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Biology

क्रॉस-प्रयोग तुलना के लिए सेल चक्र सिंक्रनाइज़ मॉडल के नुकसान की विशेषता का उपयोग करके सिंक्रनाइज़ समय-श्रृंखला डेटा का संरेखण

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65466
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

Summary

सिंक्रनाइज़ किए गए समय-श्रृंखला प्रयोगों का विश्लेषण करने की एक चुनौती यह है कि प्रयोग अक्सर सिंक्रनाइज़ और सेल-चक्र अवधि से वसूली की लंबाई में भिन्न होते हैं। इस प्रकार, विभिन्न प्रयोगों से माप का समग्र रूप से विश्लेषण नहीं किया जा सकता है या आसानी से तुलना नहीं की जा सकती है। यहां, हम चरण-विशिष्ट तुलनाओं की अनुमति देने के लिए प्रयोगों को संरेखित करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

सेल चक्र की जांच अक्सर एक समय श्रृंखला में विभिन्न मापदंडों को मापने के लिए सेल आबादी को सिंक्रनाइज़ करने पर निर्भर करती है क्योंकि कोशिकाएं सेल चक्र को पार करती हैं। हालांकि, समान परिस्थितियों में भी, प्रतिकृति प्रयोग सिंक्रनाइज़ से उबरने और सेल चक्र को पार करने के लिए आवश्यक समय में अंतर प्रदर्शित करते हैं, इस प्रकार प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्यक्ष तुलना को रोकते हैं। प्रयोगों में गतिशील माप ों की तुलना करने की समस्या उत्परिवर्ती आबादी या वैकल्पिक विकास स्थितियों में बढ़ जाती है जो सिंक्रनाइज़ रिकवरी समय और / या सेल-चक्र अवधि को प्रभावित करती हैं।

हमने पहले एक पैरामीट्रिक गणितीय मॉडल प्रकाशित किया है जिसका नाम सेल चक्र सिंक्रनाइज़ (सीएलओसीसीएस) के नुकसान को चिह्नित करना है जो निगरानी करता है कि कोशिकाओं की तुल्यकालिक आबादी सिंक्रनाइज़ से कैसे निकलती है और सेल चक्र के माध्यम से प्रगति करती है। मॉडल से सीखे गए मापदंडों का उपयोग तब सिंक्रनाइज़ किए गए समय-श्रृंखला प्रयोगों से प्रयोगात्मक समय बिंदुओं को सामान्यीकृत समय पैमाने (लाइफलाइन पॉइंट) में परिवर्तित करने के लिए किया जा सकता है। प्रयोग की शुरुआत से मिनटों में बीते समय का प्रतिनिधित्व करने के बजाय, लाइफलाइन स्केल सिंक्रनाइज़ से सेल-चक्र प्रवेश और फिर सेल चक्र के चरणों के माध्यम से प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है। चूंकि लाइफलाइन बिंदु सिंक्रनाइज़ आबादी के भीतर औसत सेल के चरण के अनुरूप हैं, इसलिए यह सामान्यीकृत समय पैमाना प्रयोगों के बीच सीधी तुलना की अनुमति देता है, जिसमें अलग-अलग अवधि और पुनर्प्राप्ति समय शामिल हैं। इसके अलावा, मॉडल का उपयोग विभिन्न प्रजातियों (जैसे, सैकरोमाइसेस सेरेविसिया और स्किज़ोसैक्रोमाइसेस पोम्बे) के बीच सेल-चक्र प्रयोगों को संरेखित करने के लिए किया गया है, इस प्रकार सेल-चक्र माप की सीधी तुलना को सक्षम करता है, जो विकासवादी समानता और अंतर को प्रकट कर सकता है।

Introduction

कोशिकाओं की सिंक्रनाइज़ आबादी पर किए गए समय-श्रृंखला माप क्योंकि वे सेल चक्र के माध्यम से प्रगति करते हैं, उन तंत्रों की जांच के लिए एक मानक विधि है जो सेल-चक्र प्रगति 1,2,3,4,5,6,7,8 को नियंत्रित करते हैं।. सिंक्रनाइज़ / रिलीज़ टाइम-सीरीज़ प्रयोगों में तुलना करने की क्षमता इन गतिशील प्रक्रियाओं की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है। निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए प्रतिकृति प्रयोगों का उपयोग निष्कर्षों की प्रजनन क्षमता में विश्वास बढ़ा सकता है। इसके अलावा, पर्यावरणीय परिस्थितियों के बीच, उत्परिवर्ती में, और यहां तक कि प्रजातियों के बीच तुलना सेल-चक्र विनियमन में कई नई अंतर्दृष्टि को उजागर कर सकती है। हालांकि, सिंक्रनाइज़ से वसूली में और सेल-चक्र प्रगति की गति में अंतर-प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता प्रतिकृति में या परिवर्तित सेल-चक्र समय के साथ प्रयोगों के बीच समय-बिंदु-से-समय-बिंदु तुलना करने की क्षमता को बाधित करती है। इन चुनौतियों के कारण, प्रतिकृति को अक्सर पूर्णकालिक श्रृंखला (जैसे, स्पेलमैन एट अल.4) के लिए शामिल नहीं किया जाता है। जब पूरे समय श्रृंखला के लिए प्रतिकृतियां एकत्र की जाती हैं, तो डेटा का समग्र रूप से विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, बल्कि विश्लेषण के लिए एक एकल प्रतिकृति का उपयोग किया जाता है, और अन्य प्रतिकृतियों को अक्सर पूरक आंकड़ों (जैसे, ऑरलैंडो एट अल.8) में डाल दिया जाता है। इसके अलावा, विभिन्न वसूली या सेल-चक्र प्रगति विशेषताओं के साथ प्रयोगों के बीच तुलना मुश्किल है। रुचि की घटना और सेल-चक्र लैंडमार्क (जैसे, कली उद्भव, एस-चरण प्रविष्टि, या एनाफ़ेज़ शुरुआत) के बीच छोटे अंतराल के माप त्रुटियों को कम करने में मदद कर सकते हैं यदि इन ऐतिहासिक घटनाओं को 1,2,3,9,10,11,12 ट्रैक किया जाता है। हालांकि, इन तदर्थ तरीकों का उपयोग करके सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण अंतर अज्ञात या अस्पष्ट रह सकते हैं। अंत में, एकल-सेल विश्लेषण सिंक्रनाइज़ेशन या संरेखण13 पर भरोसा किए बिना सेल-चक्र प्रगति का विश्लेषण करने की अनुमति देता है, हालांकि एकल-सेल अध्ययन में बड़े पैमाने पर माप चुनौतीपूर्ण और महंगा हो सकता है।

इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए, हमने सिंक्रनाइज़ आबादी14,15 पर किए गए समय-श्रृंखला माप के विश्लेषण में सहायता के लिए सेल चक्र सिंक्रनाइज़ (सीएलओसीसीएस) मॉडल की विशेषता हानि विकसित की। सीएलओसीसीएस एक लचीला गणितीय मॉडल है जो सेल-चक्र चरणों में सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं के वितरण का वर्णन करता है क्योंकि वे सेल चक्र के माध्यम से सिंक्रनाइज़ और प्रगति से जारी होते हैं। ब्रांचिंग प्रोसेस फ्रेमवर्क मॉडल को विभाजन के बाद मां और बेटी की कोशिकाओं के असममित गुणों का हिसाब लगाने में सक्षम बनाता है, जैसा कि एस सेरेविसिया में देखा गया है, जबकि अभी भी उन जीवों के लिए उपयोगी है जो विखंडन से विभाजित होते हैं, जैसे कि एस पोम्बे। मॉडल सेल-चक्र चरण को निर्दिष्ट करने के लिए माप प्रकारों के एक विविध सेट से इनपुट ले सकता है। यह नवोदित सेल-चक्र चरण डेटा को निगल सकता है, जिसमें समय के साथ प्रतिशत बुड्ड कोशिकाओं के माप शामिल हैं, जिससे अनबुडेड जी 1 चरण14,15 के बाहर कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाया जा सकता है। मॉडल फ्लो साइटोमेट्रिक डेटा को भी निगल सकता है जो डीएनए सामग्री को मापता है, इस प्रकार जी 1 से एस, एस से जी 2 और एम से जी 115 तक लैंडमार्क संक्रमण के आकलन को सक्षम करता है। फ्लोरोसेंट मॉर्फोलॉजिकल मार्करों का उपयोग सेल-चक्र चरण की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है। मायोसिन रिंग, नाभिक और स्पिंडल पोल बॉडी (एसपीबी) के फ्लोरोसेंट लेबलिंग का उपयोग सेल-चक्र चरण को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, और इन्हें सीएलओसीसीएस मॉडल11 में शामिल किया गया था; हालाँकि, इन मापों को इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, सेप्टेशन इंडेक्स का उपयोग एस पोम्बे14 से मॉडलिंग डेटा के लिए इनपुट के रूप में किया गया था। इस प्रकार, मॉडल का उपयोग विभिन्न प्रकार के जीवों में सेल-चक्र विश्लेषण के लिए किया जा सकता है और इसे आगे बढ़ाया जा सकता है।

सीएलओसीसीएस एक पैरामीट्रिक मॉडल है जो इनपुट डेटा (जैसे, नवोदित प्रतिशत, डीएनए सामग्री) से कई मापदंडों के पूर्ण बायेसियन अनुमान की अनुमति देता है। इन मापदंडों में सिंक्रनाइज़ से पुनर्प्राप्ति समय, सेल-चक्र अवधि की लंबाई (मां और बेटी कोशिकाओं के लिए अलग-अलग अनुमानित), और प्रत्येक समय बिंदु पर कोशिकाओं की औसत सेल-चक्र स्थिति शामिल है। ये पैरामीटर आबादी में औसत सेल के व्यवहार का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिससे शोधकर्ता को प्रत्येक समय बिंदु को जीवन रेखा बिंदु के रूप में व्यक्त सेल-चक्र की स्थिति में मैप करने में सक्षम बनाता है। लाइफलाइन बिंदुओं में रूपांतरण सीएलओसीसीएस पैरामीटर लैम्ब्डा (3) और एमयू0 (μ0) 14,15 पर निर्भर करता है। पैरामीटर : मां कोशिकाओं की औसत सेल-चक्र अवधि से मेल खाता है। हालांकि, मां-बेटी की देरी14,15 के कारण, यह पूर्ण आबादी की औसत सेल-चक्र अवधि नहीं है जिसमें मां और बेटी दोनों कोशिकाएं शामिल हैं। सीएलओसीसीएस पैरामीटर डेल्टा (δ) का भी अनुमान लगाता है, जो मां-बेटी की देरी से मेल खाता है और इस प्रकार, पूर्ण आबादी की औसत सेल-चक्र अवधि की गणना करने की अनुमति देता है। अंत में, क्योंकि प्रत्येक प्रयोग सेल-चक्र सिंक्रनाइज़ेशन से रिलीज़ के बाद शुरू होता है, सिंक्रनाइज़ेशन विधि से पुनर्प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय को सीएलओसीसीएस पैरामीटर μ0 द्वारा दर्शाया जाता है। सीएलओसीसीएस इनपुट सेल-चक्र चरण डेटा के लिए एक मॉडल फिट बैठता है और फिर यादृच्छिक वॉक मार्कोव श्रृंखला मोंटे कार्लो एल्गोरिदम14,15 का उपयोग करके इन मापदंडों का अनुमान लगाता है। एक सामान्य सेल-चक्र लाइफलाइन टाइम स्केल पर कई प्रयोगों को मैप करके, प्रतिकृति या प्रयोगों के बीच प्रत्यक्ष चरण-विशिष्ट तुलना की जा सकती है जहां पुनर्प्राप्ति समय या सेल-चक्र अवधिसमान 8,14,15 नहीं है।

चूंकि सिंक्रनाइज़ की गई आबादी समय श्रृंखला14,15,16,17 के दौरान कुछ दर पर सिंक्रनाइज़ खो देती है, सिंक्रनाइज़ हानि की दर में परिवर्तनशीलता भी प्रयोगों में मात्रात्मक तुलना में बाधा डाल सकती है। आबादी के स्थान और उनके वितरण में भिन्नता की पहचान करके, सीएलओसीसीएस सिंक्रनाइज़ हानि की दरों में अंतर के लिए जिम्मेदार है। यह शक्तिशाली उपकरण प्रयोगों में विशिष्ट और विस्तृत तुलना के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार न केवल प्रतिकृति के बीच बल्कि पर्यावरणीय परिस्थितियों, उत्परिवर्ती और यहां तक कि प्रजातियों के बीच भी प्रासंगिक तुलना करने की क्षमता प्रदान करता है जिनके पास नाटकीय रूप से अलग सेल-चक्र समय14,15 है।

रिलीज समय-श्रृंखला प्रयोगों से डेटा फिट करके मापदंडों का अनुमान लगाने के लिए सीएलओसीसीएस का उपयोग करने वाली एक विधि का वर्णन करता है, डेटा को एक सामान्य जीवन रेखा पैमाने पर मैप करता है, और फिर प्रतिकृति या प्रयोगों के बीच प्रासंगिक तुलना करता है। लाइफलाइन संरेखण इन प्रयोगों में प्रत्यक्ष चरण-विशिष्ट तुलना की अनुमति देता है, जो प्रतिकृति के एकत्रीकरण और तुलना के लिए और विभिन्न पुनर्प्राप्ति समय और सेल-चक्र अवधि के साथ प्रयोगों में अधिक प्रासंगिक तुलना करने की अनुमति देता है।

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Protocol

1. सेल-चक्र चरण और प्रयोगात्मक डेटा एकत्र करना

  1. वांछित सिंक्रनाइज़ेशन विधि का उपयोग करके सेल चक्र के संबंध में कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करें (उदाहरण के लिए, लेमन एट अल.18 में वर्णित केन्द्रापसारक एलुट्रिएशन या रोसेब्रोक 19 में वर्णित संभोग फेरोमोन गिरफ्तारी; लेमन एट अल.18 और रोज़ब्रोक 19 दोनों में सिंक्रनाइज़ से रिहाई के तरीके भी शामिल हैं)। पूरे समय श्रृंखला में नमूना लेना शुरू करें, यह सुनिश्चित करें कि समय श्रृंखला लंबाई में कम से कम दो पूर्ण सेल-चक्र अवधि है, और बेहतर रूप से, प्रति सेल चक्र कम से कम 10 नमूने एकत्र करें। प्रत्येक समय बिंदु पर, सेल-चक्र चरण डेटा (नवोदित या प्रवाह साइटोमेट्री) के लिए एक नमूना और प्रयोगात्मक डेटा के लिए एक नमूना एकत्र करें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
  2. यदि सेल-चक्र चरण डेटा के रूप में उभरते डेटा का उपयोग कर रहे हैं, तो सीएलओसीसीएस संरेखण के लिए नवोदित पर डेटा एकत्र करें।
    1. पूरे समय श्रृंखला में नमूना। प्रत्येक समय बिंदु के लिए, कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और उन्हें 200 μL सोनिकेटेड सेल कल्चर को 200 μL फिक्सेटिव समाधान के साथ मिलाकर ठीक करें, जैसा कि लेमन एट अल .18 में वर्णित है।
    2. मानक नवोदित के लिए, 40x उद्देश्य और एक हेमोसाइटोमीटर के साथ एक संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रति समय बिंदु कम से कम 200 कोशिकाओं की गणना करें। हेमोसाइटोमीटर में चरण 1.2.1 से सेल नमूना जोड़ें, और यदि घनत्व गिनती को रोकता है तो पतला करें। प्रत्येक समय बिंदु पर बुड्ड और अनबुडेड कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड करें। बड्ड कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें, और एक नवोदित वक्र में प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्लॉट करें।
      नोट: सेल-चक्र चरण जानकारी निर्दिष्ट करने के अन्य तरीके उपलब्ध हैं, लेकिन ये इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं हैं। अन्य विधियों को सीएलओसीसीएस रीडमे में और पिछले काम11 में वर्णित किया गया है।
  3. यदि सेल-चक्र चरण डेटा के रूप में प्रवाह-साइटोमेट्रिक डीएनए सामग्री डेटा का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रवाह-साइटोमेट्रिक सीएलओसीसीएस संरेखण के लिए फ्लो साइटोमेट्री डीएनए धुंधला डेटा एकत्र करें।
    1. पूरे समय श्रृंखला में नमूना। प्रत्येक समय बिंदु के लिए, कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और उन्हें ठीक करें जैसा कि हासे और रीड20 में वर्णित है।
    2. डीएनए को दाग दें, और मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके विश्लेषण करें। S. cerevisiae के लिए एक अनुशंसित धुंधला प्रोटोकॉल Haase और Reed20 में वर्णित है।
  4. संबंधित ओमिक्स या संबंधित प्रयोगात्मक डेटा एकत्र करें। मानक ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा के लिए, लेमन एट अल.18 और केलिहर एट अल.21,22 में वर्णित के रूप में एकत्र करें। सुनिश्चित करें कि डेटा डाउनस्ट्रीम संरेखण की अनुमति देने के लिए सेल-चक्र चरण डेटा युक्त समय बिंदुओं से जुड़ा हुआ है। इष्टतम संरेखण के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रयोगात्मक डेटा वाले प्रत्येक समय बिंदु में इसके साथ जुड़े चरण डेटा भी हैं।
    नोट: प्रयोगात्मक डेटा कई रूप ले सकता है। परंपरागत रूप से, हम समय-श्रृंखला ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रयोगों को संरेखित करने के लिए वर्णित संरेखण विधि का उपयोग करते हैं। हालांकि, समय बिंदुओं से जुड़े किसी भी प्रकार के डेटा को संरेखित किया जा सकता है (यानी, प्रोटिओमिक्स22)।

2. आवश्यक सॉफ्टवेयर स्थापित करना

नोट: यह खंड मानता है कि कोंडा, जावा 19, और गिट पहले से ही स्थापित हैं (सामग्री की तालिका)।

  1. टर्मिनल में निम्न आदेश दर्ज करके CLOCCS_alignment रेपो डाउनलोड करें:
    गिट क्लोन गिट क्लोन https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. conda_req.yml फ़ाइल का उपयोग करके उस फ़ोल्डर में टर्मिनल में निम्न आदेश दर्ज करके एक Conda वातावरण बनाएँ जहाँ CLOCCS_alignment रेपो क्लोन किया गया था:
    Conda env create -f conda_req.yml

3. प्रयोगों को पैरामीटर करने के लिए सीएलओसीसीएस का उपयोग करना

  1. CLOCCS_alignment रेपो में CLOCCS फ़ोल्डर में cloccs_v2023.jar फ़ाइल पर डबल-क्लिक करें, और ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस खुलने की प्रतीक्षा करें. यह स्क्रीन सीएलओसीसीएस रन के लिए विकल्पों को इनपुट करने की अनुमति देती है और एक बार चलने के बाद परिणाम प्रदर्शित करती है।
  2. सामान्य सेटिंग्स इनपुट करें.
    1. संबंधित पाठ इनपुट बॉक्स में टाइप करके सिम एनाल, बर्न इन और पुनरावृत्तियों को सेट करें। सिम एनेल (सिम्युलेटेड एनीलिंग) अच्छे शुरुआती पैरामीटर मानों की पहचान करता है, बर्न इन पश्चवर्ती मोड की खोज करता है, और अंतिम चरण सभी पश्चवर्ती निष्कर्ष निकालने की अनुमति देता है। उच्च मान रन-टाइम को बढ़ाते हैं लेकिन सटीकता को भी बढ़ाते हैं।
    2. तापमान और ड्रॉपडाउन मेनू सिंक्रो लेबल वाले टेक्स्ट बॉक्स का उपयोग करके सेल्सियस में तापमान और सिंक्रनाइज़ेशन विधि निर्दिष्ट करके प्रयोगात्मक स्थितियों को इनपुट करें। विधि, क्रमशः।
    3. वैकल्पिक रूप से उन्नत सेटिंग्स मेनू में उन्नत सेटिंग्स कॉन्फ़िगर करें। उन्नत सेटिंग्स प्रत्येक पैरामीटर ("mu0", "sigma0", "sigmav", "लैम्ब्डा", "bud.start", "bud.end") के लिए प्राथमिकताओं को सेट करने की अनुमति देती हैं।
      नोट: उन्नत सेटिंग्स के बारे में अधिक जानकारी रीडमी में.txt CLOCCS_alignment रेपो के सीएलओसीसीएस फ़ोल्डर में पाई जा सकती है।
  3. नवोदित डेटा के साथ उपयोग के लिए सेटिंग्स इनपुट करें।
    1. मॉडल प्रकार ड्रॉपडाउन मेनू से उपयुक्त चयन चुनें. डिफ़ॉल्ट विकल्प बड नवोदित खमीर के लिए मानक नवोदित जानकारी के लिए है।
      नोट: ड्रॉपडाउन मेनू में अन्य अधिक उन्नत विकल्प भी मौजूद हैं: उत्परिवर्ती के लिए उभरती जानकारी के लिए उत्परिवर्ती जो विभाजन के बिना कई नवोदित चक्रों से गुजरते हैं, उभरती जानकारी और अतिरिक्त स्पिंडल पोल बॉडी और मायोसिन रिंग जानकारी के लिए बडएसएसएलएसएमआर, और उभरती जानकारी और अतिरिक्त विभाजन और बड गर्दन नाभिक जानकारी के लिए बुडन्यूकडिवनेक। इन उन्नत विकल्पों को सीएलओसीसीएस रीडमे और पिछले काम 11,14,15 में वर्णित किया गया है।
    2. पाठ इनपुट बॉक्स में लिखकर या फ़ाइल का चयन करें बटन पर क्लिक करके फ़ाइल अपलोड करके डेटा आयात पैनल का उपयोग करके डेटा आयात करें. पहला कॉलम समय बिंदुओं को निर्दिष्ट करता है। शेष दो कॉलम नवोदित डेटा निर्दिष्ट करते हैं और निम्नलिखित विकल्पों में से कोई भी ले सकते हैं: अनबुडेड कोशिकाओं की संख्या (नो बड), बुड्ड कोशिकाओं की संख्या (बड), या कोशिकाओं की कुल संख्या (कुल)।
  4. प्रवाह साइटोमेट्रिक डेटा के साथ उपयोग के लिए सेटिंग्स इनपुट करें। प्रत्येक प्रयोग के लिए, या तो चरण 3.3 या चरण 3.4 चलाएँ।
    नोट: फ्लो साइटोमेट्रिक डेटा और नवोदित डेटा का उपयोग एक साथ किया जा सकता है। हालांकि पहले हमने उन्हें एक साथ चलानेका वर्णन किया था, इस उपकरण के लिए, उन्हें स्वतंत्र रूप से चलाया जाना चाहिए और फिर तुलना की जानी चाहिए।
    1. पूरक फ़ाइल 1 में दिए गए निर्देशों का पालन करके प्रवाह साइटोमेट्री के लिए .fcs फ़ाइलों को सही CLOCCS इनपुट प्रारूप में परिवर्तित करें (CLOCCS_alignment रेपो में CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt के रूप में भी पाया जाता है).
    2. मॉडल प्रकार ड्रॉपडाउन मेनू से प्रवाह चयन का चयन करें।
    3. डेटा आयात पैनल का उपयोग कर डेटा आयात करें. फ़ाइल का चयन करें पर क्लिक करें, और चरण 3.4.1 में उत्पन्न फ़ाइल का चयन करें।
    4. टाइम फॉर फिटिंग बॉक्स में समय बिंदुओं का चयन करके उन समय बिंदुओं का चयन करें जिनके लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सीएलओसीएस फिट किया जाना चाहिए।
  5. एक बार जब सभी इनपुट या तो नवोदित या फ्लो साइटोमेट्री के लिए चुने गए हैं, तो लागू करें बटन पर क्लिक करें, और फिर स्क्रीन के शीर्ष पर नमूना बटन पर क्लिक करें।
  6. अनुमानित फिट्स टैब का चयन करके अनुमानित फिट के साथ उभरते वक्र या फ्लो साइटोमेट्री प्लॉट देखें। यह टैब पिछले चरण के तुरंत बाद डिफ़ॉल्ट रूप से खुलता है।
  7. पैरामीटर हिस्टोग्राम टैब का चयन करके प्रत्येक पैरामीटर के लिए पैरामीटर हिस्टोग्राम देखें और फिर निम्न विकल्पों में से रुचि के पैरामीटर से मेल खाने वाले उप-टैब का चयन करें: mu0, डेल्टा, सिग्मा0, सिगमवा, लैम्ब्डा, bud.start, bud.end, आदि।
  8. पश्चवर्ती स्कोर टैब का चयन करके पश्चवर्ती स्कोर प्लॉट देखें.
  9. सेटिंग्स देखें, और सेटिंग्स टैब का चयन करके उन्हें और बदलें; लॉग टैब का चयन करके पिछले रन का लॉग देखें।
  10. पश्चवर्ती पैरामीटर टैब का चयन करके फ़िट से CLOCCS पैरामीटर प्राप्त करें। परिणामी तालिका में निम्नलिखित रूप होगा: प्रत्येक पंक्ति में एक पैरामीटर होता है, जिसमें अंतिम पंक्ति पीछे होती है। कॉलम में माध्य के लिए अनुमानित पैरामीटर, 2.5% कम आत्मविश्वास अंतराल, 97.5% ऊपरी आत्मविश्वास अंतराल और स्वीकृति दर शामिल हैं।
    1. प्रत्येक प्रयोग के लिए संरेखण के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों को रिकॉर्ड करें: सिंक्रनाइज़ से पुनर्प्राप्ति समय (μ0) और मातृ कोशिकाओं की औसत सेल-चक्र अवधि (3)।
    2. मातृ कोशिका अवधि (3) और बेटी कोशिका अवधि (3 + δ) के औसत की गणना करके सेल-चक्र अवधि की गणना करें, जहां δ बेटी-विशिष्ट देरी है।
      नोट: तुलना में शामिल किए जाने वाले सभी प्रयोगों के साथ अनुभाग 3 दोहराएं।

4. पायथन रूपांतरण कार्यों और सीएलओसीसीएस मापदंडों का उपयोग करके समय बिंदुओं को लाइफलाइन बिंदुओं में परिवर्तित करना

नोट: समय बिंदुओं और जीवन रेखा बिंदुओं के बीच रूपांतरण के लिए दो रूपांतरण सूत्र21 की आवश्यकता होती है। रूपांतरण और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक पायथन कार्यान्वयन CLOCCS_alignment रेपो में उपलब्ध है और नीचे वर्णित है।

  1. टर्मिनल में निम्न कमांड दर्ज करके कोंडा वातावरण को सक्रिय करें: कोंडा सक्रिय CLOCCS_alignment
  2. टर्मिनल में निम्न कमांड टाइप करके एक इंटरैक्टिव पायथन नोटबुक खोलें: जुपिटर नोटबुक
  3. वांछित फ़ोल्डर में एक नई पायथन नोटबुक बनाएँ।
    नोट: मानक उपयोग प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण नोटबुक शामिल किया गया है और CLOCCS_ संरेखण रेपो में संरेखण / JOVE_example.ipynb में पाया जा सकता है।
  4. पहले कक्ष में निम्न आदेश चलाकर संरेखण फ़ंक्शंस वाली पायथन फ़ाइल आयात करें:
    %run path_to_repo/cloccs_alignment/संरेखण/उपयोगिताएँ.py
    1. path_to_repo के लिए CLOCCS_alignment रेपो के मार्ग को प्रतिस्थापित करें।
  5. यदि सेल-चक्र चरण डेटा के रूप में उभरते डेटा का उपयोग कर रहे हैं, तो एक नए सेल में निम्न कमांड चलाकर प्रत्येक समय बिंदु पर प्रतिशत वाले डेटा फ्रेम को आयात करें:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. उपयुक्त फ़ाइल पथ और फ़ाइल नाम प्रतिस्थापित करें. यदि फ़ाइल एक .csv फ़ाइल है, तो sep ="\t" निकालें
  6. यदि सेल-चक्र चरण डेटा के रूप में उभरते डेटा का उपयोग कर रहे हैं, तो नवोदित डेटा को एक नए सेल में निम्नलिखित फ़ंक्शन दर्ज करके लाइफलाइन पॉइंट टाइम स्केल पर संरेखित करें:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, टाइमपॉइंट, param_mu0, param_lambda)
    1. टाइमपॉइंट्स के लिए, budding_df डेटा फ़्रेम की अनुक्रमणिका होने के लिए समय बिंदुओं की एक सूची प्रतिस्थापित करें.
    2. param_mu0 और param_lambda के लिए, प्रयोग के लिए अनुभाग 3 में चलाए गए नवोदित सीएलओसीसीएस से सीखे गए मापदंडों को प्रतिस्थापित करें।
  7. यदि फ्लो साइटोमेट्री डेटा का उपयोग कर रहे हैं, तो एक नए सेल में निम्न कमांड चलाकर फ्लो साइटोमेट्री डेटा आयात करें:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. flow_input_folder के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री .fcs फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर के लिए उपयुक्त पथ प्रतिस्थापित करें।
  8. यदि फ्लो साइटोमेट्री डेटा का उपयोग कर रहे हैं, तो एक नए सेल में निम्नलिखित कमांड टाइप करके प्रत्येक प्रयोग के लिए समय बिंदुओं और लाइफलाइन बिंदुओं के बीच एक रूपांतरण तालिका उत्पन्न करें:
    flow_converter = convert_tp_to_ll (टाइमपॉइंट, param_mu0, param_lambda)
    1. टाइमपॉइंट के लिए, फ्लो साइटोमेट्री डेटा से समय बिंदुओं की एक सूची प्रतिस्थापित करें।
    2. param_mu0 और param_lambda के लिए, प्रयोग के लिए अनुभाग 3 में चलाए गए फ्लो साइटोमेट्री सीएलओसीसीएस से सीखे गए मापदंडों को प्रतिस्थापित करें।
  9. प्रयोगात्मक डेटा वाले डेटा फ़्रेम को किसी नए कक्ष में निम्न आदेश चलाकर नोटबुक में आयात करें:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. उपयुक्त फ़ाइल पथ और फ़ाइल नाम प्रतिस्थापित करें. यदि फ़ाइल एक .csv फ़ाइल है, तो sep ="\t" निकालें।
      नोट: यह किसी भी सारणीबद्ध डेटा के लिए किया जा सकता है। प्रयोगात्मक डेटा में केवल डेटा फ्रेम के कॉलम या इंडेक्स के रूप में समय बिंदु होना चाहिए। उदाहरण डेटा CLOCCS_alignment रेपो में पाया जा सकता है।
  10. प्रयोगात्मक डेटा को एक नए सेल में निम्न फ़ंक्शन दर्ज करके लाइफलाइन पॉइंट टाइम स्केल पर संरेखित करें:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, टाइमपॉइंट, param_mu0, param_lambda, इंटरपोल, लोअर, अपरल)
    1. टाइमपॉइंट्स के लिए, समय बिंदुओं की एक सूची को अनुक्रमणिका या पिछले चरण से प्रयोगात्मक data_df के स्तंभों के रूप में प्रतिस्थापित करें.
    2. param_mu0 और param_lambda के लिए, सीएलओसीसीएस से धारा 3 में प्राप्त मानों को प्रतिस्थापित करें।
      नोट: पैरामीटर किसी भी स्वीकृत सेल-चक्र चरण डेटा प्रकारों पर किए गए किसी भी सीएलओसीसीएस रन से आ सकते हैं।
    3. वैकल्पिक रूप से, इंटरपोल को सही या गलत के साथ प्रतिस्थापित करें, या रिक्त छोड़ दें (डिफ़ॉल्ट गलत है)।
      नोट: जब गलत पर सेट किया जाता है, तो डेटा को इंटरपोलेट नहीं किया जाएगा। जब सत्य पर सेट किया जाता है, तो जीवन रेखा बिंदुओं के बीच मूल्यों को भरने के लिए जीवन रेखा बिंदुओं को गोल और इंटरपोलेट किया जाएगा, जैसे कि जीवन रेखा बिंदुओं की सीमा में प्रति पूर्णांक एक बिंदु हो। यह डेटासेट में बेहतर तुलना के लिए अनुमति देता है।
    4. वैकल्पिक रूप से, निचले और ऊपरी को कोई नहीं या पूर्णांक मानों के साथ प्रतिस्थापित करें।
      नोट: जब कोई नहीं पर सेट किया जाता है, तो प्रक्षेप के बाद सभी जीवन रेखा बिंदु रखे जाते हैं। जब पूर्णांक की आपूर्ति की जाती है, तो यह डेटा को छोटा कर देता है ताकि जीवन रेखा बिंदु निचले से ऊपरी तक हो। यह एक अलग निचले या ऊपरी के साथ डेटासेट में तुलना करने की अनुमति देता है।
  11. एक नए कक्ष में निम्न आदेश दर्ज करके लाइफलाइन-संरेखित डेटासेट डाउनलोड करें: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. तुलना में शामिल किए जाने वाले सभी प्रयोगों के साथ चरण 4.5-4.11 दोहराएं।

5. नवोदित वक्रों और प्रवाह साइटोमेट्री डेटा की तुलना करना

  1. पायथन यूटिलिटीज फ़ंक्शन का उपयोग करके संरेखण से पहले नवोदित वक्रों को एक नए सेल में निम्नलिखित कमांड दर्ज करके प्लॉट करें:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, शीर्षक = str_title)
    1. list_of_budding_curves के लिए प्लॉटिंग के लिए सभी वांछित नवोदित वक्रों के डेटा फ्रेम वाली एक सूची को प्रतिस्थापित करें-[bud_df1, bud_df2, bud_df3]।
    2. यदि वांछित हो तो किंवदंती के लिए लेबल की एक सूची को प्रतिस्थापित करें- [प्रयोग 1, प्रयोग 2, उत्परिवर्ती] leg_list लिए। यदि नहीं, तो कोई भी बाहर या प्रतिस्थापित न करें।
    3. str_type के लिए समय बदलें।
    4. यदि वांछित हो तो str_title के लिए एक स्ट्रिंग शीर्षक तुलना नवोदित कर्व्स को प्रतिस्थापित करें। यदि नहीं, तो कोई नहीं बदलें, या बाहर न करें।
  2. चरण 5.1 में दिए गए निर्देशों का पालन करके पायथन यूटिलिटीज फ़ंक्शन का उपयोग करके संरेखण के बाद उभरते वक्रों को प्लॉट करें, लेकिन समय के बजाय list_of_budding_curves के लिए और point_type के लिए जीवन रेखा के साथ संरेखित नवोदित वक्रों की एक सूची के साथ।
  3. फ्लो साइटोमेट्री डेटा को प्लॉट करने के लिए, चरण 4.8 में उत्पन्न कनवर्टर का उपयोग करके संबंधित लाइफलाइन बिंदुओं पर .fcs फ़ाइलों से संबंधित डेटा प्लॉट करें।
  4. कनवर्टर तालिका (तालिका 1) का उपयोग करके जीवनरेखा बिंदुओं को सेल-चक्र चरण में कनवर्ट करें।
    नोट: यह चरण 5.1 में दिए गए निर्देशों का पालन करके भी प्लॉट किया जा सकता है, लेकिन समय के बजाय point_type के लिए चरण के साथ।

6. प्रयोगात्मक डेटा की तुलना करना

  1. साहित्य की जानकारी या शोध के लिए रुचि के जीन के आधार पर लाइन ग्राफ में प्लॉट की जाने वाली जीन सूची निर्धारित करें।
  2. किसी नए कक्ष में निम्न आदेश लिखकर मूल, संरेखित, या संरेखित और इंटरपोलेटेड डेटा फ़्रेम पर लाइन ग्राफ़ तुलना करने के लिए पायथन उपयोगिताओं फ़ाइल में प्रदान की गई plot_linegraph_comparison का उपयोग करें:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, जीनलिस्ट, point_type = str_type, शीर्षक = str_title)
    1. list_of_dfs के लिए तुलना किए जाने वाले प्रयोगों के डेटा फ़्रेम की एक सूची प्रतिस्थापित करें।
      नोट: डेटा फ़्रेम को असंरेखित या संरेखित किया जा सकता है; हालाँकि, संबंधित point_type चरण 6.2.4 में इनपुट होना चाहिए।
    2. प्रत्येक डेटा फ़्रेम के लिए शीर्षकों की सूची को उसी क्रम में प्रतिस्थापित करें जिस क्रम में list_for_legend के लिए डेटा फ़्रेम की सूची है.
    3. जीनलिस्ट के लिए प्लॉट किए जाने वाले जीन नामों (जिन्हें डेटा फ्रेम के सूचकांक में शामिल किया जाना चाहिए) की एक सूची को प्रतिस्थापित करें।
    4. str_type के लिए बिंदु प्रकार प्रतिस्थापित करें। चरण 6.2.1 में संरेखित डेटा फ़्रेम के लिए लाइफलाइन (डिफ़ॉल्ट लाइफलाइन पॉइंट स्केल) या चरण (सेल-चक्र चरण लाइफलाइन स्केल) या चरण 6.2.1 में असंरेखित डेटा फ़्रेम के लिए समय का उपयोग करें.
    5. str_title के लिए वैकल्पिक स्ट्रिंग शीर्षक प्रतिस्थापित करें.
  3. शीर्ष आवधिक जीन निर्धारित करने के लिए साहित्य या एल्गोरिदम का उपयोग करके हीटमैप में शामिल की जाने वाली जीन सूची निर्धारित करें।
    नोट: उचित हीटमैप तुलना के लिए, डेटा को चरण 6.2 में संरेखित, इंटरपोलेट और टाइमस्केल-समायोजित किया जाना चाहिए; इसमें प्रत्येक प्रयोग के लिए समान प्रारंभिक और अंतिम जीवन रेखा मूल्य होना चाहिए।
    1. शीर्ष आवधिक जीन23,24 निर्धारित करने के लिए आवधिकता एल्गोरिदम चलाएं, या जीन सूची (यानी, साहित्य परिणाम) निर्धारित करने के लिए वांछित वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करें।
    2. किसी नए कक्ष में निम्न आदेश का उपयोग करते हुए नोटबुक में .csv या .tsv जीन सूची फ़ाइल आयात करें:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. उपयुक्त फ़ाइल पथ और फ़ाइल नाम प्रतिस्थापित करें. यदि फ़ाइल एक .csv फ़ाइल है, तो sep="\t" निकालें।
  4. एक नए कक्ष में निम्न आदेश लिखकर संरेखित, इंटरपोलेट और चरण-संरेखित डेटा फ़्रेम पर हीटमैप तुलना करने के लिए पायथन उपयोगिताओं फ़ाइल में प्रदान किए गए फ़ंक्शन plot_heatmap_comparison का उपयोग करें:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, जीनलिस्ट, शीर्षक = str_title)
    1. list_of_dfs के लिए तुलना किए जाने वाले प्रयोगों के संरेखित डेटा फ़्रेम की एक सूची प्रतिस्थापित करें।
    2. प्रत्येक डेटा फ़्रेम के लिए शीर्षकों की सूची को उसी क्रम में प्रतिस्थापित करें जिस क्रम में list_for_legend के लिए डेटा फ़्रेम की सूची है.
    3. जीनलिस्ट के लिए प्लॉट किए जाने वाले जीन नामों (जिन्हें डेटा फ्रेम के सूचकांक में शामिल किया जाना चाहिए) की एक सूची को प्रतिस्थापित करें।
    4. str_title के लिए वैकल्पिक स्ट्रिंग शीर्षक प्रतिस्थापित करें.
      नोट: सूची में पहला डेटा फ्रेम वह है जिसका उपयोग हीटमैप में जीन को ऑर्डर करने के लिए किया जाएगा। जीन को उस डेटा फ्रेम के लिए पहली अवधि में अधिकतम आदेश दिया जाएगा, और उसी क्रम का उपयोग सूची में बाद के डेटा फ्रेम के लिए किया जाएगा।

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Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल में और चित्रा 1 में वर्कफ़्लो में वर्णित चरणों को दो प्रतिनिधि तुलनाओं को प्रदर्शित करने के लिए पांच सेल-चक्र सिंक्रनाइज़ समय-श्रृंखला प्रयोगों पर लागू किया गया था: विभिन्न सिंक्रनाइज़ विधियों (संभोग फेरोमोन और केन्द्रापसारक एलुट्रिएशन18) और अनुक्रमण प्लेटफार्मों (आरएनए-अनुक्रमण [आरएनए-सेक] और माइक्रोएरे) के साथ-साथ प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच प्रतिकृति के बीच। सेरेविसिया के साथ कई प्रयोग किए गए थे, और प्रत्येक प्रयोग के लिए सेल-चक्र चरण और प्रयोगात्मक डेटा एकत्र किए गए थे। वर्कफ़्लो में विभिन्न सिंक्रनाइज़ / रिलीज़ टाइम-सीरीज़ प्रयोगों को पैरामीटर करने के लिए सीएलओसीसीएस का उपयोग करना, प्रयोगों को एक सामान्य तुलनीय जीवन रेखा पैमाने पर संरेखित करने के लिए इन मापदंडों का उपयोग करना और फिर दो प्रतिनिधि तुलनाओं के लिए इन संरेखित प्रयोगों का उपयोग करना शामिल है।

प्रतिकृतियों में प्रतिनिधि तुलना प्रदर्शित करने के लिए, हमने एक ही तनाव के साथ और एक ही प्रयोगात्मक स्थितियों में किए गए तीन प्रयोगों का चयन किया, जिसे कंडीशन 1 कहा जाता है। इनमें से दो प्रयोग एक-दूसरे की प्रत्यक्ष प्रतिकृति थे, और दोनों का विश्लेषण माइक्रोएरे विश्लेषण के माध्यम से किया गया था और केन्द्रापसारक एलुट्रिएशन के माध्यम से सिंक्रनाइज़ किया गया था। तीसरे प्रयोग का विश्लेषण आरएनए-सेक विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था और अल्फा कारक संभोग फेरोमोन गिरफ्तारी के माध्यम से सिंक्रनाइज़ किया गया था। अलग-अलग सेल-चक्र अवधि के साथ प्रयोगों में दूसरी तुलना प्रदर्शित करने के लिए, ऊपर से स्थिति 1 आरएनए-सेक प्रयोग (सेल-चक्र अवधि: 71 मिनट) की तुलना स्थिति 2 (सेल-चक्र अवधि: 82 मिनट), और स्थिति 3 (सेल-चक्र अवधि: 110 मिनट) (तालिका 2) के साथ की गई थी। प्रत्येक प्रयोग के लिए, कोशिकाओं को उनकी संबंधित स्थितियों में उगाया गया, सिंक्रनाइज़ किया गया, जारी किया गया, और फिर दो या अधिक सेल-चक्र अवधि में नमूना लिया गया। कोशिका-चक्र चरण पर जानकारी प्रदान करने के लिए नवोदित और / या फ्लो साइटोमेट्री डेटा एकत्र किए गए थे, और या तो माइक्रोएरे या आरएनए-सेक टाइम-सीरीज़ ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा एकत्र किए गए थे जैसा कि लेमन एट अल .18 (पूरक तालिका एस 1) में वर्णित है।

प्रत्येक प्रयोग के लिए, डेटा ने चित्रा 2 में वर्णित रूपों को लिया, जो प्रदर्शन के लिए एक उदाहरण के रूप में कंडीशन 2 प्रयोग प्रस्तुत करता है। प्रत्येक डेटासेट में एक उभरता हुआ वक्र था, जिसने सेल-चक्र चरण के अनुमान की अनुमति दी। इस वक्र में समय श्रृंखला में प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक नवोदित प्रतिशत मान शामिल था, जिसे तब कई सेल-चक्र दोलनों को प्रदर्शित करने वाले एक नवोदित वक्र का उत्पादन करने के लिए प्लॉट किया गया था (चित्रा 2)। सेल-चक्र चरण डेटा ने समय श्रृंखला में प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्रवाह-साइटोमेट्रिक डीएनए सामग्री धुंधला डेटा का रूप भी लिया। शर्त 2 के लिए चुनिंदा समय बिंदु प्लॉट किए गए थे (चित्रा 2)। फ्लो साइटोमेट्री फ़ाइलों को पायथन उपयोगिताओं में flow_cytometry_CLOCCS_file_from_fcs फ़ंक्शन का उपयोग करके सीएलओसीसीएस में डालने के लिए प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्रत्येक लॉग फ्लोरेसेंस बिन में कोशिकाओं को शामिल करने वाली एक एकल तालिका में जोड़ा गया था। प्रत्येक डेटासेट में प्रयोगात्मक डेटा भी शामिल था। इस मामले में, डेटा ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा थे, और डेटा को जीन की पंक्तियों में व्यवस्थित किया गया था, प्रत्येक प्रयोग में प्रत्येक समय बिंदु पर आरएनए की प्रचुरता के लिए एक मूल्य के साथ (चित्रा 2)।

हमने सीएलओसीसीएस के उपयोग और कंडीशन 2 आरएनए-सेक डेटासेट के लिए लाइफलाइन बिंदुओं में रूपांतरण का प्रदर्शन किया है; हालाँकि, प्रक्रिया अन्य प्रयोगों के लिए भी समान थी। उभरती जानकारी को सीएलओसीसीएस एल्गोरिदम में इनपुट किया गया था जैसा कि प्रोटोकॉल खंड 3 में वर्णित है और जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। सिम एनाल, बर्न इन, पुनरावृत्तियों और उन्नत सेटिंग्स के लिए डिफ़ॉल्ट मानों का उपयोग किया गया था। उपयुक्त प्रयोगात्मक स्थितियों का चयन किया गया था। नवोदित डेटा के लिए "बड" के मॉडल प्रकार का उपयोग किया गया था। परिणामी सीएलओसीसीएस नवोदित फिट ्स को यह सुनिश्चित करने के लिए देखा गया था कि नवोदित वक्र ठीक से फिट थे, जैसा कि डेटा बिंदुओं द्वारा प्रदर्शित किया गया है जो एक छोटे से 95% आत्मविश्वास बैंड (चित्रा 3 बी और पूरक चित्रा एस 1) के साथ संबंधित फिट वक्र को पार करते हैं। पश्चवर्ती पैरामीटर तालिका (चित्रा 3 सी) से 0 और0 μ पैरामीटर संरेखण में उपयोग के लिए दर्ज किए गए थे। शर्त 2 के लिए फ्लो साइटोमेट्री डेटा को अलग से सीएलओसीसीएस में इनपुट किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल खंड 3 में वर्णित है। वर्तमान में, सीएलओसीसीएस को उम्मीद है कि फ्लो साइटोमीटर 1,024 चैनलों के साथ 10 बिट डेटा का उत्पादन करेंगे; हालांकि, आधुनिक प्रवाह साइटोमीटर में अधिक चैनल हो सकते हैं। चूंकि हमारा फ्लो साइटोमीटर 1,024 से अधिक चैनलों के साथ डेटा का उत्पादन करता है, इसलिए डेटा को 1,024 डिब्बे में विभाजित किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री सेल-चक्र चरण डेटा के साथ, सीएलओसीसीएस प्रत्येक चयनित समय बिंदु (चित्रा 3 डी और पूरक चित्रा एस 2) के लिए एक सीएलओसीसीएस फिट का उत्पादन करता है और चित्रा 3 सी में नवोदित पश्चवर्ती पैरामीटर तालिका के समान एक पश्चवर्ती पैरामीटर तालिका प्रदान करता है। अन्य प्रयोगों में से प्रत्येक के लिए सीएलओसीसीएस चलाने वाले नवोदित के पैरामीटर तालिका 2 में वर्णित हैं, और फ्लो साइटोमेट्री के पैरामीटर जो सीएलओसीसीएस चलाते हैं, पूरक तालिका एस 2 में वर्णित हैं।

जीवन रेखा संरेखण के लिए मातृ कोशिकाओं की सेल-चक्र अवधि और पुनर्प्राप्ति समय (μ0) के अनुरूप सीएलओसीसीएस मापदंडों का उपयोग किया गया था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह आवश्यक रूप से सेल आबादी की औसत सेल-चक्र अवधि का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। ऐसे मामलों में जहां कोशिकाएं एक पूर्ण विभाजन से गुजरती हैं, वहां मां और बेटी कोशिकाओं की समान संख्या होती है, इसलिए औसत सेल-चक्र अवधि मां कोशिकाओं की सेल-चक्र अवधि और बेटी कोशिकाओं की सेल-चक्र अवधि (3 + δ) के बीच औसत है; विशेष रूप से, डेल्टा (δ) बेटी-विशिष्ट देरी की लंबाई है। यह वह गणना है जिसका उपयोग हमने प्रत्येक प्रयोग के लिए सेल-चक्र अवधि के लिए किया था (तालिका 2)। प्रत्येक प्रयोग के लिए, संबंधित पैरामीटर 3 और μ0 का उपयोग रूपांतरण फ़ंक्शन, df_conversion_from_parameters में किया गया था, जैसा कि स्थिति 2 (चित्रा 4 ए) के लिए प्रदर्शित किया गया है। उभरते वक्रों के लिए, डेटा को इंटरपोलेट नहीं किया गया था। हालांकि, प्रयोगात्मक डेटा के लिए, लाइफलाइन-संरेखित डेटासेट को प्रक्षेप का उपयोग करके फिर से नमूना लिया गया था जैसे कि प्रत्येक लाइफलाइन बिंदु में बेहतर प्लॉटिंग के लिए इंटरपोलेटेड डेटा शामिल था। यह सुनिश्चित करने के लिए कि लाइफलाइन-संरेखित डेटासेट में लाइफलाइन बिंदुओं की समान सीमा थी, उन बिंदुओं पर डेटा को छोटा करने के लिए निचली और ऊपरी जीवन रेखा सीमाएं निर्धारित की गई थीं। जब प्रक्षेप को ट्रू पर सेट किया गया था तो इन निचले और ऊपरी मापदंडों को df_conversion_from_parameters फ़ंक्शन में इनपुट किया गया था। शर्त 1 तुलना के लिए, उन्हें सभी डेटासेट के लिए क्रमशः 44 और 270 पर सेट किया गया था, और पर्यावरणीय परिस्थितियों में तुलना के लिए, उन्हें क्रमशः 50 और 300 पर सेट किया गया था। संरेखण और तुलना के लिए इन कार्यों का एक उदाहरण उपयोग उदाहरण पायथन नोटबुक JOVE_example.ipynb में देखा जा सकता है, और आंकड़े उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कोड को CLOCCS_alignment रेपो में JOVE_Figures.ipynb नोटबुक में देखा जा सकता है।

समय बिंदुओं से जीवन रेखा बिंदुओं में यह रूपांतरण दो सूत्रों21 (चित्रा 4 ए) पर निर्भर करता है जिसमें μ0 (पुनर्प्राप्ति समय) और " (मातृ अवधि) का उपयोग किया जाता है। पहला सूत्र, Equation 1पुनर्प्राप्ति चरण सूत्र (चित्रा 4 ए) है। इस सूत्र का उपयोग केवल पुनर्प्राप्ति चरण के भीतर समय बिंदुओं के लिए किया जाता है, जिसमें μ 0 तक और शामिल समय बिंदु शामिल होते हैं, क्योंकिμ 0 पुनर्प्राप्ति समय से मेल खाता है। समय बिंदुओं को तब 100 लाइफलाइन पॉइंट्स (तालिका 1) के साथ समाप्त होने वाली लाइफलाइन स्केल रेंज में परिवर्तित किया जाता है, जो रिकवरी चरण के अंत और पहले सेल चक्र की शुरुआत को चिह्नित करता है। पोस्ट-रिकवरी चरण दूसरे सूत्र का उपयोग करता है, Equation 2 (चित्रा 4 ए), जो प्रत्येक बाद के पोस्ट-रिकवरी समय बिंदु को 100 के बाद एक जीवन रेखा बिंदु में परिवर्तित करता है। प्रत्येक बाद के 100 जीवन रेखा बिंदु एक नए कोशिका चक्र के अनुरूप होते हैं, जिसमें पहला चक्र जीवन रेखा बिंदुओं के अनुरूप 100 से 200, दूसरा चक्र 200 से 300 के अनुरूप होता है, और इसी तरह (तालिका 1)। समय बिंदुओं से लाइफलाइन बिंदुओं में रूपांतरण प्रत्येक डेटासेट पर व्यक्तिगत रूप से उस डेटासेट के लिए संबंधित सीएलओसीसीएस मापदंडों का उपयोग करके लागू किया जाता है। प्रत्येक डेटासेट को लाइफलाइन स्केल में परिवर्तित करने के बाद, सेल-चक्र चरणों को संरेखित किया जाता है, जो डेटासेट में चरण-विशिष्ट तुलना की अनुमति देता है।

तालिका 3 नवोदित सीएलओसीसीएस रन के मापदंडों का उपयोग करके कंडीशन 2 डेटासेट के प्रतिनिधि रूपांतरण के लिए चुनिंदा समय बिंदुओं को उनके संबंधित लाइफलाइन बिंदुओं में परिवर्तित करती है। कंडीशन 2 आरएनए-सेक से एकत्र किए गए नवोदित डेटा को एक नवोदित वक्र में प्लॉट किया गया था, जिसमें पायथन नोटबुक में पायथन फ़ंक्शन plot_budding_curves का उपयोग करके मिनटों में असंरेखित समय पैमाने (चित्रा 4 बी) और लाइफलाइन बिंदुओं (चित्रा 4 सी) में संरेखित टाइमस्केल दोनों के लिए समय के साथ प्रतिशत कम दिखाया गया था। लाइफलाइन बिंदुओं को आसानी से प्रयोगात्मक और सेल-चक्र चरण जानकारी (तालिका 1) में परिवर्तित किया जा सकता है, और पुनर्प्राप्ति चरण और पहले से तीसरे सेल चक्र को तदनुसार हाथ से रंग-कोडित किया गया था (चित्रा 4 बी, सी)। चूंकि प्रत्येक जीवन रेखा बिंदु एक सेल-चक्र चरण से मेल खाता है, इसलिए व्यक्तिगत प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों को जीवनरेखा संरेखण द्वारा निर्धारित सेल-चक्र चरण का उपयोग करके पायथन कार्यों के माध्यम से लेबल किया जा सकता है। ये चरण स्थिति 2 के लिए प्रवाह-साइटोमेट्रिक विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित चरणों से मेल खाते हैं। कंडीशन 2 डेटासेट के लिए एकत्र किए गए फ्लो साइटोमेट्री डेटा को चुनिंदा समय बिंदुओं के लिए प्लॉट किया गया था और फ्लो साइटोमेट्री लाइफलाइन संरेखण से निर्धारित सेल-चक्र चरण का उपयोग करके लेबल किया गया था। प्रत्येक मामले में, डेटा संरेखण (चित्रा 4 डी) द्वारा निर्धारित चरण से मेल खाता है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक नमूने के लिए प्रत्येक जीन का अभिव्यक्ति स्तर समान रहता है, लेकिन समय बिंदुओं की लेबलिंग को मिनटों में समय से लाइफलाइन बिंदुओं में बदल दिया जाता है। हालाँकि, रूपांतरण रैखिक नहीं है। ग्रे रंग में हाइलाइट किया गया रिकवरी चरण, लाइफलाइन बिंदुओं में रूपांतरण के बाद प्रयोगात्मक समय का एक उच्च प्रतिशत घेरता है (चित्रा 4 बी, सी)। लाइफलाइन स्केल का लाभ यह है कि यह प्रयोगों में विस्तृत चरण जानकारी और चरण तुलना की अनुमति देता है। चरण की जानकारी जीवन रेखा बिंदुओं में निहित है, जैसा कि ऊपर वर्णित है और तालिका 1 में प्रदर्शित किया गया है। इसके अलावा, जी 1 प्रत्येक कोशिका चक्र के पहले 15.5 जीवन रेखा बिंदुओं में निहित है, एस अगले 20 जीवन रेखा बिंदुओं में, और जी 2 / एम अगले 64.5 जीवन रेखा बिंदुओं में (तालिका 1)। हालांकि, यह कृत्रिम रूप से पुनर्प्राप्ति समय को प्रत्येक लगातार सेल चक्र के समान समय अवधि तक सीमित करता है, भले ही पुनर्प्राप्ति चरण मूल समय बिंदु पैमाने में बहुत कम दिखाई दे। यह तुलनाओं को अस्पष्ट नहीं करता है, क्योंकि प्रत्येक प्रयोग के चरण संरेखित होते हैं। ज्यादातर मामलों में, मिनटों में एक ही समय में होने वाले समय बिंदुओं के बजाय एक ही प्रयोगात्मक और जैविक चरण में होने वाले बिंदुओं पर डेटा की तुलना करना अधिक प्रासंगिक है।

एक बार पायथन उपयोगिताओं फ़ाइल में प्रदान किए गए पायथन फ़ंक्शंस का उपयोग करके सभी प्रयोगों को संरेखित लाइफलाइन स्केल में परिवर्तित कर दिया गया है, तो उनकी तुलना की जा सकती है। यहां, हम प्रयोगों के बीच दो सामान्य तुलनाओं का प्रदर्शन करते हैं: एक प्लेटफार्मों और सिंक्रनाइज़ेशन विधियों (चित्रा 5) में एक समान प्रयोग की प्रतिकृति के बीच और एक बदलती अवधि की लंबाई के साथ विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच (चित्रा 6 और चित्रा 7)। जैसा कि ऊपर वर्णित है, पहली तुलना दो एलुट्रिएटेड माइक्रोएरे प्रतिकृति और एक अल्फा कारक सिंक्रनाइज़ आरएनए-सेक प्रयोग में है। संरेखण से पहले, दो माइक्रोएरे प्रतिकृतियों ने समान सिंक्रनाइज़ और सेल-चक्र गतिशीलता दिखाई, लेकिन कंडीशन 1 माइक्रोएरे 2 प्रतिकृति थोड़ी देरी से दिखाई दी (चित्रा 5 ए)। असंरेखित डेटासेट की तुलना करते समय सबसे उल्लेखनीय अंतर पाया गया; कंडीशन 1 आरएनए-सेक दूसरा चक्र दो माइक्रोएरे प्रयोगों के पहले चक्र के साथ संरेखित दिखाई दिया। अंतर संभवतः विभिन्न ट्रांसक्रिप्टोमिक प्लेटफार्मों से संबंधित नहीं था, बल्कि विभिन्न सिंक्रनाइज़ेशन विधियों से संबंधित था। माइक्रोएरे प्रयोगों में सेल आबादी को केन्द्रापसारक एलुट्रिएशन द्वारा सिंक्रनाइज़ किया गया था, जबकि आरएनए-सेक प्रयोग के लिए आबादी को संभोग फेरोमोन उपचार द्वारा सिंक्रनाइज़ किया गया था। दरअसल, संभोग फेरोमोन के साथ सिंक्रनाइज़ेशन ने एलुट्रिएशन (चित्रा 5 ए और तालिका 2) की तुलना में पुनर्प्राप्ति समय को काफी कम कर दिया।

बीते हुए समय के संदर्भ में प्लॉट किए जाने पर प्रतिकृतियों के बीच स्पष्ट अंतर के बावजूद, जीवन रेखा संरेखण के बाद, वक्र लगभग समान थे, और प्रतिकृतियों में अधिक विस्तृत और प्रासंगिक तुलना संभव हो गई थी (चित्रा 5 बी)। पुनर्प्राप्ति चरण को संरेखित किया गया था ताकि प्रत्येक प्रयोग एक ही जीवन रेखा बिंदु पर शुरू हो, और अवधि में भिन्नताओं को जीवन रेखा संरेखण द्वारा सामान्यीकृत किया गया था। संरेखण के कारण, प्रतिकृतियों में एक ही जीवन रेखा बिंदु पर प्रयोगात्मक मान एक ही सेल-चक्र चरण में हुए, इस प्रकार प्रतिकृति में प्रयोगात्मक विचरण की गणना को सक्षम किया गया। प्रत्येक प्रयोग में सेल-चक्र चरणों के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए पुनर्प्राप्ति और सेल-चक्र चरणों को चित्रा 5 बी में लेबल किया गया है। इस लाइफलाइन संरेखण को तब उपयोगिता फ़ाइल में प्रदान किए गए पायथन फ़ंक्शन df_conversion_from_parameters का उपयोग करके प्रयोगात्मक डेटासेट (चित्रा 5 सी, डी) पर लागू किया जा सकता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है।

चित्रा 5 डी में, ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा को संरेखित किया गया था, और सीडीसी 20 जीन के लिए अभिव्यक्ति गतिशीलता को पायथन नोटबुक में plot_linegraph_comparison पायथन फ़ंक्शन का उपयोग करके प्लॉट किया गया था। संरेखण से पहले, ऐसा प्रतीत होता है कि माइक्रोएरे प्रयोगों की पहली चरम अभिव्यक्ति आरएनए-सेक प्रयोग (चित्रा 5 सी) के दूसरे शिखर के साथ संरेखित है; हालांकि, संरेखण के बाद, प्रत्येक डेटासेट के पहले सेल-चक्र शिखर ठीक से संरेखित होते हैं (चित्रा 5 डी)। इसके अलावा, प्रयोगों की चरम चौड़ाई आरएनए-सेक डेटासेट और माइक्रोएरे डेटासेट के बीच भिन्न दिखाई दी, लेकिन संरेखण के बाद, शिखर चौड़ाई अधिक संरेखित थी (चित्रा 5 सी, डी)।

दूसरी तुलना विभिन्न सेल-चक्र अवधि (चित्रा 6) के साथ विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में प्रयोगों के बीच है। जैसा कि ऊपर वर्णित है, यहां, हमने शर्त 1 में एस सेरेविसिया डेटासेट की तुलना शर्त 2 और शर्त 3 से की, जो क्रमशः 71, 82 और 110 मिनट की सेल-चक्र अवधि के अनुरूप हैं। सेल-चक्र अवधि में इन अंतरों ने सेल-चक्र चरण संरेखण से पहले प्रयोगों में तुलना करते समय अनिश्चितता पैदा की, जैसा कि असंबद्ध नवोदित वक्रों में दिखाया गया है। असंबद्ध नवोदित वक्रों में अवधि अंतर दिखाई देते हैं (चित्र 6ए)। हालांकि, जब उन्हें इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सीएलओसीसीएस संरेखित किया गया था, तो तीन वक्र उल्लेखनीय रूप से समान दिखते थे, इस प्रकार प्रयोगात्मक डेटा की तुलना संभव हो जाती है (चित्रा 6 बी)।

फ्लो साइटोमेट्री सीएलओसीसीएस मापदंडों का उपयोग करते हुए, कंडीशन 1 और कंडीशन 2 को एक सामान्य लाइफलाइन स्केल के साथ संरेखित किया गया था, और डीएनए सामग्री हिस्टोग्राम को कंडीशन 2 में और कंडीशन 1 में समकक्ष लाइफलाइन पॉइंट्स पर प्लॉट किया गया था। लाइफलाइन बिंदुओं में डीएनए सामग्री के प्रवाह साइटोमेट्रिक माप की तुलना की गई (चित्रा 6 सी)। चूंकि डीएनए सामग्री माप निरंतर नहीं थे और आसानी से इंटरपोलेट नहीं किए गए थे, इसलिए हम केवल निकटतम जीवन रेखा बिंदुओं की तुलना कर सकते थे। प्रत्येक तुलनीय जीवन रेखा बिंदु के लिए सेल-चक्र चरण डेटा दो स्थितियों (चित्रा 6 सी) के बीच समान नहीं था, जो इंगित करता है कि सीएलओसीसीएस फिट बैठता है और परिणामस्वरूप पैरामीटर संभवतः स्थिति 1 के लिए थोड़ा गलत संरेखित थे। यह संभवतः स्थिति 2 (पूरक चित्रा 2) की तुलना में स्थिति 1 के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक डेटा में फिट होने वाले खराब सीएलओसीसीएस के कारण था। हालांकि, संरेखण केवल एक नमूने में विचलित हो गया और इस प्रकार, अभी भी बेहतर चरण-विशिष्ट तुलना की अनुमति देता है।

नवोदित लाइफलाइन संरेखण को तब प्रयोगात्मक डेटा पर df_conversion_from_parameters फ़ंक्शन में नवोदित सीएलओसीसीएस मापदंडों का उपयोग करके स्थिति 1, शर्त 2 और स्थिति 3 (चित्रा 7) में आरएनए-सेक प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक डेटा पर लागू किया गया था। ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा को संरेखित किया गया था, और प्रत्येक बार श्रृंखला के लिए जीन सीडीसी 20 की जीन अभिव्यक्ति को तीन प्रयोगों के लिए दिखाया गया था। संरेखण से पहले, सीडीसी 20 की प्रतिलेख गतिशीलता गैर-अतिव्यापी थी (चित्रा 7 ए)। संरेखण के बाद, सीडीसी 20 जीन अभिव्यक्ति की पहली और दूसरी चोटियों को सभी तीन डेटासेट के लिए अधिक बारीकी से संरेखित किया गया था। संरेखण के बाद, यह स्पष्ट हो गया कि चोटियां एक ही सेल-चक्र चरण में हुईं, लेकिन वक्रों के आकार अलग-अलग थे (चित्रा 7 बी)। सेल-चक्र अवधि में अंतर के लिए लेखांकन के बाद भी स्थिति 3 में अन्य दो स्थितियों की तुलना में कम और व्यापक पहला शिखर था, यह सुझाव देते हुए कि ये अंतर परीक्षण की जा रही प्रयोगात्मक स्थितियों से संबंधित थे (चित्रा 7 बी)।

बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिप्टोमिक तुलना भी की जा सकती है। इन तुलनाओं के लिए, प्रत्येक डेटासेट पर आवधिकता एल्गोरिथ्म JTK_CYCLE23 चलाकर और शीर्ष आवधिक जीनों के प्रतिच्छेदन को लेकर 278 जीनों का चयन किया गया था। हालांकि, जीन को किसी भी वांछित विधि का उपयोग करके या साहित्य से चुना जा सकता है। इन जीनों को पायथन नोटबुक में plot_heatmap_comparison पायथन फ़ंक्शन का उपयोग करके असंरेखित (चित्रा 7 सी) और संरेखित (चित्रा 7 डी) हीटमैप दोनों के लिए सभी तीन स्थितियों के लिए समान क्रम में प्लॉट किया गया था। ये हीटमैप एक साथ सैकड़ों जीन-स्तरीय तुलना करने की अनुमति देते हैं। वक्र गतिशीलता में परिवर्तन, पड़ोसी जीन के सापेक्ष चरम समय और अवधि की लंबाई आदि के बारे में असंरेखित प्रयोगों में तुलना की जा सकती है (चित्रा 7 सी)। हालांकि, विस्तृत चरण-विशिष्ट तुलना नहीं की जा सकी क्योंकि समय बिंदु आवश्यक रूप से स्थितियों में एक ही सेल-चक्र चरण से संबंधित नहीं हैं। यद्यपि दूसरे चक्र संरेखण के बाद समान दिखाई दिए, पहले चक्र ों को स्थितियों के बीच थोड़ा स्थानांतरित कर दिया गया (चित्रा 7 डी)। यह बदलाव इस तथ्य को प्रतिबिंबित कर सकता है कि नवोदित सेल-चक्र चरण की जानकारी शर्त 3 के लिए कम गुणवत्ता की थी। बहरहाल, तीन स्थितियों के लिए प्रयोगों के संरेखण ने एक बेहतर चरण-विशिष्ट तुलना की अनुमति दी। संरेखण से पहले, यह स्पष्ट नहीं था कि प्रत्येक स्थिति में अभिव्यक्ति का पहला शिखर एक ही सेल-चक्र चरण (चित्रा 7 सी) में होगा या नहीं; हालांकि, संरेखण के बाद, प्रयोगों की तुलना चरण-विशिष्ट तरीके से की जा सकती है (चित्रा 7 डी)। संरेखण से पहले, स्थिति 3 में चोटियां अन्य दो स्थितियों की तुलना में बहुत व्यापक दिखाई दीं (चित्रा 7 सी); हालांकि, संरेखण के बाद, यह स्पष्ट हो गया कि स्थिति 3 में चोटियां संरेखित होने पर अन्य स्थितियों के समान चौड़ाई की थीं (चित्रा 7 डी)।

ये प्रतिनिधि परिणाम प्रयोगों को एक सामान्य समय पैमाने पर संरेखित करने के लिए सीएलओसीसीएस के उपयोग की प्रक्रिया को प्रदर्शित करते हैं। संरेखण से पहले, प्रत्यक्ष समय बिंदु तुलना अक्सर एक समान सेल-चक्र चरण से संबंधित नहीं होती है। सेल-चक्र चरण का प्रतिनिधित्व करने वाले मिनटों में बीते प्रयोगात्मक समय को लाइफलाइन बिंदुओं में बदलने से सेल चक्र में एक ही बिंदु पर प्रयोगों के बीच चरण-विशिष्ट और जैविक रूप से प्रासंगिक तुलना की अनुमति मिलती है।

Figure 1
चित्र 1: सीएलओसीसीएस लाइफलाइन संरेखण वर्कफ़्लो अवलोकन। सीएलओसीसीएस का उपयोग करके दो उदाहरण डेटासेट के संरेखण के लिए प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो, इसके बाद डेटासेट के बीच प्रतिनिधि तुलना। प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों को चित्रित किया गया है: प्रत्येक डेटासेट (चरण 1) के लिए असंरेखित सेल-चक्र चरण और प्रयोगात्मक डेटा का संग्रह, प्रत्येक डेटासेट (चरण 2 और चरण 3) के पैरामीटराइजेशन के लिए सीएलओसीएस का उपयोग, डेटासेट का एक सामान्य जीवन रेखा (चरण 4) के लिए संरेखण, और अंत में, सेल-चक्र चरण और प्रयोगात्मक गतिशीलता (चरण 5 और चरण 6) की तुलना। असंरेखित सेल-चक्र चरण डेटा को सीखे हुए मापदंडों को प्रदान करने के लिए सीएलओसीसीएस में इनपुट किया जाता है, जिसका उपयोग तब एक सामान्य जीवन रेखा पैमाने पर संरेखण के लिए किया जाता है। इन संरेखित डेटासेट की तुलना तब की जाती है। संक्षिप्त नाम: सीएलओसीसीएस = सेल चक्र सिंक्रनाइज़ के नुकसान की विशेषता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: वर्कफ़्लो के लिए आवश्यक सेल-चक्र चरण और प्रयोगात्मक डेटा का स्वरूप। वर्कफ़्लो के लिए आवश्यक डेटा में दो मुख्य घटक होते हैं: सेल-चक्र चरण डेटा और सेल-चक्र प्रयोगात्मक डेटा। सेल-चक्र चरण डेटा में समय श्रृंखला में प्रत्येक समय बिंदु के लिए सेल-चक्र नवोदित डेटा या प्रवाह-साइटोमेट्रिक डीएनए सामग्री डेटा शामिल हो सकता है। प्रयोगात्मक डेटा कई रूप ले सकता है, लेकिन इस मामले में, ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा है, जिसमें समय श्रृंखला में हर समय बिंदु के लिए प्रत्येक जीन के लिए जीन अभिव्यक्ति डेटा शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एस सेरेविसिया सेल-चक्र डेटासेट पर सीएलओसीसीएस चलाने के परिणामों का उदाहरण। (ए) शर्त 2 नवोदित डेटा के लिए प्रदान किए गए इनपुट मानों और सेटिंग्स के साथ सीएलओसीसीएस ग्राफिकल यूजर इंटरफेस का एक स्क्रीनशॉट। समय, अनबुडेड कोशिकाओं की संख्या, और बुड्ड कोशिकाओं की संख्या, साथ ही मॉडल प्रकार, पुनरावृत्तियों और शर्तों आदि को इनपुट किया जाता है। (बी) परिणामों के "अनुमानित फिट" टैब के तहत स्थिति 2 के लिए परिणामी सीएलओसीसीएस का एक स्क्रीनशॉट फिट होता है। प्रत्येक डेटापॉइंट में डेटा के 95% द्विपद अनुपात आत्मविश्वास अंतराल के अनुरूप एक संबद्ध नमूना त्रुटि पट्टी होती है (प्रत्येक समय बिंदु के लिए, कम से कम 200 कोशिकाओं की गणना की गई थी [204 और 295 कोशिकाओं के बीच])। परिणामी नवोदित फिट वक्र सीएलओसीसीएस के 95% आत्मविश्वास अंतराल के लिए आत्मविश्वास बैंड को बैंगनी रंग में फिट दिखाता है। (सी) कंडीशन 2 नवोदित सीएलओसीसीएस के लिए परिणामी "पश्चवर्ती पैरामीटर" तालिका का एक स्क्रीनशॉट जिसमें औसत पर सीएलओसीसीएस पैरामीटर, 2.5% आत्मविश्वास अंतराल और 97.5% आत्मविश्वास अंतराल शामिल हैं। पीछे और स्वीकृति दर भी दिखाई गई है। (डी) फ्लो साइटोमेट्री सीएलओसीसीएस का एक स्क्रीनशॉट 70 मिनट और 150 मिनट पर स्थिति 2 के लिए फिट बैठता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: स्थिति 2 डेटासेट के लिए समय बिंदुओं से संरेखित जीवन रेखा बिंदुओं तक रूपांतरण प्रक्रिया का उदाहरण। (ए) समय बिंदुओं से जीवन रेखा बिंदुओं में परिवर्तित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रूपांतरण सूत्र। पायथन का एक स्क्रीनशॉट पाइथन नोटबुक में रूपांतरण और नवोदित वक्रों को प्लॉट करने के लिए कार्य करता है। (बी) असंरेखित स्थिति 2 नवोदित वक्र मिनटों में प्रत्येक समय बिंदु के लिए उभरते प्रतिशत को दर्शाता है। सेल-चक्र और पुनर्प्राप्ति चरणों को निम्नानुसार हाइलाइट किया गया है: रिकवरी (ग्रे), पहला सेल चक्र (नीला), दूसरा सेल चक्र (मैजेंटा), और तीसरा सेल चक्र (सैल्मन)। (ग) संरेखित स्थिति 2 उदीयमान वक्र समान उदीयमान प्रतिशत को दर्शाता है लेकिन जीवन रेखा-संरेखित पैमाने पर प्लॉट किया गया है। सेल-चक्र और पुनर्प्राप्ति चरणों को पैनल सी में हाइलाइट किया गया है। (डी) जीवन रेखा पैमाने के आधार पर अलग-अलग सेल-चक्र चरणों के अनुरूप स्थिति 2 से चुनिंदा समय बिंदुओं के लिए संरेखित प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट: जी 1 की शुरुआत, एस-चरण की शुरुआत, जी 2 / एम की शुरुआत, और देर से जी 2 / एम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: संरेखित और असंरेखित स्थिति की तुलना के लिए प्रतिनिधि परिणाम 1 प्रयोगों को दोहराते हैं। स्थिति 1 प्रतिकृति की तुलना: स्थिति 1 आरएनए-सेक (नीला), स्थिति 1 माइक्रोएरे 1 (बैंगनी), और स्थिति 1 माइक्रोएरे 2 (ग्रे)। (ए) कंडीशन 1 डेटासेट के लिए असंरेखित नवोदित वक्र। (बी) शर्त 1 डेटासेट के लिए संरेखित नवोदित वक्र। लाइफलाइन बिंदुओं को सेल-चक्र चरण में परिवर्तित कर दिया गया है और एक्स-अक्ष के नीचे रंग-कोडित किया गया है। (सी) कंडीशन 1 डेटासेट के लिए एक प्रतिनिधि जीन, सीडीसी 20 की असंरेखित जीन अभिव्यक्ति। (डी) कंडीशन 1 डेटासेट के लिए एक प्रतिनिधि जीन, सीडीसी 20 की संरेखित जीन अभिव्यक्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: अलग-अलग अवधि के साथ प्रयोगों में संरेखित और असंरेखित सेल-चक्र चरण डेटा की तुलना के लिए प्रतिनिधि परिणाम। तीन अलग-अलग पर्यावरणीय स्थितियों के साथ डेटासेट के लिए सेल-चक्र चरण डेटा की तुलना और, इस प्रकार, तीन अलग-अलग सेल-चक्र अवधि: स्थिति 1 आरएनए-सेक (सेल-चक्र अवधि: 71 मिनट), स्थिति 2 आरएनए-सेक (सेल-चक्र अवधि: 82 मिनट), और स्थिति 3 आरएनए-सेक (सेल-चक्र अवधि: 110 मिनट)। (ए) डेटासेट के लिए असंरेखित नवोदित वक्र। (बी) डेटासेट के लिए संरेखित नवोदित वक्र। (सी) स्थिति 1 (नीचे पंक्ति) में समकक्ष जीवन रेखा बिंदुओं की तुलना में स्थिति 2 (शीर्ष पंक्ति) के लिए प्रवाह-साइटोमेट्रिक डीएनए सामग्री हिस्टोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: अलग-अलग अवधि के साथ प्रयोगों में संरेखित और असंरेखित ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा की तुलना के लिए प्रतिनिधि परिणाम। चित्रा 6 में डेटासेट से जुड़े ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा की तुलना: स्थिति 1 आरएनए-सेक, स्थिति 2, और स्थिति 3। (ए) स्थिति 1, शर्त 2, और स्थिति 3 आरएनए-सेक डेटासेट के लिए एक प्रतिनिधि जीन, सीडीसी 20 की असंरेखित जीन अभिव्यक्ति। (बी) डेटासेट के लिए सीडीसी 20 की संरेखित जीन अभिव्यक्ति। (सी) प्रत्येक डेटासेट के लिए समान क्रम में शीर्ष सेल-चक्र आवधिक जीन का असंरेखित हीटमैप। (डी) एक ही क्रम में पैनल सी से एक ही सेल-चक्र आवधिक जीन के जीवनरेखा-संरेखित हीटमैप। धराशायी बैंगनी रेखाएं जीवन रेखा बिंदु 100 और 200 के अनुरूप हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: सेल-चक्र चरण रूपांतरण के लिए जीवन रेखा बिंदु। प्रयोग में लाइफलाइन पॉइंट स्केल और संबंधित चरण के बीच रूपांतरण कुंजी। लाइफलाइन पॉइंट 0-100 सिंक्रनाइज़ से रिकवरी के अनुरूप हैं। प्रत्येक बाद के 100 जीवन रेखा बिंदु एक नए सेल चक्र के अनुरूप होते हैं, जिसमें पहले 15.5 लाइफलाइन बिंदु जी 1 के अनुरूप होते हैं, अगले 20 एस-चरण के अनुरूप होते हैं, और शेष जीवन रेखा बिंदु जी 2 / एम के अनुरूप होते हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: नवोदित सीएलओसीसीएस पैरामीटर। प्रतिनिधि परिणामों से प्रत्येक प्रयोग के लिए परिणामी नवोदित सीएलओसीएस पैरामीटर "लैम्ब्डा" और "एमयू0"। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक प्रयोग के लिए बेटी-विशिष्ट देरी "डेल्टा" और गणना की गई सेल-चक्र अवधि दिखाई जाती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: रूपांतरण तालिका मिनटों में समय बिंदुओं और शर्त 2 के लिए उनके संबंधित संबंधित जीवन रेखा बिंदुओं के बीच रूपांतरण दिखाती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: सीएलओसीसीएस नवोदित स्थिति 1 और स्थिति 3 के लिए फिट बैठता है। परिणामी सीएलईसीसीएस का स्क्रीनशॉट (ए) कंडीशन 1 आरएनए सेक नवोदित डेटा, (बी) कंडीशन 1 माइक्रोएरे 1 नवोदित डेटा, (सी) कंडीशन 1 माइक्रोएरे 2 नवोदित डेटा, और (डी) कंडीशन 3 नवोदित डेटा के लिए फिट बैठता है। शर्त 2 के लिए फिट सीएलओसीसीएस नवोदित चित्र 3 बी में देखा जा सकता है। 95% विश्वास बैंड और नमूना त्रुटि पट्टियां सीएलओसीसीएस प्रलेखन14,15 और चित्रा 3 में वर्णित हैं। प्रत्येक समय श्रृंखला के लिए प्रत्येक समय बिंदु के लिए, लगभग 200 कोशिकाओं की गणना की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: सीएलओसीसीएस फ्लो साइटोमेट्री स्थिति 1 और स्थिति 2 के लिए फिट बैठता है। फ्लो साइटोमेट्री सीएलओसीसीएस का स्क्रीनशॉट स्थिति 2 (शीर्ष पंक्ति: ए-डी) और स्थिति 1 (नीचे पंक्ति: ई, एफ) के लिए चित्रा 6 सी में दिखाए गए नमूनों के लिए फिट बैठता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: सीएलओसीसीएस मापदंडों में भिन्नता के लिए संरेखण की संवेदनशीलता। क्लॉसीसीएस मापदंडों में (ए-सी) भिन्नताओं का उपयोग करके स्थिति 1 आरएनए-सेक डेटासेट के संरेखण की तुलना सीएलओसीसीएस फिट के विश्वास अंतराल के भीतर और (डी, ई) मापदंडों में बड़ी भिन्नताओं के साथ (डी, ई)। (A) पैरामीटर μ0, (B) पैरामीटर μ, और (C) दोनों पैरामीटर μ0 और o के लिए CLOCCS द्वारा पैरामीटर तालिका में आउटपुट 2.5% और 97.5% आत्मविश्वास मान आउटपुट के साथ औसत मान के बीच तुलना। (डी) μ0 पैरामीटर में बड़े बदलावों की तुलना में μ0 के लिए औसत मान का उपयोग करके संरेखण के बीच तुलना (μ0 का 200% से 0.25%)। (ई) पैरामीटर में बड़े बदलावों की तुलना में ' के लिए औसत मान का उपयोग करके संरेखण के बीच तुलना (200% से 0.25% तक)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: प्रत्येक प्रयोग के लिए डेटा संग्रह का विवरण। प्रत्येक प्रयोग के लिए, यह तालिका नवोदित डेटा, फ्लो साइटोमेट्री डेटा, ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा और सिंक्रनाइज़ेशन विधि का विवरण प्रदान करती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: प्रवाह-साइटोमेट्रिक सीएलओसीएस से सीएलओसीसीएस पैरामीटर चलते हैं। कंडीशन 1 और कंडीशन 2 फ्लो साइटोमेट्री सीएलओसीएस के लिए सीएलओसीसीएस पैरामीटर "एमयू0" और "लैम्ब्डा" चलते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: प्रवाह-साइटोमेट्रिक डेटा को सीएलओसीसीएस इनपुट प्रारूप में परिवर्तित करने के लिए निर्देश। फ्लो-साइटोमेट्रिक डेटा के साथ सीएलओसीसीएस के उपयोग के लिए, एक विशिष्ट इनपुट प्रारूप की आवश्यकता होती है। यह फ़ाइल प्रोटोकॉल चरण 3.4.1 के बारे में अधिक विस्तृत निर्देश प्रदान करती है ताकि यह समझाया जा सके कि इस रूपांतरण को करने के लिए पायथन उपयोगिता फ़ंक्शंस का उपयोग कैसे करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह पेपर कोशिकाओं की सिंक्रनाइज़ आबादी पर समय-श्रृंखला प्रयोगों से डेटा का अधिक सटीक और मात्रात्मक आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। विधि सीएलओसीसीएस से सीखे गए मापदंडों का उपयोग करती है, एक बायेसियन अनुमान मॉडल जो इनपुट सेल-चक्र चरण डेटा का उपयोग करता है, जैसे कि नवोदित डेटा और प्रवाह-साइटोमेट्रिक डीएनए सामग्री डेटा, प्रत्येक प्रयोग14,15 को पैरामीटर करने के लिए। सीएलओसीसीएस प्रत्येक प्रयोग के लिए मापदंडों का अनुमान लगाने के लिए इनपुट सेल-चक्र चरण डेटा का उपयोग करता है, जिसका उपयोग तब एक सामान्य जीवन रेखा पैमाने पर संरेखण के लिए किया जाता है। रिलीज टाइम-सीरीज़ प्रयोगों को एकल जीवन रेखा-संरेखित समय पैमाने पर परिवर्तित करने से प्रयोगों के बीच चरण-विशिष्ट और प्रासंगिक तुलना और कई प्रतिकृति प्रयोगों के एकत्रीकरण की अनुमति मिलती है, जो पहले मुश्किल या असंभव थे।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में डेटा इकट्ठा करना, सीएलओसीसीएस चलाना, डेटासेट को संरेखित करना और डेटासेट में तुलना करना शामिल है। सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए डेटा एकत्र किया जाना चाहिए। डेटा में रुचि के प्रश्न (यानी, ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा, जीन-अभिव्यक्ति डेटा, प्रोटिओमिक डेटा) और सेल चक्र के चरण (यानी, नवोदित डेटा, प्रवाह-साइटोमेट्रिक डीएनए सामग्री डेटा) पर सेल-चक्र चरण डेटा युक्त जानकारी दोनों शामिल होनी चाहिए। फिर, प्रत्येक प्रयोग के लिए पैरामीटर जानकारी इकट्ठा करने के लिए सीएलओसीसीएस में सेल-चक्र चरण डेटा का उपयोग किया जा सकता है। समय बिंदुओं को जीवन रेखा बिंदुओं में बदलने के लिए 0 (पुनर्प्राप्ति चरण लंबाई) और 0 (मदर सेल-चक्र अवधि) μ मापदंडों का उपयोग किया जाता है। लाइफलाइन बिंदु संरेखण संरेखित समय श्रृंखला की सीधे तुलना करने की अनुमति देता है।

विधि की एक सीमा यह है कि उचित संरेखण डेटा के लिए एक अच्छे फिट की पहचान करने पर निर्भर है। सर्वोत्तम सीएलसीसीएस फिट प्राप्त करना सेल-चक्र चरण डेटा की गुणवत्ता और सीएलओसीसीएस में प्रयोग के लिए सही इनपुट सेटिंग्स के उपयोग पर निर्भर करता है। सेल-चक्र चरण डेटा के लिए फिट सीखा मापदंडों की सटीकता निर्धारित करता है और इस प्रकार, संरेखण की सटीकता को बहुत प्रभावित करता है, क्योंकि यह इन मापदंडों के उपयोग पर निर्भर करता है। चूंकि मापदंडों में व्यापक परिवर्तन संरेखण को बहुत प्रभावित करेंगे, इसलिए सीएलओसीसीएस आउटपुट (पूरक चित्रा एस 3) में आपूर्ति किए गए आत्मविश्वास अंतराल के भीतर परिवर्तन न्यूनतम रहते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि मापदंडों में भिन्नता के लिए यह संवेदनशीलता भी है जो अलग-अलग सेल-चक्र समय के साथ डेटासेट के बीच संरेखण की अनुमति देती है।

सीएलओसीसीएस फिट की सटीकता परिणामी सीएलओसीसीएस फिट वक्र और संबंधित त्रुटि सलाखों और त्रुटि बैंड (चित्रा 3 बी, डी, पूरक चित्रा एस 1, और पूरक चित्रा एस 2) का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है। सीएलओसीसीएस फिट टैब मूल डेटा बिंदुओं को दिखाता है, साथ ही सीएलओसीसीएस फिट के आत्मविश्वास अंतराल के अनुरूप आत्मविश्वास बैंड के साथ सीएलसीसीएस फिट वक्र और डेटा के 95% द्विपद अनुपात आत्मविश्वास अंतराल के अनुरूप त्रुटि सलाखों को दिखाता है, क्योंकि गणना को स्वतंत्र द्विपद यादृच्छिक चर14 माना जाता है। उदाहरण के लिए, नवोदित डेटा पर विश्वास पट्टियां किसी दिए गए नमूने के लिए बुड्ड कोशिकाओं के अनुपात में विश्वास को मापती हैं।

सीएलओसीसीएस फिट की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए एक विधि में यह निर्धारित करना शामिल है कि डेटा की त्रुटि पट्टियां सीएलओसीसीएस फिट के आत्मविश्वास अंतराल बैंड के साथ ओवरलैप होती हैं या नहीं। एक और संकेत सीएलओसीसीएस फिट के 95% आत्मविश्वास बैंड की व्यापकता है। सामान्य तौर पर, फिट की बढ़ती अच्छाई के साथ बैंड की चौड़ाई कम हो जाती है। खराब संरेखण का एक संकेत यह है कि यदि मूल डेटा का सेल-चक्र चरण संरेखण से अनुमानित सेल-चक्र चरण से मेल नहीं खाता है। प्रत्येक संरेखण को यह पुष्टि करके डबल-चेक किया जा सकता है कि, प्रत्येक समय बिंदु के लिए, सेल-चक्र चरण सूचना डेटा द्वारा इंगित चरण संरेखण द्वारा सौंपे गए सेल-चक्र चरण के साथ मेल खाता है।

एक खराब सीएलओसीसीएस फिट बैठता है या खराब संरेखण कम गुणवत्ता वाले सेल-चक्र चरण डेटा का परिणाम हो सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले नवोदित डेटा में गिरफ्तारी के तुरंत बाद बहुत कम नवोदित प्रतिशत होगा और पहले शिखर पर बहुत अधिक नवोदित प्रतिशत होगा। बाद की चोटियाँ और गर्त सिंक्रनाइज़ खो देंगे, लेकिन अलग और समान रूप से स्थान होना चाहिए। चूंकि लाइफलाइन बिंदु आबादी के औसत सेल-चक्र चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, इसलिए खराब सिंक्रनाइज़ेशन उचित संरेखण में भी बाधा डाल सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले प्रवाह-साइटोमेट्रिक डीएनए सामग्री डेटा में उपयुक्त सेल-चक्र चरण के अनुरूप प्रत्येक समय बिंदु के लिए अलग-अलग 1 सी और 2 सी चोटियां होंगी। साथ ही, अपर्याप्त सेल-चक्र चरण डेटा पैरामीटर पहचान समस्याओं का परिचय देता है। पर्याप्त डेटा के मामले में, मापदंडों का अनुमान लगाया जा सकता है और सीएलओसीसीएस रन के बीच काफी हद तक नहीं बदलता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल (लैम्ब्डा, डेल्टा, एमयू0) में वर्णित मापदंडों को अलग नहीं किया जा सकता है जब सेल-चक्र चरण डेटा में केवल एक पूर्ण सेल चक्र होता है। बेहतर पैरामीटर अनुमान की अनुमति देने के लिए, सीएलओसीसीएस फिट14,15 के लिए पर्याप्त और अच्छी तरह से निर्मित सेल-चक्र डेटा का उपयोग किया जाना चाहिए। इसके अलावा, सीएलओसीसीएस मॉडल ऑरलैंडो एट अल .15 में वर्णित पूर्व जानकारी का उपयोग करता है, लेकिन इस जानकारी को उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक स्थितियों के अनुरूप बेहतर ढंग से समायोजित किया जा सकता है।

यदि सेल-चक्र चरण डेटा की गुणवत्ता अच्छी है, तो सीएलओसीसीएस सेटिंग्स को फिर से समायोजित करने से अधिक सटीक फिट का उत्पादन करने में मदद मिल सकती है। उदाहरण के लिए, सटीकता में सुधार के लिए चयनित पुनरावृत्तियों की संख्या बढ़ाई जा सकती है। यह पुष्टि करना कि सीएलओसीसीएस में सही सिंक्रनाइज़ेशन विधि का चयन किया गया था, यह भी उपयोगी हो सकता है, क्योंकि अल्फा कारक गिरफ्तारी एलुट्रिएशन की तुलना में कम पुनर्प्राप्ति समय से जुड़ी है।

यह विधि वर्तमान में समर्थित सेल-चक्र चरण डेटा के प्रकारों के संदर्भ में भी सीमित है। हालांकि, सीएलओसीसीएस लचीला है और इसे अन्य प्रकार के डेटा का समर्थन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सीएलओसीसीएस को पहले सेल-चक्र चरण पहचानकर्ताओं के रूप में उपयोग के लिए स्पिंडल पोल बॉडी, मायोसिन रिंग और नाभिक11 के सेल-चक्र फ्लोरोसेंट लेबलिंग का समर्थन करने के लिए अनुकूलित किया गया है। इसके अलावा, एस सेरेविसिया के अलावा अन्य प्रजातियों के साथ सीएलओसीसीएस का उपयोग संभव हो गया है। क्लोसीसीएस एस पोम्बे14 में सेल-चक्र चरण के लिए एक मार्कर के रूप में सेप्टेशन इंडेक्स को स्वीकार करता है, साथ ही प्रवाह-साइटोमेट्रिक डीएनए सामग्री डेटा, जोकई प्रजातियों के लिए आसानी से एकत्र करने योग्य हैं। यह दो पूरी तरह से अलग प्रजातियों के लिए सेल चक्र के एक ही चरण में प्रयोगात्मक डेटा की तुलना की अनुमति देता है और विकास में सेल चक्र में परिवर्तन में अंतर्दृष्टि दे सकता है।

यद्यपि सेल-चक्र चरण डेटा के केवल समर्थित रूपों का उपयोग इस जीवन रेखा संरेखण विधि के साथ किया जा सकता है, यह विधि उपयोग किए गए समय-श्रृंखला प्रयोगात्मक डेटा के प्रकार के लिए अज्ञेयवादी है। इस प्रोटोकॉल में, हमने एक व्यक्तिगत जीन की जीन अभिव्यक्ति को संरेखित करने में इसके उपयोग का प्रदर्शन किया है, साथ ही साथ सैकड़ों जीनों के लिए समय-श्रृंखला ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा भी है। हमने दिखाया है कि इस विधि का उपयोग प्लेटफार्मों में तुलना करने के लिए किया जा सकता है और इस प्रकार, समान परिस्थितियों में लिए गए आरएनए-सेक डेटासेट और माइक्रोएरे डेटासेट के बीच तुलना करें। हमने यह भी दिखाया है कि इस विधि का उपयोग डेटासेट को विभिन्न सिंक्रनाइज़ेशन विधियों के साथ संरेखित करने के लिए किया जा सकता है, जो एक डेटासेट के साथ तुलना करता है जिसे अल्फा फैक्टर अरेस्टेड (कंडीशन 1 आरएनए-सेक) के साथ एलुट्रिएट किया गया था (कंडीशन 1 आरएनए-सेक)। इससे पहले, सीएलओसीसीएस का उपयोग नवोदित सेल-चक्र चरण डेटा22 का उपयोग करके समय-श्रृंखला ट्रांसक्रिप्टोमिक और समय-श्रृंखला प्रोटिओमिक डेटा को संरेखित करने के लिए भी किया गया है, जिसने एमआरएनए गतिशीलता और संबंधित प्रोटीन की गतिशीलता के बीच सीधी तुलना की अनुमति दी है। सीएलओसीसीएस का उपयोग प्रजातियों में समय-श्रृंखला डेटा को संरेखित करने के लिए भी किया गया है, जैसे कि एस सेरेविसिया और एस पोम्बे14 के बीच संरेखण के लिए और एस सेरेविसिया के पहले चक्र और रोगजनक खमीर क्रिप्टोकोकस नियोफॉर्मन्स21 के बीच। अंत में, सीएलओसीसीएस संरेखण वर्तमान में सेल-चक्र समय-श्रृंखला डेटा के लिए विशिष्ट है और अभी तक अन्य प्रकार की लयबद्ध प्रक्रियाओं के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। एक क्षेत्र जहां यह विशेष रुचि का होगा, सर्कैडियन लय के लिए है, जहां सर्कैडियन समय (सीटी) का उपयोग पारंपरिक रूप से प्रयोगों को संरेखित करने के लिए किया जाता है, हालांकि इसका कार्यान्वयन लगातार लागू नहीं होता है। रुचि का एक अन्य क्षेत्र विकास ता्मक लय की जांच के लिए है, जैसे कि मलेरिया परजीवी। उदाहरण के लिए, विभिन्न अवधियों के साथ प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम उपभेदों का संरेखण, जैसा कि स्मिथ एट अल .25 में वर्णित है, उपभेदों में अधिक विस्तृत तुलना की अनुमति देगा। तुलना के लिए इन आवधिक प्रक्रियाओं का संरेखण इन महत्वपूर्ण लयबद्ध जैविक कार्यों की बेहतर समझ के लिए अनुमति देगा। इस प्रकार की सेल-चक्र तुलना इस प्रोटोकॉल में वर्णित जीवन रेखा संरेखण के लिए सीएलओसीसीएस का उपयोग करके संभव हो गई है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एस कैम्पियोन और एस हासे को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (डीएमएस -1839288) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (5आर01जीएम126555) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अतिरिक्त, लेखक पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए और प्रोटोकॉल के बीटा परीक्षण के लिए हुआरुई झोउ (ड्यूक विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम जावा कोड के साथ उनकी मदद के लिए फ्रांसिस मोट्टा (फ्लोरिडा अटलांटिक विश्वविद्यालय) और जोशुआ रॉबिन्सन को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x PBS For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde For Fixative Solution.
100% Ethanol For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer For flow cytometry protocol.
Git https://git-scm.com/
Java 19 https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope For counting cells and buds.
Miniconda https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris pH 7.5

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References

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Campione, S. A., Kelliher, C. M., Orlando, D. A., Tran, T. Q., Haase, S. B. Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons. J. Vis. Exp. (196), e65466, doi:10.3791/65466 (2023).

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