunkter og livslinjepunkter kræver to konverteringsformler²¹. En Python-implementering til konvertering og datavisualisering er tilgængelig i CLOCCS_alignment repo og beskrevet nedenfor.

1. Aktivér Conda-miljøet ved at indtaste følgende kommando i terminalen: conda activate CLOCCS_alignment
2. Åbn en interaktiv Python-notesbog ved at skrive følgende kommando i terminalen: jupyter notesbog
3. Opret en ny Python-notesbog i den ønskede mappe.
   BEMÆRK: Der er inkluderet et eksempel på en notesbog for at demonstrere standardbrug, og den findes i Alignment/JOVE_example.ipynb i CLOCCS_ justeringslageret.
4. Importer Python-filen, der indeholder justeringsfunktionerne, ved at køre følgende kommando i den første celle:
   %kør path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities.py
   1. Erstat stien til CLOCCS_alignment repo med path_to_repo.
5. Hvis du bruger spirende data som cellecyklusfasedata, skal du importere en dataramme, der indeholder den procentvise budgetindstilling på hvert tidspunkt, ved at køre følgende kommando i en ny celle:
   budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Erstat den relevante filsti og filnavn. Hvis filen er en .csv fil, skal du fjerne sep = "\ t"
6. Hvis du bruger spirende data som cellecyklusfasedata, skal du justere de spirende data til en tidslinjetidsskala for livslinjen ved at indtaste følgende funktion i en ny celle:
   aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, tidspunkter, param_mu0, param_lambda)
   1. For tidspunkter skal du erstatte en liste over de tidspunkter, der skal være indekset for den budding_df dataramme.
   2. For param_mu0 og param_lambda skal du erstatte de lærte parametre fra den spirende CLOCCS-kørsel i afsnit 3 med eksperimentet.
7. Hvis du bruger flowcytometridata, skal du importere flowcytometridataene ved at køre følgende kommando i en ny celle:
   flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
   1. For flow_input_folder skal du erstatte den relevante sti til den mappe, der indeholder flowcytometri .fcs-filer.
8. Hvis du bruger flowcytometridata, skal du generere en konverteringstabel mellem tidspunkterne og livslinjepunkterne for hvert eksperiment ved at skrive følgende kommando i en ny celle:
   flow_converter = convert_tp_to_ll(tidspunkter, param_mu0, param_lambda)
   1. For tidspunkter skal du erstatte en liste over tidspunkterne fra flowcytometridataene.
   2. For param_mu0 og param_lambda erstattes de lærte parametre fra flowcytometrien CLOCCS kørt i afsnit 3 for eksperimentet.
9. Importer datarammen, der indeholder de eksperimentelle data, til notesbogen ved at køre følgende kommando i en ny celle:
   data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Erstat den relevante filsti og filnavn. Hvis filen er en .csv fil, skal du fjerne sep = "\ t".
      BEMÆRK: Dette kan gøres for alle tabeldata. De eksperimentelle data skal blot have tidspunkterne som enten kolonnerne eller indekset for datarammen. Eksempeldata kan findes i CLOCCS_alignment repo.
10. Juster eksperimentdataene til en tidsskala for livslinjepunkter ved at indtaste følgende funktion i en ny celle:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, tidspunkter, param_mu0, param_lambda, interpolere, nedre, øvre)
    1. For tidspunkter skal du erstatte en liste over tidspunkterne som indekset eller kolonnerne i det eksperimentelle data_df fra det forrige trin.
    2. For param_mu0 og param_lambda erstattes værdierne i punkt 3 fra CLOCCS.
       BEMÆRK: Parametrene kan komme fra enhver CLOCCS-kørsel, der udføres på en hvilken som helst af de accepterede cellecyklusfasedatatyper.
    3. Du kan også erstatte interpolere med True eller False eller lade feltet stå tomt (standardindstillingen er False).
       BEMÆRK: Når indstillingen er indstillet til False, interpoleres dataene ikke. Når de er indstillet til Sand, afrundes og interpoleres livslinjepunkterne for at udfylde værdierne mellem livslinjepunkterne, så der er et punkt pr. heltal i livslinjepunkternes interval. Dette giver mulighed for bedre sammenligning på tværs af datasæt.
    4. Du kan også erstatte nedre og øverste del med Ingen eller heltal.
       BEMÆRK: Når den er indstillet til Ingen, bevares alle livslinjepunkterne efter interpolation. Når heltal angives, afkortes dataene, så livslinjepunkterne spænder fra den nederste del til den øverste. Dette giver mulighed for sammenligning på tværs af datasæt med en anden nedre eller øvre del.
11. Download det livslinjejusterede datasæt ved at indtaste følgende kommando i en ny celle: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
12. Gentag trin 4.5-4.11 med alle de eksperimenter, der skal medtages i sammenligningerne.

5. Sammenligning af spirende kurver og flowcytometridata

1. Plot de spirende kurver inden justering ved hjælp af Python-hjælpefunktionen ved at indtaste følgende kommando i en ny celle:
   plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, title = str_title)
   1. Erstat en liste, der indeholder datarammerne for alle de ønskede spirende kurver, med afbildning for list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2 bud_df3].
   2. Erstat en liste over etiketterne for forklaringen - [Eksperiment 1, Eksperiment 2, Mutant] med leg_list, hvis det ønskes. Hvis ikke, skal du udelukke eller erstatte Ingen.
   3. Erstat tid med str_type.
   4. Erstat en strengtitel Sammenligning spirende kurver med str_title, hvis det ønskes. Hvis ikke, skal du erstatte Ingen eller udelukke.
2. Afbild de spirende kurver efter justering ved hjælp af funktionen Python-hjælpeprogrammer ved at følge instruktionerne i trin 5.1, men med en liste over justerede spirende kurver erstattet af list_of_budding_curves og med livline i point_type i stedet for tid.
3. For at plotte flowcytometridataene skal du plotte de tilknyttede data fra .fcs-filerne på de tilsvarende livslinjepunkter ved hjælp af konverteren, der blev genereret i trin 4.8.
4. Konverter livslinjepunkterne til cellecyklusfasen ved hjælp af konverteringstabellen (tabel 1).
   BEMÆRK: Dette kan også plottes ved at følge instruktionerne i trin 5.1, men med fase for point_type i stedet for tid.

6. Sammenligning af eksperimentelle data

1. Bestem genlisten, der skal plottes i linjegraferne baseret på litteraturinformation eller generne af interesse for forskningen.
2. Brug den medfølgende plot_linegraph_comparison i Python-hjælpefilen til at udføre sammenligninger af linjediagrammer på den oprindelige, justerede eller justerede og interpolerede dataramme ved at skrive følgende kommando i en ny celle:
   plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, point_type = str_type, title = str_title)
   1. Erstat en liste over datarammerne for de eksperimenter, der skal sammenlignes med list_of_dfs.
      BEMÆRK: Datarammerne kan være ujusterede eller justerede. Den tilsvarende point_type skal dog indtastes i trin 6.2.4.
   2. Erstat en liste over titlerne for hver dataramme i samme rækkefølge som listen over datarammer med list_for_legend.
   3. Erstat en liste over de gennavne (som skal indgå i indekset for datarammerne), der skal plottes til genlisten.
   4. Erstat punkttypen med str_type. Brug livslinje (standarden er livslinjepunktskala) eller fase (cellecyklusfasens livslinjeskala) til de justerede datarammer i trin 6.2.1 eller tid til de ikke-justerede datarammer i trin 6.2.1.
   5. Erstat str_title med en valgfri strengtitel.
3. Bestem genlisten, der skal medtages i varmekortet ved hjælp af litteraturen eller algoritmerne til at bestemme de øverste periodiske gener.
   BEMÆRK: For korrekt sammenligning af varmekort skal dataene justeres, interpoleres og tidsskalajusteres i trin 6.2; Det skal have samme start- og slutlivsværdi for hvert eksperiment.
   1. Kør periodicitetsalgoritmer for at bestemme de øverste periodiske gener^23,24, eller brug de ønskede alternative metoder til at bestemme genlisten (dvs. litteraturresultater).
   2. Importer en .csv- eller .tsv-genlistefil til notesbogen ved hjælp af følgende kommando i en ny celle:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
   3. Erstat den relevante filsti og filnavn. Hvis filen er en .csv fil, skal du fjerne sep="\t".
4. Brug den medfølgende funktion plot_heatmap_comparison i Python-hjælpefilen til at udføre en varmekortsammenligning på den justerede, interpolerede og fasejusterede dataramme ved at skrive følgende kommando i en ny celle:
   plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, title = str_title)
   1. Erstat en liste over de justerede datarammer for de eksperimenter, der skal sammenlignes, med list_of_dfs.
   2. Erstat en liste over titlerne for hver dataramme i samme rækkefølge som listen over datarammer med list_for_legend.
   3. Erstat en liste over de gennavne (som skal indgå i indekset for datarammerne), der skal plottes til genlisten.
   4. Erstat str_title med en valgfri strengtitel.
      BEMÆRK: Den første dataramme på listen er den, der skal bruges til at ordne generne i varmekortet. Generne vil blive ordnet efter maksimum i den første periode for den pågældende dataramme, og den samme rækkefølge vil blive brugt til de efterfølgende datarammer på listen.

Representative Results

Trinene beskrevet i ovenstående protokol og i arbejdsgangen i figur 1 blev anvendt på fem cellecyklussynkroniserede tidsserieeksperimenter for at demonstrere to repræsentative sammenligninger: mellem replikater med forskellige synkronimetoder (parringsferomon og centrifugalelutriation¹⁸) og sekventeringsplatforme (RNA-sekventering [RNA-seq] og mikroarray) såvel som på tværs af eksperimentelle betingelser. Flere eksperimenter blev udført med S. cerevisiae, og cellecyklusfase og eksperimentelle data blev indsamlet for hvert eksperiment. Arbejdsprocessen involverer brug af CLOCCS til at parameterisere de forskellige synkroniserings-/udgivelsestidsserieeksperimenter, bruge disse parametre til at justere eksperimenterne til en fælles sammenlignelig livslinjeskala og derefter bruge disse justerede eksperimenter til de to repræsentative sammenligninger.

For at demonstrere den repræsentative sammenligning på tværs af replikater valgte vi tre eksperimenter udført med samme stamme og under de samme eksperimentelle betingelser, kaldet tilstand 1. To af disse eksperimenter var direkte replikater af hinanden, og begge blev analyseret via mikroarray-analyse og synkroniseret via centrifugalelutriation. Det tredje eksperiment blev analyseret ved hjælp af RNA-seq-analyse og synkroniseret via alfafaktorparringspomonarrest. For at demonstrere den anden sammenligning på tværs af eksperimenter med varierende cellecyklusperioder blev tilstand 1 RNA-seq-eksperimentet (cellecyklusperiode: 71 min) ovenfra sammenlignet med tilstand 2 (cellecyklusperiode: 82 min) og tilstand 3 (cellecyklusperiode: 110 min) (tabel 2). For hvert eksperiment blev cellerne dyrket under deres respektive forhold, synkroniseret, frigivet og derefter samplet gennem to eller flere cellecyklusperioder. De spirende og / eller flowcytometridata blev indsamlet for at give information om cellecyklusfasen, og enten mikroarray- eller RNA-seq-tidsserietranskriptomiske data blev indsamlet som beskrevet i Leman et ^al.18 (supplerende tabel S1).

For hvert eksperiment tog dataene de former, der er beskrevet i figur 2, som præsenterer betingelse 2-eksperimentet som et eksempel på demonstration. Hvert datasæt havde en spirende kurve, som tillod slutning af cellecyklusfasen. Denne kurve bestod af en spirende procentværdi for hvert tidspunkt i tidsserien, som derefter blev plottet for at producere en spirende kurve, der viste flere cellecyklussvingninger (figur 2). Cellecyklusfasedataene tog også form af flowcytometriske DNA-indholdsfarvningsdata for hvert tidspunkt i tidsserien. Udvalgte tidspunkter for betingelse 2 blev afbildet (figur 2). Flowcytometrifilerne blev kombineret til en enkelt tabel bestående af cellerne i hver logfluorescensbeholder for hvert tidspunkt til indtastning i CLOCCS ved hjælp af flow_cytometry_CLOCCS_file_from_fcs-funktionen i Python-værktøjerne. Hvert datasæt indeholdt også eksperimentelle data. I dette tilfælde var dataene transkriptomiske data, og dataene blev organiseret i rækker af gener, hver med en værdi for overflod af RNA på hvert tidspunkt i eksperimentet (figur 2).

Vi har demonstreret brugen af CLOCCS og konverteringen til livlinepunkter for Condition 2 RNA-seq-datasættet; Processen var dog også identisk for de andre eksperimenter. De spirende oplysninger blev indtastet i CLOCCS-algoritmen som beskrevet i protokolafsnit 3 og som vist i figur 3A. Standardværdierne for Sim Anneal, Burn In, Iterations og Advanced Settings blev brugt. De relevante forsøgsbetingelser blev udvalgt. Modeltypen "Bud" blev brugt til de spirende data. De resulterende CLOCCS-spirende tilpasninger blev set for at sikre, at de spirende kurver var korrekt tilpasset, som demonstreret af datapunkterne, der overlejrede den tilsvarende tilpasningskurve med et lille 95% konfidensbånd (figur 3B og supplerende figur S1). Parametrene μ₀ og λ fra tabellen over bageste parametre (figur 3C) blev registreret til brug for justeringen. Flowcytometridataene for tilstand 2 blev indtastet separat i CLOCCS, som beskrevet i protokolafsnit 3. I øjeblikket forventer CLOCCS, at flowcytometre producerer 10 bit data med 1.024 kanaler; Moderne flowcytometre kan dog have flere kanaler. Da vores flowcytometer producerer data med mere end 1.024 kanaler, blev dataene binned i 1.024 skraldespande. Med flowcytometricellecyklusfasedata producerer CLOCCS en CLOCCS-tilpasning for hvert valgt tidspunkt (figur 3D og supplerende figur S2) og leverer en bageste parametertabel svarende til den spirende bageste parametertabel i figur 3C. Parametrene for spirende, som CLOCCS kører for hvert af de andre eksperimenter, er beskrevet i tabel 2, og parametrene for flowcytometrien, som CLOCCS kører, er beskrevet i supplerende tabel S2.

CLOCCS-parametrene svarende til modercellernes cellecyklusperiode (λ) og restitutionstiden (μ₀) blev anvendt til livlinejusteringen. Det er vigtigt at bemærke, at λ ikke nødvendigvis repræsenterer den gennemsnitlige cellecyklusperiode for cellepopulationen. I tilfælde, hvor cellerne gennemgår en fuld deling, er der et lige antal moder- og datterceller, så den gennemsnitlige cellecyklusperiode er gennemsnittet mellem modercellernes cellecyklusperiode (λ) og dattercellernes cellecyklusperiode (λ + δ); Specifikt er delta (δ) længden af den datterspecifikke forsinkelse. Dette er den beregning, vi brugte til cellecyklusperioden for hvert eksperiment (tabel 2). For hvert eksperiment blev de tilsvarende parametre λ og μ₀ derefter anvendt i konverteringsfunktionen df_conversion_from_parameters, der blev leveret i Python-hjælpefilen, som vist for betingelse 2 (figur 4A). For de spirende kurver blev dataene ikke interpoleret. For eksperimentelle data blev de livlinejusterede datasæt imidlertid gensamplet ved hjælp af interpolation, således at hvert livslinjepunkt indeholdt interpolerede data for forbedret plotning. For at sikre, at de livlinejusterede datasæt havde det samme interval af livlinepunkter, blev nedre og øvre livlinegrænser indstillet til at afkorte dataene på disse punkter. Disse nedre og øvre ll-parametre blev indtastet i df_conversion_from_parameters-funktionen, da interpolationen blev indstillet til Sand. Til sammenligning af betingelse 1 blev de sat til henholdsvis 44 og 270 for alle datasæt, og til sammenligning på tværs af miljøforhold blev de sat til henholdsvis 50 og 300. Et eksempel på brug af disse funktioner til justering og sammenligning kan ses i eksemplet Python-notesbog JOVE_example.ipynb, og koden, der bruges til at generere figurerne, kan ses i JOVE_Figures.ipynb-notesbogen i CLOCCS_alignment-lageret.

Denne omregning fra tidspunkter til livslinjepunkter afhænger af to formler²¹ (figur 4A) ved hjælp af μ₀ (restitutionstid) og λ (moderperiode). Den første formel, , er formlen for genopretningsfasen (figur 4A). Denne formel bruges kun til tidspunkter inden for gendannelsesfasen, som består af tidspunkterne op til og med μ 0, da μ₀ svarer til gendannelsestiden. Tiderne konverteres derefter til et livlineskalaområde, der slutter med 100 livlinepunkter (tabel 1), hvilket markerer slutningen af restitutionsfasen og begyndelsen af den første cellecyklus. Fasen efter genopretning bruger den anden formel (figur 4A), som konverterer hvert efterfølgende tidspunkt efter genopretning til et livlinepunkt efter 100. Hver efterfølgende 100 livlinepunkter svarer til en ny cellecyklus, hvor den første cyklus svarer til livlinepunkterne 100 til 200, den anden cyklus svarer til livlinepunkterne 200 til 300 osv. (tabel 1). Konverteringen fra tidspunkter til livslinjepunkter anvendes individuelt på hvert datasæt ved hjælp af de tilsvarende CLOCCS-parametre for det pågældende datasæt. Når hvert datasæt er konverteret til livslinjeskalaen, justeres cellecyklusfaserne, hvilket giver mulighed for fasespecifikke sammenligninger på tværs af datasæt.

Tabel 3 viser konverteringen af udvalgte tidspunkter til deres respektive livslinjepunkter for repræsentativ konvertering af betingelse 2-datasættet ved hjælp af parametre fra den spirende CLOCCS-kørsel. De spirende data indsamlet fra Condition 2 RNA-seq blev plottet i en spirende kurve, der viser procentdelen budded over tid for både den ujusterede tidsskala i minutter (figur 4B) og den justerede tidsskala i livslinjepunkter (figur 4C) ved hjælp af Python-funktionen plot_budding_curves i en Python-notesbog. Livlinepunkterne kunne let konverteres til eksperimentel information og cellecyklusfaseinformation (tabel 1), og restitutionsfasen og første til tredje cellecyklus blev farvekodet i hånden i overensstemmelse hermed (figur 4B, C). Da hvert livlinepunkt svarede til en cellecyklusfase, kunne individuelle flowcytometriplots mærkes via Python-funktionerne ved hjælp af cellecyklusfasen bestemt af livlinejusteringen. Disse faser matchede med faserne bestemt via flowcytometrisk analyse for tilstand 2. De flowcytometridata, der blev indsamlet til tilstand 2-datasættet, blev plottet for udvalgte tidspunkter og mærket ved hjælp af cellecyklusfasen bestemt ud fra flowcytometriens livlinejustering. I hvert tilfælde svarede dataene til den fase, der blev bestemt af justeringen (figur 4D).

Det er vigtigt at bemærke, at ekspressionsniveauet for hvert gen for hver prøve forbliver det samme, men mærkningen af tidspunkterne ændres fra tid i minutter til livlinepunkter. Konverteringen er dog ikke lineær. Restitutionsfasen, fremhævet med gråt, optager en højere procentdel af forsøgstiden, når konverteringen til livlinepunkter er udført (figur 4B, C). Fordelen ved livlineskalaen er, at den giver mulighed for detaljerede faseoplysninger og fasesammenligninger på tværs af eksperimenter. Faseinformationen er indeholdt i livlinepunkterne som beskrevet ovenfor og vist i tabel 1. Desuden er G1 indeholdt i de første 15,5 livslinjepunkter i hver cellecyklus, S i de næste 20 livlinepunkter og G2/M i de næste 64,5 livlinepunkter (tabel 1). Dette begrænser imidlertid kunstigt restitutionstiden til samme tidsrum for hver på hinanden følgende cellecyklus, selvom gendannelsesfasen forekommer meget kort i den oprindelige tidsskala. Dette skjuler ikke sammenligningerne, fordi faserne i hvert eksperiment er justeret. I de fleste tilfælde er det mere relevant at sammenligne data på punkter, der forekommer i samme eksperimentelle og biologiske fase snarere end på tidspunkter, der forekommer på samme tid i minutter.

Når alle eksperimenterne er konverteret til den justerede livlineskala ved hjælp af de medfølgende Python-funktioner i Python-hjælpefilen, kan de sammenlignes. Her demonstrerer vi to almindelige sammenligninger mellem eksperimenter: en mellem replikater af et lignende eksperiment på tværs af platforme og synkroniseringsmetoder (figur 5) og en mellem forskellige eksperimentelle forhold med en skiftende periodelængde (figur 6 og figur 7). Som beskrevet ovenfor er den første sammenligning på tværs af to elutrierede mikroarray-replikater og et alfafaktorsynkroniseret RNA-seq-eksperiment. Før justeringen viste de to mikroarray-replikater lignende synkroniserings- og cellecyklusdynamik, men betingelse 1 Microarray 2-replikatet syntes lidt forsinket (figur 5A). Den mest slående forskel blev fundet, når man sammenlignede de ikke-justerede datasæt; Betingelse 1 RNA-seq anden cyklus syntes at være på linje med den første cyklus af de to mikroarray-eksperimenter. Forskellen var sandsynligvis ikke relateret til de forskellige transkriptomiske platforme, men snarere de forskellige synkroniseringsmetoder. Cellepopulationerne i mikroarray-eksperimenterne blev synkroniseret ved centrifugalelutriation, mens populationen til RNA-seq-eksperimentet blev synkroniseret ved en parringsperomonbehandling. Faktisk reducerede synkronisering med parringspomon væsentligt restitutionstiden sammenlignet med elutriering (figur 5A og tabel 2).

På trods af de åbenlyse forskelle mellem replikaterne, når de blev plottet med hensyn til den forløbne tid, var kurverne næsten identiske efter livlinejusteringen, og mere detaljerede og relevante sammenligninger på tværs af replikater blev muliggjort (figur 5B). Restitutionsfasen blev justeret, så hvert eksperiment begyndte på samme livlinepunkt, og variationerne i periode blev normaliseret ved livlinejustering. På grund af justeringen forekom eksperimentelle værdier på samme livlinepunkt på tværs af replikater i samme cellecyklusfase, hvilket muliggjorde beregninger af den eksperimentelle varians på tværs af replikater. Gendannelses- og cellecyklusfaserne er mærket i figur 5B for at give yderligere oplysninger om cellecyklusfaser i hvert af eksperimenterne. Denne livlinejustering kan derefter anvendes på det eksperimentelle datasæt (figur 5C,D) ved hjælp af Python-funktionen df_conversion_from_parameters angivet i hjælpeprogramfilen, som beskrevet ovenfor.

I figur 5D blev de transkriptomiske data justeret, og ekspressionsdynamikken for CDC20-genet blev plottet ved hjælp af plot_linegraph_comparison Python-funktionen i en Python-notesbog. Før justering så det ud som om det første topudtryk for mikroarray-eksperimenterne var på linje med den anden top i RNA-seq-eksperimentet (figur 5C); Efter justering justeres de første cellecyklustoppe for hvert datasæt imidlertid korrekt (figur 5D). Desuden syntes topbredden af eksperimenterne at variere mellem RNA-seq-datasættet og mikroarray-datasættet, men efter justering var topbredden mere justeret (figur 5C, D).

Den anden sammenligning er mellem eksperimenter under forskellige miljøforhold med forskellige cellecyklusperioder (figur 6). Som beskrevet ovenfor sammenlignede vi her S. cerevisiae-datasæt i betingelse 1 med betingelse 2 og tilstand 3, som svarer til cellecyklusperioder på henholdsvis 71, 82 og 110 min. Disse forskelle i cellecyklusperioden introducerede usikkerhed ved sammenligning på tværs af eksperimenter før cellecyklusfasejustering, som vist i de ujusterede spirende kurver. Periodeforskellene er synlige i de ikke-justerede spirende kurver (figur 6A). Men da de var CLOCCS-justeret ved hjælp af denne protokol, så de tre kurver bemærkelsesværdigt ens ud, hvilket gjorde det muligt at sammenligne eksperimentelle data (figur 6B).

Ved hjælp af flowcytometri CLOCCS-parametrene blev tilstand 1 og tilstand 2 justeret til en fælles livlineskala, og DNA-indholdshistogrammer blev plottet i tilstand 2 og på ækvivalente livlinepunkter i tilstand 1. Flowcytometriske målinger af DNA-indholdet på tværs af livlinepunkter blev sammenlignet (figur 6C). Da DNA-indholdsmålingerne ikke var kontinuerlige og ikke let interpolerede, kunne vi kun sammenligne de nærmeste livlinepunkter. Cellecyklusfasedataene for hvert sammenligneligt livlinepunkt var ikke identiske mellem de to betingelser (figur 6C), hvilket indikerer, at CLOCCS-tilpasningerne og de resulterende parametre sandsynligvis var lidt forkert justeret for betingelse 1. Dette skyldtes sandsynligvis den dårligere CLOCCS-tilpasning til flowcytometriske data for tilstand 1 sammenlignet med tilstand 2 (supplerende figur 2). Justeringen afveg imidlertid kun i én stikprøve og giver således stadig mulighed for forbedrede fasespecifikke sammenligninger.

Den spirende livlinejustering blev derefter anvendt på de eksperimentelle data for RNA-seq-eksperimenterne i tilstand 1, tilstand 2 og tilstand 3 (figur 7) ved hjælp af de spirende CLOCCS-parametre i df_conversion_from_parameters-funktionen på de eksperimentelle data. De transkriptomiske data blev justeret, og genekspressionen af genet CDC20 for hver tidsserie blev vist for de tre eksperimenter. Før justering var transkriptionsdynamikken i CDC20 ikke-overlappende (figur 7A). Efter justeringen blev den første og anden top af CDC20-genekspressionen meget tættere justeret for alle tre datasæt. Efter justering blev det klart, at toppene forekom i samme cellecyklusfase, men kurvernes former var forskellige (figur 7B). Betingelse 3 havde en lavere og bredere første top sammenlignet med de to andre betingelser, selv efter at der var taget højde for forskellene i cellecyklusperioden, hvilket tyder på, at disse forskelle sandsynligvis var relateret til de eksperimentelle betingelser, der blev testet (figur 7B).

Der kunne også foretages transkriptomiske sammenligninger i stor skala. Til disse sammenligninger blev 278 gener udvalgt ved at køre periodicitetsalgoritmen JTK_CYCLE²³ på hvert datasæt og tage skæringspunktet mellem de øverste periodiske gener. Gener kan dog vælges ved hjælp af enhver ønsket metode eller fra litteraturen. Disse gener blev plottet i samme rækkefølge for alle tre tilstande både for de ujusterede (figur 7C) og de justerede (figur 7D) varmekort ved hjælp af den plot_heatmap_comparison Python-funktion i en Python-notesbog. Disse varmekort gør det muligt at foretage hundredvis af sammenligninger på genniveau samtidigt. Sammenligninger på tværs af ujusterede eksperimenter kunne foretages med hensyn til ændringen i kurvedynamik, spidstiden i forhold til nabogener og periodelængden osv. (figur 7C). Det var imidlertid ikke muligt at foretage detaljerede fasespecifikke sammenligninger, fordi tidspunkterne ikke nødvendigvis korrelerer med den samme cellecyklusfase på tværs af betingelser. Selv om de andre cyklusser lignede hinanden efter justering, blev de første cyklusser lidt forskudt mellem betingelserne (figur 7D). Dette skift kan afspejle det faktum, at de spirende cellecyklusfaseoplysninger var af lavere kvalitet for betingelse 3. Ikke desto mindre muliggjorde tilpasningen af eksperimenterne til de tre betingelser en forbedret fasespecifik sammenligning. Før justering var det uklart, om den første ekspressionstop i hver tilstand ville forekomme i samme cellecyklusfase (figur 7C); Efter justering kunne eksperimenterne imidlertid sammenlignes på en fasespecifik måde (figur 7D). Før linjeføringen syntes toppene i betingelse 3 meget bredere end i de to andre forhold (figur 7C); Efter justeringen blev det imidlertid klart, at toppene i betingelse 3 var af samme bredde som de andre forhold, når de blev justeret (figur 7D).

Disse repræsentative resultater viser processen for anvendelse af CLOCCS til at tilpasse eksperimenter til en fælles tidsskala. Før justering korrelerer direkte tidssammenligninger ofte ikke med en lignende cellecyklusfase. Omregningen af den forløbne forsøgstid i minutter til livlinepunkter, der repræsenterer cellecyklusfasen, muliggør fasespecifikke og biologisk relevante sammenligninger mellem eksperimenter på samme punkt i cellecyklussen.

Figur 1: Oversigt over arbejdsgangen for justering af CLOCCS for livlinejustering. Den eksperimentelle arbejdsproces til justering af to eksempeldatasæt ved hjælp af CLOCCS efterfulgt af repræsentative sammenligninger mellem datasættene. De vigtigste trin fra protokollen illustreres: indsamling af ikke-justerede cellecyklusfase og eksperimentelle data for hvert af datasæt (trin 1), brugen af CLOCCS til parameterisering af hvert datasæt (trin 2 og trin 3), justering af datasættene til en fælles livline (trin 4) og endelig sammenligningen af cellecyklusfasen og eksperimentel dynamik (trin 5 og trin 6). De ikke-justerede cellecyklusfasedata indlæses i CLOCCS for at levere lærte parametre, som derefter bruges til justering til en fælles livlineskala. Disse justerede datasæt sammenlignes derefter. Forkortelse: CLOCCS = Karakteriserende tab af cellecyklussynkronisering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Format af cellecyklusfasen og eksperimentelle data, der kræves til arbejdsprocessen. De data, der kræves til arbejdsgangen, består af to hovedkomponenter: cellecyklusfasedata og cellecykluseksperimentelle data. Cellecyklusfasedataene kan bestå af cellecyklusspirende data eller flowcytometriske DNA-indholdsdata for hvert tidspunkt i tidsserien. De eksperimentelle data kan antage mange former, men i dette tilfælde er transkriptomiske data, som består af genekspressionsdata for hvert gen for hvert tidspunkt i tidsserien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Eksempel på resultater fra kørsel af CLOCCS på et S. cerevisiae-cellecyklusdatasæt. (A) Et skærmbillede af CLOCCS grafiske brugergrænseflade med de inputværdier og indstillinger, der leveres til betingelse 2 spirende data. Tiderne, antallet af ikke-buddede celler og antallet af knoppede celler indtastes, samt modeltype, iterationer og betingelser osv. (B) Et skærmbillede af den resulterende CLOCCS-spirende pasform til betingelse 2 under fanen "Forventet pasform" i resultaterne. Hvert datapunkt har en tilknyttet prøvetagningsfejlbjælke svarende til 95 % binomialandelen konfidensintervaller for dataene (for hvert tidspunkt blev der talt mindst 200 celler [mellem 204 og 295 celler]). Den resulterende spirende pasformskurve viser konfidensbåndet for 95% konfidensintervallet for CLOCCS-pasformen i lilla. (C) Et skærmbillede af den resulterende tabel "Posterior Parameters" for betingelse 2 spirende CLOCCS-kørsel, der består af CLOCCS-parametrene ved middelværdien, 2,5% konfidensintervallet og 97,5% konfidensintervallet. De bageste og acceptrater vises også. (D) Et skærmbillede af flowcytometrien CLOCCS passer til tilstand 2 ved 70 min og 150 min. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Eksempel på konverteringsprocessen fra tidspunkter til justerede livslinjepunkter for betingelsesdatasættet . (A) De konverteringsformler, der bruges til at konvertere fra tidspunkter til livslinjepunkter. Et skærmbillede af Python-funktionerne i Python-notesbogen til konvertering og plotning af de spirende kurver. (B) Den ikke-justerede tilstand 2-spirende kurve, der viser den spirende procent for hvert tidspunkt i minutter. Cellecyklus- og gendannelsesfaserne fremhæves som følger: genopretning (grå), første cellecyklus (blå), anden cellecyklus (magenta) og tredje cellecyklus (laks). (C) Den justerede knopskydningskurve for betingelse 2, der viser de samme spirende procenter, men afbildet på den livlinejusterede skala. Cellecyklus- og gendannelsesfaserne fremhæves som i panel C. (D) De justerede flowcytometriplots for udvalgte tidspunkter fra betingelse 2 svarende til forskellige cellecyklusfaser baseret på livlineskalaen: begyndelsen af G1, begyndelsen af S-fasen, begyndelsen af G2/M og sen G2/M. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Repræsentative resultater til sammenligning af de justerede og ikke-justerede Condition 1-replikate eksperimenter. Sammenligning af betingelse 1 replikerer: Betingelse 1 RNA-seq (blå), Betingelse 1 mikroarray 1 (lilla) og Betingelse 1 mikroarray 2 (grå). (A) Den ikke-justerede spirende kurve for betingelse 1-datasættene. (B) Den justerede spirende kurve for betingelse 1-datasættene. Livslinjepunkterne er konverteret til cellecyklusfasen og er farvekodede under x-aksen. (C) Den ikke-justerede genekspression af et repræsentativt gen, CDC20, for tilstand 1-datasæt. (D) Den justerede genekspression af et repræsentativt gen, CDC20, for tilstand 1-datasæt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Repræsentative resultater til sammenligning af justerede og ikke-justerede cellecyklusfasedata på tværs af eksperimenter med forskellige perioder. Sammenligning af cellecyklusfasedata for datasæt med tre forskellige miljøforhold og dermed tre forskellige cellecyklusperioder: Tilstand 1 RNA-seq (cellecyklusperiode: 71 min), Betingelse 2 RNA-seq (cellecyklusperiode: 82 min) og Tilstand 3 RNA-seq (cellecyklusperiode: 110 min). (A) Den ikke-justerede spirende kurve for datasættene. B) Den justerede spirende kurve for datasættene. C) De flowcytometriske DNA-indholdshistogrammer for tilstand 2 (øverste række) sammenlignet med de ækvivalente livlinepunkter i tilstand 1 (nederste række). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Repræsentative resultater til sammenligning af de justerede og ikke-justerede transkriptomiske data på tværs af eksperimenter med varierende perioder. Sammenligning af de transkriptomiske data, der er knyttet til datasættene i figur 6: Betingelse 1 RNA-seq, Betingelse 2 og Betingelse 3. (A) Den ujusterede genekspression af et repræsentativt gen, CDC20, for RNA-seq-datasæt for tilstand 1, tilstand 2 og tilstand 3. (B) Den justerede genekspression af CDC20 for datasættene. (C) Det ikke-justerede varmekort over de øverste periodiske gener i cellecyklus i samme rækkefølge for hvert datasæt. (D) De livlinejusterede varmekort over de samme periodiske gener for cellecyklus fra panel C i samme rækkefølge. De stiplede lilla linjer svarer til livlinepunkterne 100 og 200. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Livsliniepunkt til cellecyklusfasekonvertering. Omregningsnøglen mellem livlinepunktskalaen og den tilsvarende fase i eksperimentet. Livslinjepunkterne 0-100 svarer til genopretning fra synkroni. Hver efterfølgende 100 livlinepunkter svarer til en ny cellecyklus, hvor de første 15,5 livlinepunkter svarer til G1, de næste 20 svarer til S-fasen, og de resterende livlinepunkter svarer til G2/M. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Spirende CLOCCS-parametre. De resulterende spirende CLOCCS-parametre "lambda" og "mu0" for hvert eksperiment ud fra de repræsentative resultater. Derudover vises den datterspecifikke forsinkelse "Delta" og den beregnede cellecyklusperiode for hvert eksperiment. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Omregningstabel, der viser omregningen mellem tidspunkter i minutter og deres respektive tilsvarende livslinjepunkter for betingelse 2. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur S1: CLOCCS spirende passer til betingelse 1 og tilstand 3. Skærmbillede af de resulterende CLOCCS-spirende data, der passer til (A) betingelse 1 RNA seq-spirende data, (B) betingelse 1 mikroarray 1 spirende data, (C) betingelse 1 mikroarray 2 spirende data og for (D) betingelse 3 spirende data. CLOCCS spirende passer til tilstand 2 kan ses i figur 3B. 95 % konfidensbåndet og samplingsfejlbjælkerne er som beskrevet i CLOCCS-dokumentationen^14,15 og i figur 3. For hvert tidspunkt for hver tidsserie blev ca. 200 celler talt. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: CLOCCS flowcytometri passer til tilstand 1 og tilstand 2. Skærmbillede af flowcytometrien CLOCCS passer til prøverne vist i figur 6C for betingelse 2 (øverste række: A-D) og betingelse 1 (nederste række: E, F). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Følsomheden af justeringen over for variationer i CLOCCS-parametrene. Sammenligning af justeringen af RNA-Seq-datasættet for betingelse 1 ved hjælp af (A-C) variationer i CLOCCS-parametrene λ og μ0 inden for konfidensintervallet for CLOCCS-tilpasningen og (D,E) med store variationer i parametrene. Sammenligning mellem middelværdien med de 2,5% og 97,5% konfidensværdier, der er output i parametertabellen af CLOCCS for (A) parameteren μ0, (B) parameteren λ og (C) for begge parametre μ0 og λ. D) Sammenligning mellem justeringen ved hjælp af middelværdien for μ0 sammenlignet med store variationer i μ0-parameteren (200-0,25 % af μ0). (E) Sammenligning mellem justeringen ved hjælp af middelværdien for λ sammenlignet med store variationer i λ-parameteren (200% til 0,25% af λ). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Beskrivelse af dataindsamlingen for hvert forsøg. For hvert eksperiment giver denne tabel en beskrivelse af de spirende data, flowcytometridata, transkriptomiske data og synkroniseringsmetode. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S2: CLOCCS-parametre fra de flowcytometriske CLOCCS-kørsler. CLOCCS-parametrene "mu0" og "lambda" for tilstand 1 og tilstand 2 flowcytometri CLOCCS kører. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Instruktioner til konvertering af flowcytometriske data til CLOCCS-inputformat. Til brug af CLOCCS med flowcytometriske data kræves et specifikt inputformat. Denne fil indeholder mere detaljerede instruktioner vedrørende protokoltrin 3.4.1 for at forklare, hvordan du bruger Python-hjælpefunktionerne til at udføre denne konvertering. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Dette papir præsenterer en metode til mere præcist og kvantitativt at vurdere data fra tidsserieeksperimenter på synkroniserede populationer af celler. Metoden udnytter indlærte parametre fra CLOCCS, en bayesiansk inferensmodel, der bruger inputcellecyklusfasedata, såsom spirende data og flowcytometriske DNA-indholdsdata, til at parameterisere hvert eksperiment^14,15. CLOCCS bruger inputcellecyklusfasedataene til at udlede parametrene for hvert eksperiment, som derefter bruges til justering til en fælles livlineskala. Konvertering af flere synkroni-/udgivelsestidsserieeksperimenter til en enkelt livlinejusteret tidsskala giver mulighed for fasespecifikke og relevante sammenligninger mellem eksperimenter og aggregering af flere replikate eksperimenter, som tidligere var vanskelige eller umulige.

De kritiske trin i denne protokol omfatter indsamling af data, kørsel af CLOCCS, justering af datasættene og sammenligning på tværs af datasættene. For det første skal data indsamles til brug i denne protokol. Dataene skal bestå af både eksperimentelle data, der indeholder information om spørgsmålet af interesse (dvs. transkriptomiske data, genekspressionsdata, proteomiske data) - og cellecyklusfasedata, der indeholder information om cellecyklusfasen (dvs. spirende data, flowcytometriske DNA-indholdsdata). Derefter kan cellecyklusfasedataene bruges i CLOCCS til at indsamle parameteroplysningerne for hvert eksperiment. Parametrene μ₀ (restitutionsfaselængde) og λ (modercellecyklusperiode) bruges til at konvertere tiderne til livlinepunkter. Justeringen af livlinepunktet gør det muligt at sammenligne den justerede tidsserie direkte.

En begrænsning ved metoden er, at korrekt justering afhænger af at identificere et godt match til dataene. Opnåelse af den bedste CLOCCS-tilpasning afhænger af kvaliteten af cellecyklusfasedataene og brugen af de korrekte inputindstillinger til eksperimentet i CLOCCS. Tilpasningen til cellecyklusfasedataene bestemmer nøjagtigheden af de lærte parametre og påvirker således i høj grad nøjagtigheden af justeringen, fordi det afhænger af brugen af disse parametre. Da brede ændringer i parametrene i høj grad vil påvirke tilpasningen, forbliver ændringerne minimale inden for det konfidensinterval, der leveres i CLOCCS-outputtet (supplerende figur S3). Det er vigtigt at bemærke, at denne følsomhed over for variationer i parametrene også er det, der giver mulighed for justering mellem datasæt med varierende cellecyklustiming.

Nøjagtigheden af CLOCCS-tilpasningen kan bestemmes ved hjælp af den resulterende CLOCCS-tilpasningskurve og de tilsvarende fejlbjælker og fejlbånd (figur 3B,D, supplerende figur S1 og supplerende figur S2). Fanen CLOCCS-tilpasning viser de oprindelige datapunkter samt CLOCCS-tilpasningskurven med konfidensbåndet svarende til konfidensintervallet for CLOCCS-tilpasningen og fejlbjælkerne svarende til 95 % binomialand-konfidensintervallet for dataene, da tællingerne antages at være uafhængige binomiale tilfældige variabler¹⁴. For eksempel måler konfidensbjælkerne på de spirende data tilliden til andelen af spirende celler for en given prøve.

En metode til bestemmelse af kvaliteten af CLOCCS-tilpasningen involverer bestemmelse af, om fejlbjælkerne i dataene overlapper med konfidensintervalbåndet for CLOCCS-tilpasningen. En anden indikation er bredden af 95% konfidensbåndet for CLOCCS-pasformen. Generelt falder båndets bredde med øget pasform. En indikation af dårlig justering er, hvis cellecyklusfasen af de oprindelige data ikke stemmer overens med cellecyklusfasen udledt af justeringen. Hver justering kan dobbeltkontrolleres ved at bekræfte, at for hvert tidspunkt stemmer den fase, der er angivet af cellecyklusfaseinformationsdataene, overens med den cellecyklusfase, der er tildelt af justeringen.

En dårlig CLOCCS-pasning eller dårlig justering kan være resultatet af cellecyklusfasedata af lav kvalitet. Spirende data af høj kvalitet vil have en meget lav spirende procentdel umiddelbart efter anholdelse og en meget høj spirende procentdel ved den første top. De efterfølgende toppe og lavpunkter vil miste synkronitet, men bør være tydelige og jævnt fordelt. Da livlinepunkterne repræsenterer befolkningens gennemsnitlige cellecyklusfase, kan dårlig synkronisering også hindre korrekt justering. Data af flowcytometrisk DNA-indhold af høj kvalitet vil have forskellige 1C- og 2C-toppe for hvert tidspunkt svarende til den relevante cellecyklusfase. Derudover introducerer utilstrækkelige cellecyklusfasedata problemer med parameteridentifikation. I tilfælde af tilstrækkelige data kan parametrene udledes og ændres ikke væsentligt mellem CLOCCS-kørsler. De parametre, der er beskrevet i denne protokol (lambda, delta, mu0), kan dog ikke adskilles, når cellecyklusfasedataene kun indeholder en hel cellecyklus. For at muliggøre forbedret parameterestimering bør der anvendes tilstrækkelige og velkonstruerede cellecyklusdata til CLOCCS fits^14,15. Desuden anvender CLOCCS-modellen forudgående oplysninger som beskrevet i Orlando et ^al.15, men disse oplysninger kan justeres, så de passer bedre til de anvendte forsøgsbetingelser.

Hvis kvaliteten af cellecyklusfasedataene er god, kan justering af CLOCCS-indstillingerne hjælpe med at producere en mere nøjagtig pasform. For eksempel kan antallet af valgte gentagelser øges for at forbedre nøjagtigheden. Det kan også være nyttigt at bekræfte, at den korrekte synkroniseringsmetode blev valgt i CLOCCS, da alfafaktorstop er forbundet med en kortere restitutionstid sammenlignet med elutriation.

Denne metode er også begrænset med hensyn til de typer cellecyklusfasedata, der i øjeblikket understøttes. CLOCCS er dog fleksibel og kan tilpasses til at understøtte andre typer data. For eksempel er CLOCCS tidligere blevet tilpasset til at understøtte cellecyklusfluorescerende mærkning af spindelpollegemer, myosinringe og kerner¹¹ til brug som cellecyklusfaseidentifikatorer. Desuden er det blevet muligt at anvende CLOCCS med andre arter end S. cerevisiae . CLOCCS accepterer septationsindekser som markør for cellecyklusfasen i S. pombe¹⁴ samt flowcytometriske DNA-indholdsdata, som let kan indsamles for mange arter¹⁵. Dette giver mulighed for sammenligning af eksperimentelle data i samme fase af cellecyklussen for to helt forskellige arter og kan give indsigt i ændringer i cellecyklussen på tværs af evolutionen.

Selvom kun understøttede former for cellecyklusfasedata kan bruges med denne livslinjejusteringsmetode, er denne metode agnostisk for den type tidsserieeksperimentelle data, der anvendes. I denne protokol har vi demonstreret dens anvendelse til at justere genekspressionen af et individuelt gen samt tidsserietranskriptomiske data for hundredvis af gener i tandem. Vi har vist, at denne metode kan bruges til at sammenligne på tværs af platforme og dermed foretage sammenligninger mellem RNA-seq-datasæt og microarray-datasæt taget under lignende forhold. Vi har også vist, at denne metode kan bruges til at justere datasæt med forskellige synkroniseringsmetoder ved at sammenligne mellem et datasæt, der blev elutrieret (Condition 1 Microarray) med et datasæt, der blev alfafaktor arresteret (Condition 1 RNA-seq). Tidligere er CLOCCS også blevet brugt til at justere tidsserietranskriptomiske og tidsserieproteomiske data ved hjælp af spirende cellecyklusfasedata²², hvilket muliggjorde direkte sammenligninger mellem mRNA-dynamikken og dynamikken i det tilsvarende protein. CLOCCS er også blevet brugt til at justere tidsseriedata på tværs af arter, såsom for justering mellem S. cerevisiae og S. pombe¹⁴ og mellem den første cyklus af S. cerevisiae og den patogene gær Cryptococcus neoformans²¹. Endelig er CLOCCS-justering i øjeblikket specifik for cellecyklustidsseriedata og er endnu ikke tilpasset til brug med andre typer rytmiske processer. Et område, hvor dette ville være af særlig interesse, er for cirkadiske rytmer, hvor døgnrytmetid (CT) traditionelt anvendes til at tilpasse eksperimenter, selvom dens gennemførelse ikke anvendes konsekvent. Et andet område af interesse er at undersøge udviklingsrytmer, såsom malariaparasittens. For eksempel vil tilpasningen af Plasmodium falciparum-stammer med forskellige perioder, som beskrevet i Smith et ^al.25, muliggøre mere detaljerede sammenligninger på tværs af stammer. Tilpasningen af disse periodiske processer til sammenligning ville give mulighed for en bedre forståelse af disse vigtige rytmiske biologiske funktioner. Disse typer cellecyklussammenligninger er blevet muliggjort ved hjælp af CLOCCS til justering af livliner som beskrevet i denne protokol.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde			For Fixative Solution.
100% Ethanol			For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer			For flow cytometry protocol.
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope			For counting cells and buds.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris			pH 7.5