Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Justering av synkroniserte tidsseriedata ved bruk av karakteriserende tap av cellesyklussynkronimodell for sammenligninger på tvers av eksperimenter

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65466
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

Summary

En utfordring med å analysere synkroniserte tidsserieeksperimenter er at eksperimentene ofte varierer i lengden på utvinning fra synkroni og cellesyklusperioden. Dermed kan målingene fra forskjellige eksperimenter ikke analyseres samlet eller lett sammenlignes. Her beskriver vi en metode for å justere eksperimenter for å muliggjøre fasespesifikke sammenligninger.

Abstract

Undersøkelse av cellesyklusen avhenger ofte av å synkronisere cellepopulasjoner for å måle ulike parametere i en tidsserie når cellene krysser cellesyklusen. Men selv under lignende forhold viser replikasjonseksperimenter forskjeller i tiden som kreves for å gjenopprette fra synkroni og å krysse cellesyklusen, og forhindrer dermed direkte sammenligninger på hvert tidspunkt. Problemet med å sammenligne dynamiske målinger på tvers av eksperimenter forverres i mutante populasjoner eller i alternative vekstbetingelser som påvirker synkron gjenopprettingstid og / eller cellesyklusperioden.

Vi har tidligere publisert en parametrisk matematisk modell kalt Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) som overvåker hvordan synkrone populasjoner av celler frigjøres fra synkronisering og fremgang gjennom cellesyklusen. De lærte parametrene fra modellen kan deretter brukes til å konvertere eksperimentelle tidspunkter fra synkroniserte tidsserieeksperimenter til en normalisert tidsskala (livslinjepunkter). I stedet for å representere forløpt tid i minutter fra starten av eksperimentet, representerer livslinjeskalaen progresjonen fra synkroni til cellesyklusoppføring og deretter gjennom fasene i cellesyklusen. Siden livslinjepunkter tilsvarer fasen til gjennomsnittscellen i den synkroniserte populasjonen, tillater denne normaliserte tidsskalaen direkte sammenligninger mellom eksperimenter, inkludert de med varierende perioder og gjenopprettingstider. Videre har modellen blitt brukt til å justere cellesykluseksperimenter mellom forskjellige arter (f.eks. Saccharomyces cerevisiae og Schizosaccharomyces pombe), og dermed muliggjøre direkte sammenligning av cellesyklusmålinger, som kan avsløre evolusjonære likheter og forskjeller.

Introduction

Tidsseriemålinger gjort på synkroniserte populasjoner av celler når de går gjennom cellesyklusen er en standardmetode for å undersøke mekanismene som styrer cellesyklusprogresjon 1,2,3,4,5,6,7,8 . Evnen til å gjøre sammenligninger på tvers av synkrone / utgivelsestidsserieeksperimenter er avgjørende for vår forståelse av disse dynamiske prosessene. Bruk av replikerte eksperimenter for å bekrefte funn kan øke tilliten til reproduserbarheten av konklusjonene. Videre kan sammenligninger mellom miljøforhold, på tvers av mutanter, og til og med mellom arter avdekke mange nye innsikter i cellesyklusregulering. Imidlertid svekker intereksperimentell variabilitet i utvinningen fra synkronisering og i hastigheten på cellesyklusprogresjon evnen til å gjøre tidspunkt-til-tidspunkt-sammenligninger på tvers av replikater eller mellom eksperimenter med endret cellesyklustiming. På grunn av disse utfordringene er replikater ofte ikke inkludert for hele tidsserien (f.eks. Spellman et al.4). Når replikater for hele tidsserien samles inn, kan ikke dataene analyseres samlet, men i stedet brukes en enkelt replikat til analyse, og andre replikater blir ofte henvist til tilleggstall (f.eks. Orlando et al.8). Videre er sammenligninger mellom eksperimenter med forskjellige restitusjons- eller cellesyklusprogresjonsegenskaper vanskelige. Målingene av mindre intervaller mellom en hendelse av interesse og et landemerke for cellesyklus (f.eks. knoppvekst, S-faseinngang eller anafasestart) kan bidra til å redusere feil hvis disse landemerkehendelsene spores 1,2,3,9,10,11,12. Imidlertid kan subtile, men viktige forskjeller forbli uoppdaget eller skjult ved hjelp av disse ad hoc-metodene. Endelig tillater enkeltcelleanalyser å analysere cellesyklusprogresjon uten å stole på synkronisering eller justering13, selv om storskala målinger i enkeltcellestudier kan være utfordrende og kostbare.

For å overvinne disse vanskelighetene utviklet vi modellen Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) for å hjelpe analysen av tidsseriemålinger gjort på synkroniserte populasjoner14,15. CLOCCS er en fleksibel matematisk modell som beskriver fordelingen av synkroniserte celler over cellesyklusfaser når de frigjøres fra synkronisering og går gjennom cellesyklusen. Forgreningsprosessrammen gjør det mulig for modellen å redegjøre for de asymmetriske egenskapene til mor- og datterceller etter deling, som observert i S. cerevisiae, samtidig som den fortsatt er nyttig for organismer som deler seg ved fisjon, som S. pombe. Modellen kan ta innganger fra et mangfoldig sett med måletyper for å spesifisere cellesyklusfasen. Det kan innta spirende cellesyklusfasedata, som inkluderer målinger av prosentandelen budded celler over tid, noe som muliggjør estimering av antall celler utenfor den unbudded G1 fase14,15. Modellen kan også innta flowcytometriske data som måler DNA-innholdet, og dermed muliggjøre vurdering av landemerkeoverganger fra G1 til S, S til G2 og M til G115. Fluorescerende morfologiske markører kan også brukes til å identifisere cellesyklusfasen. Den fluorescerende merkingen av myosinringer, kjerner og spindelpollegemer (SPB) kan brukes til å bestemme cellesyklusfasen, og disse ble innlemmet i CLOCCS-modellen11; Disse målingene vil imidlertid ikke bli beskrevet i denne protokollen. I tillegg ble septasjonsindeksen brukt som input for modellering av data fra S. pombe14. Dermed kan modellen brukes til cellesyklusanalyser i en rekke organismer og kan utvides ytterligere.

CLOCCS er en parametrisk modell som muliggjør full bayesiansk slutning av flere parametere fra inngangsdataene (f.eks. spirende prosentandel, DNA-innhold). Disse parametrene inkluderer gjenopprettingstiden fra synkronisering, lengden på cellesyklusperioden (estimert separat for mor- og datterceller) og den gjennomsnittlige cellesyklusposisjonen til cellene på hvert tidspunkt. Disse parametrene representerer oppførselen til gjennomsnittscellen i befolkningen, slik at forskeren kan kartlegge hvert tidspunkt til en cellesyklusposisjon uttrykt som et livslinjepunkt. Konverteringen til livslinjepunkter avhenger av CLOCCS-parametrene lambda (λ) og mu0 (μ0)14,15. Parameteren λ tilsvarer den gjennomsnittlige cellesyklusperioden til modercellene. På grunn av mor-datter-forsinkelsen14,15 er dette imidlertid ikke den gjennomsnittlige cellesyklusperioden for hele befolkningen som inkluderer både mor- og dattercellene. CLOCCS utleder i tillegg parameteren delta (δ), som tilsvarer mor-datter-forsinkelsen og dermed tillater beregning av gjennomsnittlig cellesyklusperiode for hele befolkningen. Til slutt, fordi hvert eksperiment begynner etter frigjøring fra cellesyklussynkronisering, representeres tiden det tar å gjenopprette fra synkroniseringsmetoden av CLOCCS-parameteren μ0. CLOCCS tilpasser en modell til inngangscellesyklusfasedataene og utleder deretter disse parametrene ved hjelp av en tilfeldig Markov-kjede Monte Carlo-algoritme14,15. Ved å kartlegge flere eksperimenter til en felles tidsskala for cellesyklus, kan direkte fasespesifikke sammenligninger gjøres mellom replikater eller eksperimenter der gjenopprettingstiden eller cellesyklusperiodene ikke er identiske 8,14,15.

Ettersom synkroniserte populasjoner mister synkroni i noen hastighet i løpet av tidsserien14,15,16,17, kan variabilitet i frekvensen av synkront tap også hindre kvantitative sammenligninger på tvers av eksperimenter. Ved å identifisere plasseringen av populasjoner og variansen i deres fordelinger, står CLOCCS for forskjeller i frekvenser av synkront tap. Dette kraftige verktøyet muliggjør spesifikke og detaljerte sammenligninger på tvers av eksperimenter, og gir dermed muligheten til direkte å gjøre relevante sammenligninger, ikke bare mellom replikater, men også mellom miljøforhold, mutanter og til og med arter som har dramatisk forskjellig cellesyklustid14,15.

Denne artikkelen beskriver en metode som bruker CLOCCS til å estimere parametere ved å tilpasse data fra synkrone / frigjøre tidsserieeksperimenter, kartlegge dataene til en felles livslinjeskala og deretter gjøre relevante sammenligninger mellom replikater eller eksperimenter. Livslinjejustering muliggjør direkte fasespesifikke sammenligninger på tvers av disse eksperimentene, noe som gjør det mulig å aggregere og sammenligne replikater og for å gjøre mer relevante sammenligninger på tvers av eksperimenter med forskjellige gjenopprettingstidspunkter og cellesyklusperioder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Innsamling av cellesyklusfase og eksperimentelle data

  1. Synkroniser cellene med hensyn til cellesyklusen ved hjelp av ønsket synkroniseringsmetode (f.eks. sentrifugal eluering som beskrevet i Leman et al.18 eller parring feromonarrest som beskrevet i Rosebrock 19; både Leman et al.18 og Rosebrock19 inkluderer også metoder for frigjøring fra synkroni). Begynn prøvetaking gjennom tidsserien, slik at tidsserien er minst to hele cellesyklusperioder lange, og optimalt sett samle minst 10 prøver per cellesyklus. På hvert tidspunkt samler du en prøve for cellesyklusfasedata (spirende eller flowcytometri) og en prøve for eksperimentelle data, som beskrevet nedenfor.
  2. Hvis du bruker spirende data som cellesyklusfasedata, samler du inn data om spirende for CLOCCS-justeringen.
    1. Utvalg gjennom hele tidsserien. For hvert tidspunkt, samle celler, og fikser dem ved å blande 200 μL sonikert cellekultur med 200 μL fiksativ løsning, som beskrevet i Leman et al.18.
    2. For standard spirende, telle minst 200 celler per tidspunkt ved hjelp av et overført lysmikroskop med et 40x objektiv og et hemocytometer. Legg celleprøven fra trinn 1.2.1 til hemocytometeret, og fortynn hvis tettheten forhindrer telling. Registrer antall budded og unbudded celler på hvert tidspunkt. Beregn prosentandelen av spirede celler, og tegn for hvert tidspunkt i en spirende kurve.
      MERK: Andre metoder for å spesifisere cellesyklusfaseinformasjonen er tilgjengelige, men disse er ikke beskrevet i denne protokollen. De andre metodene er beskrevet i CLOCCS readme og i et tidligere arbeid11.
  3. Hvis du bruker flow-cytometriske DNA-innholdsdata som cellesyklusfasedata, samles flowcytometri DNA-fargedata for flow-cytometrisk CLOCCS-justering.
    1. Utvalg gjennom hele tidsserien. For hvert tidspunkt samler du celler og fikser dem som beskrevet i Haase og Reed20.
    2. Flekk DNA, og analyser ved hjelp av standard flowcytometrisk analyse. En anbefalt fargeprotokoll for S. cerevisiae er beskrevet i Haase og Reed20.
  4. Samle tilknyttede omics eller relaterte eksperimentelle data. For standard transkriptomiske data, samle som beskrevet i Leman et al.18 og Kelliher et al.21,22. Kontroller at dataene er knyttet til tidspunkter som inneholder cellesyklusfasedata, slik at det er mulig å justere nedstrøms. For optimal justering, sørg for at hvert tidspunkt som inneholder eksperimentelle data, også har fasedata knyttet til seg.
    MERK: De eksperimentelle dataene kan ha mange former. Tradisjonelt bruker vi justeringsmetoden beskrevet for å justere tidsserietranskriptomiske eksperimenter. Imidlertid kan alle typer data knyttet til tidspunkter justeres (dvs. proteomikk22).

2. Installere nødvendig programvare

MERK: Denne delen forutsetter at Conda, Java 19 og Git allerede er installert (Materialfortegnelse).

  1. Last ned CLOCCS_alignment repo ved å skrive inn følgende kommando i terminalen:
    git klone git klone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. Opprett et Conda-miljø ved hjelp av conda_req.yml-filen ved å skrive inn følgende kommando i terminalen i mappen der det CLOCCS_alignment repositoriet ble klonet:
    conda env create -f conda_req.yml

3. Bruke CLOCCS til å parametrisere eksperimentene

  1. Dobbeltklikk på cloccs_v2023.jar filen i CLOCCS-mappen i CLOCCS_alignment-repositoriet, og vent til et grafisk brukergrensesnitt åpnes. Dette skjermbildet gir mulighet for å legge inn alternativer for CLOCCS-kjøringen og viser resultatene når de er kjørt.
  2. Skriv inn de generelle innstillingene.
    1. Angi Sim Anneal, Burn In og gjentakelser ved å skrive i de tilknyttede tekstinntastingsboksene. Sim Anneal (simulert annealing) identifiserer gode startparameterverdier, Burn In søker etter bakre moduser, og den siste fasen gjør det mulig å trekke alle bakre slutninger. Høyere verdier øker kjøretiden, men øker også nøyaktigheten.
    2. Skriv inn eksperimentelle forhold ved å spesifisere temperaturen i Celsius og synkroniseringsmetoden ved hjelp av tekstboksen merket Temperatur og rullegardinmenyen Synchro. Metode, henholdsvis.
    3. Du kan eventuelt konfigurere de avanserte innstillingene i menyen Avanserte innstillinger. De avanserte innstillingene gjør det mulig å angi prioriteter for hver av parametrene ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      MERK: Du finner mer informasjon om de avanserte innstillingene i readme.txt i CLOCCS-mappen i CLOCCS_alignment-repositoriet.
  3. Skriv inn innstillingene for bruk med spirende data.
    1. Velg riktig valg fra rullegardinmenyen Modelltype . Standardalternativet Bud er for standard spirende informasjon for spirende gjær.
      MERK: Andre mer avanserte alternativer finnes også i rullegardinmenyen: Mutant for spirende informasjon for mutanter som gjennomgår flere spirende sykluser uten deling, BudSSLSMR for spirende informasjon og ytterligere informasjon om spindelpolkropp og myosinring, og BudNucDivNeck for spirende informasjon og ytterligere informasjon om deling og knopphalskjerner. Disse avanserte alternativene er beskrevet i CLOCCS readme og i tidligere arbeid11,14,15.
    2. Importer dataene ved hjelp av Dataimport-panelet ved å skrive i tekstboksene eller ved å laste opp en fil ved å klikke Velg fil-knappen . Den første kolonnen angir tidspunktene. De resterende to kolonnene angir spirende data og kan ta et av følgende alternativer: antall ikke-buddede celler (ingen knopp), antall buddede celler (Budd) eller totalt antall celler (Totalt).
  4. Skriv inn innstillingene for bruk med flowcytometriske data. Kjør enten trinn 3.3 eller trinn 3.4 for hvert eksperiment.
    MERK: Flowcytometriske data og spirende data kan brukes sammen. Selv om vi tidligere beskrev å kjøre dem sammen15, for dette verktøyet, må de kjøres uavhengig og deretter sammenlignes.
    1. Konverter .fcs-filene til riktig CLOCCS-inndataformat for flowcytometri ved å følge instruksjonene i tilleggsfil 1 (finnes også i CLOCCS_alignment repo som CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
    2. Velg Flow-valget fra rullegardinmenyen Modelltype .
    3. Importer dataene ved hjelp av Dataimport-panelet. Klikk på Velg fil, og velg filen som ble generert i trinn 3.4.1.
    4. Velg tidspunktene som en flowcytometrisk CLOCCS-tilpasning skal tegnes for, ved å velge tidspunktene i boksen Ganger for tilpasning .
  5. Når alle inngangene er valgt for enten spirende eller flowcytometri, klikker du på Bruk-knappen , og klikker deretter på Prøve-knappen øverst på skjermen.
  6. Vis den spirende kurven eller plottene for flowcytometri med de forutsagte tilpasningene ved å velge fanen Predikerte treff . Denne kategorien åpnes som standard umiddelbart etter forrige trinn.
  7. Vis parameterhistogrammene for hver parameter ved å velge kategorien Parameterhistogrammer og deretter velge underfanen som tilsvarer parameteren av interesse fra følgende alternativer: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end osv.
  8. Vis plottet for posterior poengsum ved å velge Posterior Score-fanen .
  9. Se innstillingene, og endre dem ytterligere ved å velge kategorien Innstillinger ; vis loggen over tidligere kjøringer ved å velge kategorien Logg .
  10. Hent CLOCCS-parameterne fra tilpasningen ved å velge kategorien Posterior Parameters . Den resulterende tabellen vil ha følgende form: hver rad består av en parameter, med den endelige raden som bakre. Kolonnene består av den predikerte parameteren for gjennomsnittet, 2,5 % lavere konfidensintervall, 97,5 % øvre konfidensintervall og godkjenningsraten.
    1. Registrer parametrene som brukes til justering for hvert eksperiment: gjenopprettingstiden fra synkronisering (μ0) og gjennomsnittlig cellesyklusperiode for modercellene (λ).
    2. Beregn cellesyklusperioden ved å beregne gjennomsnittet av morcelleperioden (λ) og dattercelleperioden (λ + δ), hvor δ er den datterspesifikke forsinkelsen.
      MERK: Gjenta seksjon 3 med alle eksperimentene som skal inkluderes i sammenligningene.

4. Konvertering av tidspunkter til livslinjepunkter ved hjelp av Python-konverteringsfunksjonene og CLOCCS-parametrene

Konvertering mellom tidspunkter og livslinjepunkter krever to konverteringsformler21. En Python-implementering for konvertering og datavisualisering er tilgjengelig i CLOCCS_alignment repo og beskrevet nedenfor.

  1. Aktiver Conda-miljøet ved å skrive inn følgende kommando i terminalen: conda activate CLOCCS_alignment
  2. Åpne en interaktiv Python-notatbok ved å skrive inn følgende kommando i terminalen: jupyter notebook
  3. Opprett en ny Python-notatbok i ønsket mappe.
    MERK: Et eksempel på en notatblokk er inkludert for å demonstrere standard bruk og finnes i Alignment/JOVE_example.ipynb i CLOCCS_ justeringsrepositoriet.
  4. Importer Python-filen som inneholder justeringsfunksjonene, ved å kjøre følgende kommando i den første cellen:
    %kjør path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities.py
    1. Bytt ut banen til det CLOCCS_alignment repositoriet med path_to_repo.
  5. Hvis du bruker spirende data som fasedata i cellesyklusen, importerer du en dataramme som inneholder prosentandelen budded på hvert tidspunkt, ved å kjøre følgende kommando i en ny celle:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Bytt ut riktig filbane og filnavn. Hvis filen er en .csv fil, fjerner du sep ="\t"
  6. Hvis du bruker spirende data som cellesyklusfasedata, justerer du de spirende dataene til en tidsskala for livslinjepunkt ved å skrive inn følgende funksjon i en ny celle:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, tidspunkter, param_mu0, param_lambda)
    1. For tidspunkter erstatter du en liste over tidspunktene som skal være indeksen for den budding_df datarammen.
    2. For param_mu0 og param_lambda erstatter du eksperimentet med de innlærte parametrene fra den spirende CLOCCS-kjøringen i del 3.
  7. Hvis du bruker flowcytometridata, importerer du flowcytometridataene ved å kjøre følgende kommando i en ny celle:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. For flow_input_folder erstatter du den aktuelle banen til mappen som inneholder flowcytometri-.fcs-filene.
  8. Hvis du bruker flowcytometridata, genererer du en konverteringstabell mellom tidspunktene og livslinjepunktene for hvert eksperiment ved å skrive inn følgende kommando i en ny celle:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(tidspunkter, param_mu0, param_lambda)
    1. For tidspunkter erstatter du en liste over tidspunktene fra flowcytometridataene.
    2. For param_mu0 og param_lambda erstatter du eksperimentet de innlærte parametrene fra flowcytometrien CLOCCS kjører i avsnitt 3.
  9. Importer datarammen som inneholder eksperimentelle data, til notatblokken ved å kjøre følgende kommando i en ny celle:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Bytt ut riktig filbane og filnavn. Hvis filen er en .csv fil, fjerner du sep ="\t".
      MERK: Dette kan gjøres for alle tabelldata. De eksperimentelle dataene må ganske enkelt ha tidspunktene som enten kolonnene eller indeksen til datarammen. Du finner eksempeldata i CLOCCS_alignment-repositoriet.
  10. Juster de eksperimentelle dataene til en tidsskala for et livslinjepunkt ved å skrive inn følgende funksjon i en ny celle:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, tidspunkter, param_mu0, param_lambda, interpolere, lowerll, upperll)
    1. For tidspunkter erstatter du en liste over tidspunktene som indeks eller kolonnene i den eksperimentelle data_df fra forrige trinn.
    2. For param_mu0 og param_lambda erstatter du verdiene i avsnitt 3 fra CLOCCS.
      MERK: Parametrene kan komme fra alle CLOCCS-kjøringer som utføres på hvilken som helst av de aksepterte cellesyklusfasedatatypene.
    3. Hvis du vil, kan du erstatte interpolere med True eller False, eller la feltet stå tomt (standarden er False).
      MERK: Når den er satt til False, blir ikke dataene interpolert. Når satt til True, avrundes livslinjepunktene og interpoleres for å fylle ut verdiene mellom livslinjepunktene, slik at det er et punkt per heltall i området for livslinjepunktene. Dette muliggjør bedre sammenligning på tvers av datasett.
    4. Du kan eventuelt erstatte lowerll og upperll med None eller heltallsverdier.
      MERK: Når satt til Ingen, beholdes alle livslinjepunktene etter interpolering. Når heltall angis, avkortes dataene slik at livslinjepunktene går fra nedre til øvre ll. Dette gjør det mulig å sammenligne på tvers av datasett med en annen nedre eller øvre del.
  11. Last ned datasettet med livslinjejustering ved å skrive inn følgende kommando i en ny celle: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. Gjenta trinn 4.5-4.11 med alle eksperimentene som skal inkluderes i sammenligningene.

5. Sammenligning av spirende kurver og flowcytometridata

  1. Tegn de spirende kurvene før justering ved hjelp av Python-verktøyfunksjonen ved å skrive inn følgende kommando i en ny celle:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, title = str_title)
    1. Erstatt en liste som inneholder datarammene til alle de ønskede spirende kurvene for plotting for list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
    2. Bytt ut en liste over etikettene for forklaringen-[Eksperiment 1, Eksperiment 2, Mutant] for leg_list hvis ønskelig. Hvis ikke, ekskluder eller erstatt Ingen.
    3. Erstatningstid for str_type.
    4. Bytt ut en strengtittel Sammenligning Spirende kurver med str_title om ønskelig. Hvis ikke, erstatt Ingen, eller ekskluder.
  2. Tegn de spirende kurvene etter justering ved hjelp av Python-verktøyfunksjonen ved å følge instruksjonene i trinn 5.1, men med en liste over justerte spirende kurver erstattet med list_of_budding_curves og med livslinje for point_type i stedet for tid.
  3. For å plotte flowcytometridataene, plott de tilknyttede dataene fra .fcs-filene på de tilsvarende livslinjepunktene ved hjelp av omformeren generert i trinn 4.8.
  4. Konverter livslinjepunktene til cellesyklusfasen ved hjelp av konverteringstabellen (tabell 1).
    MERK: Dette kan også tegnes ved å følge instruksjonene i trinn 5.1, men med fase for point_type i stedet for tid.

6. Sammenligning av eksperimentelle data

  1. Bestem genlisten som skal plottes i linjegrafene basert på litteraturinformasjon eller genene av interesse for forskningen.
  2. Bruk den medfølgende plot_linegraph_comparison i Python-verktøyfilen til å utføre linjegrafsammenligninger på den opprinnelige, justerte eller justerte og interpolerte datarammen ved å skrive inn følgende kommando i en ny celle:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, point_type = str_type, tittel = str_title)
    1. Bytt ut en liste over datarammene for eksperimentene som skal sammenlignes for list_of_dfs.
      MERK: Datarammene kan være ujustert eller justert. Tilsvarende point_type må imidlertid legges inn i trinn 6.2.4.
    2. Erstatt en liste over titlene for hver dataramme i samme rekkefølge som listen over datarammer for list_for_legend.
    3. Bytt ut en liste over gennavnene (som må inkluderes i indeksen til datarammene) som skal plottes for genelist.
    4. Erstatt punkttypen med str_type. Bruk livslinje (standard er livslinjepunktskala) eller fase (livslinjeskalaen for cellesyklusfase) for de justerte datarammene i trinn 6.2.1 eller tid for de ikke-justerte datarammene i trinn 6.2.1.
    5. Bytt ut en valgfri strengtittel med str_title.
  3. Bestem genlisten som skal inkluderes i varmekartet ved hjelp av litteraturen eller algoritmer for å bestemme de øverste periodiske gener.
    MERK: For riktig varmekartsammenligning bør dataene justeres, interpoleres og tidsskalajusteres i trinn 6.2; Den bør ha samme start- og sluttlivslinjeverdi for hvert eksperiment.
    1. Kjør periodisitetsalgoritmer for å bestemme de øverste periodiske genene23,24, eller bruk de ønskede alternative metodene for å bestemme genlisten (dvs. litteraturresultater).
    2. Importer en .csv- eller TSV-genlistefil til notatblokken ved hjelp av følgende kommando i en ny celle:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. Bytt ut riktig filbane og filnavn. Hvis filen er en .csv fil, fjerner du sep="\t".
  4. Bruk den angitte funksjonen plot_heatmap_comparison i Python-verktøyfilen til å utføre en varmekartsammenligning på den justerte, interpolerte og fasejusterte datarammen ved å skrive inn følgende kommando i en ny celle:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, tittel = str_title)
    1. Erstatt en liste over de justerte datarammene for eksperimentene som skal sammenlignes for list_of_dfs.
    2. Erstatt en liste over titlene for hver dataramme i samme rekkefølge som listen over datarammer for list_for_legend.
    3. Bytt ut en liste over gennavnene (som må inkluderes i indeksen til datarammene) som skal plottes for genelist.
    4. Bytt ut en valgfri strengtittel med str_title.
      MERK: Den første datarammen i listen er den som skal brukes til å bestille genene i varmekartet. Genene vil bli sortert etter maksimum i den første perioden for den datarammen, og den samme rekkefølgen vil bli brukt for de påfølgende datarammene i listen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Trinnene beskrevet i protokollen ovenfor og i arbeidsflyten i figur 1 ble brukt på fem cellesyklussynkroniserte tidsserieeksperimenter for å demonstrere to representative sammenligninger: mellom replikater med forskjellige synkroniseringsmetoder (parring feromon og sentrifugal eluering18) og sekvenseringsplattformer (RNA-sekvensering [RNA-seq] og mikromatrise), samt på tvers av eksperimentelle forhold. Flere eksperimenter ble utført med S. cerevisiae, og cellesyklusfase og eksperimentelle data ble samlet for hvert eksperiment. Arbeidsflyten innebærer å bruke CLOCCS til å parametrisere de forskjellige tidsserieeksperimentene for synkronisering/frigivelse, bruke disse parameterne til å justere eksperimentene til en felles sammenlignbar livslinjeskala, og deretter bruke disse justerte eksperimentene for de to representative sammenligningene.

For å demonstrere den representative sammenligningen på tvers av replikater, valgte vi tre eksperimenter utført med samme stamme og i de samme eksperimentelle forholdene, kalt tilstand 1. To av disse eksperimentene var direkte replikasjoner av hverandre, og begge ble analysert via mikroarrayanalyse og synkronisert via sentrifugal eluering. Det tredje eksperimentet ble analysert ved hjelp av RNA-seq-analyse og synkronisert via alfafaktorparring feromonarrest. For å demonstrere den andre sammenligningen på tvers av eksperimenter med varierende cellesyklusperioder, ble Tilstand 1 RNA-seq-eksperimentet (cellesyklusperiode: 71 min) ovenfra sammenlignet med Tilstand 2 (cellesyklusperiode: 82 min) og Tilstand 3 (cellesyklusperiode: 110 min) (tabell 2). For hvert eksperiment ble cellene dyrket under sine respektive forhold, synkronisert, frigjort og deretter samplet gjennom to eller flere cellesyklusperioder. Spirende og/eller flowcytometridata ble samlet inn for å gi informasjon om cellesyklusfasen, og enten mikroarray eller RNA-seq tidsserie transkriptomiske data ble samlet inn som beskrevet i Leman et al.18 (tilleggstabell S1).

For hvert eksperiment tok dataene formene beskrevet i figur 2, som presenterer Tilstand 2-eksperimentet som et eksempel på demonstrasjon. Hvert datasett hadde en spirende kurve, som tillot slutningen av cellesyklusfasen. Denne kurven besto av en spirende prosentverdi for hvert tidspunkt i tidsserien, som deretter ble plottet for å produsere en spirende kurve som viste flere cellesyklussvingninger (figur 2). Cellesyklusfasedataene tok også form av flow-cytometrisk DNA-innhold som farget data for hvert tidspunkt i tidsserien. Utvalgte tidspunkter for vilkår 2 ble plottet inn (figur 2). Flowcytometrifilene ble kombinert i en enkelt tabell bestående av cellene i hver log fluorescensbeholder for hvert tidspunkt for inntasting i CLOCCS ved hjelp av flow_cytometry_CLOCCS_file_from_fcs-funksjonen i Python-verktøyene. Hvert datasett inneholdt også eksperimentelle data. I dette tilfellet var dataene transkriptomiske data, og dataene ble organisert i rader av gener, hver med en verdi for overflod av RNA på hvert tidspunkt i forsøket (figur 2).

Vi har demonstrert bruken av CLOCCS og konverteringen til livslinjepunkter for Tilstand 2 RNA-seq-datasettet; Prosessen var imidlertid identisk for de andre eksperimentene også. Den spirende informasjonen ble lagt inn i CLOCCS-algoritmen som beskrevet i protokollseksjon 3 og som vist i figur 3A. Standardverdiene for Sim Anneal, Burn In, Iterations og Advanced Settings ble brukt. De passende eksperimentelle forholdene ble valgt. Modelltypen "Bud" ble brukt til de spirende dataene. De resulterende CLOCCS-spirende passformene ble sett på for å sikre at de spirende kurvene passet riktig, som demonstrert av datapunktene som overlappet den tilsvarende tilpasningskurven med et lite 95 % konfidensbånd (figur 3B og tilleggsfigur S1). Parametreneμ 0 og λ fra tabellen over bakre parametere (figur 3C) ble registrert for bruk i justeringen. Flowcytometridata for tilstand 2 ble lagt separat inn i CLOCCS, som beskrevet i protokollavsnitt 3. For øyeblikket forventer CLOCCS at strømningscytometre vil produsere 10 bit data med 1,024 kanaler; Imidlertid kan moderne strømningscytometre ha flere kanaler. Siden vårt flowcytometer produserer data med mer enn 1024 kanaler, ble dataene binned i 1024 binger. Med flowcytometri-cellesyklusfasedata produserer CLOCCS en CLOCCS-tilpasning for hvert valgte tidspunkt (figur 3D og tilleggsfigur S2) og leverer en posterior parametertabell som ligner på den spirende posterior parametertabellen i figur 3C. Parametrene for spiring som CLOCCS kjører for hvert av de andre eksperimentene er beskrevet i tabell 2, og parametrene for flowcytometrien som CLOCCS kjører er beskrevet i tilleggstabell S2.

CLOCCS-parametrene som tilsvarer cellesyklusperioden til modercellene (λ) og restitusjonstiden (μ0) ble brukt for livslinjejusteringen. Det er viktig å merke seg at λ ikke nødvendigvis representerer den gjennomsnittlige cellesyklusperioden for cellepopulasjonen. I tilfeller der cellene gjennomgår en full deling, er det like mange mor- og datterceller, så den gjennomsnittlige cellesyklusperioden er gjennomsnittet mellom cellesyklusperioden til modercellene (λ) og cellesyklusperioden til dattercellene (λ + δ); Spesielt er delta (δ) lengden på den datterspesifikke forsinkelsen. Dette er beregningen vi brukte for cellesyklusperioden for hvert eksperiment (tabell 2). For hvert eksperiment ble de tilsvarende parametrene λ og μ0 deretter brukt i konverteringsfunksjonen, df_conversion_from_parameters, levert i Python-verktøyfilen, som demonstrert for betingelse 2 (figur 4A). For de spirende kurvene ble dataene ikke interpolert. For eksperimentelle data ble imidlertid de livslinjejusterte datasettene omsamplet ved hjelp av interpolering slik at hvert livslinjepunkt inneholdt interpolerte data for forbedret plotting. For å sikre at de livslinjejusterte datasettene hadde samme område med livslinjepunkter, ble nedre og øvre livslinjegrenser angitt for å avkorte dataene på disse punktene. Disse nedre og øvre parameterne ble lagt inn i df_conversion_from_parameters funksjonen når interpolasjonen ble satt til True. For Tilstand 1-sammenligningen ble de satt til henholdsvis 44 og 270 for alle datasettene, og for sammenligningen på tvers av miljøforhold ble de satt til henholdsvis 50 og 300. Et eksempel på bruk av disse funksjonene for justering og sammenligning kan sees i eksempelet Python notebook JOVE_example.ipynb, og koden som brukes til å generere figurene, kan sees i JOVE_Figures.ipynb-notatboken i CLOCCS_alignment repositoriet.

Denne konverteringen fra tidspunkter til livslinjepunkter avhenger av to formler21 (figur 4A) som bruker μ0 (restitusjonstid) og λ (morperiode). Den første formelen, , Equation 1er formelen for gjenopprettingsfasen (figur 4A). Denne formelen brukes bare for tidspunkter i restitusjonsfasen, som består av tidspunktene til og medμ 0, siden μ0 tilsvarer restitusjonstiden. Tidspunktene konverteres deretter til et livslinjeskalaområde som slutter med 100 livslinjepunkter (tabell 1), som markerer slutten på gjenopprettingsfasen og begynnelsen på den første cellesyklusen. Fasen etter gjenoppretting bruker den andre formelen Equation 2 (figur 4A), som konverterer hvert påfølgende tidspunkt etter gjenoppretting til et livslinjepunkt etter 100. Hver påfølgende 100 livslinjepunkter tilsvarer en ny cellesyklus, der den første syklusen tilsvarer livslinjepunktene 100 til 200, den andre syklusen tilsvarer livslinjepunktene 200 til 300, og så videre (tabell 1). Konverteringen fra tidspunkter til livslinjepunkter brukes på hvert datasett individuelt ved hjelp av de tilsvarende CLOCCS-parameterne for datasettet. Etter at hvert datasett er konvertert til livslinjeskalaen, justeres cellesyklusfasene, noe som muliggjør fasespesifikke sammenligninger på tvers av datasett.

Tabell 3 viser konverteringen av utvalgte tidspunkter til de respektive livslinjepunktene for den representative konverteringen av Betingelse 2-datasettet ved hjelp av parametere fra den spirende CLOCCS-kjøringen. De spirende dataene samlet inn fra RNA-seq i tilstand 2 ble plottet i en spirende kurve som viser prosentandelen budded over tid for både den ujusterte tidsskalaen i minutter (figur 4B) og den justerte tidsskalaen i livslinjepunkter (figur 4C) ved hjelp av Python-funksjonen plot_budding_curves i en Python-notatbok. Livslinjepunktene kunne enkelt konverteres til eksperimentell og cellesyklusfaseinformasjon (tabell 1), og gjenopprettingsfasen og første til tredje cellesykluser ble fargekodet for hånd tilsvarende (figur 4B, C). Siden hvert livslinjepunkt korresponderte med en cellesyklusfase, kunne individuelle flowcytometriplott merkes via Python-funksjonene ved hjelp av cellesyklusfasen bestemt av livslinjejusteringen. Disse fasene stemte overens med fasene bestemt via flow-cytometrisk analyse for tilstand 2. Flowcytometridataene som ble samlet inn for Tilstand 2-datasettet, ble plottet for utvalgte tidspunkter og merket ved hjelp av cellesyklusfasen bestemt ut fra flowcytometri-livslinjejusteringen. I hvert tilfelle samsvarte dataene med fasen bestemt av justeringen (figur 4D).

Det er viktig å merke seg at uttrykksnivået for hvert gen for hver prøve forblir det samme, men merkingen av tidspunktene endres fra tid til minutt til livslinjepunkter. Konverteringen er imidlertid ikke lineær. Restitusjonsfasen, uthevet i grått, opptar en høyere prosentandel av eksperimentell tid når konverteringen til livslinjepunkter er utført (figur 4B,C). Fordelen med livslinjeskalaen er at den gir mulighet for detaljert faseinformasjon og fasesammenligninger på tvers av eksperimenter. Faseinformasjonen finnes i livslinjepunktene, som beskrevet ovenfor og vist i tabell 1. Videre finnes G1 i de første 15,5 livslinjepunktene i hver cellesyklus, S i de neste 20 livslinjepunktene og G2/M i de neste 64,5 livslinjepunktene (tabell 1). Dette begrenser imidlertid gjenopprettingstiden kunstig til samme tidsrom for hver påfølgende cellesyklus, selv om gjenopprettingsfasen virker svært kort i den opprinnelige tidsperioden. Dette skjuler ikke sammenligningene, fordi fasene i hvert eksperiment er justert. I de fleste tilfeller er det mer relevant å sammenligne dataene på punkter som forekommer i samme eksperimentelle og biologiske fase i stedet for på tidspunkter som forekommer samtidig i minutter.

Når alle eksperimentene er konvertert til den justerte livslinjeskalaen ved hjelp av de medfølgende Python-funksjonene i Python-verktøyfilen, kan de sammenlignes. Her demonstrerer vi to vanlige sammenligninger mellom eksperimenter: en mellom replikater av et lignende eksperiment på tvers av plattformer og synkroniseringsmetoder (figur 5) og en mellom forskjellige eksperimentelle forhold med en endret periodelengde (figur 6 og figur 7). Som beskrevet ovenfor er den første sammenligningen på tvers av to eluerte mikroarray-replikater og ett alfafaktorsynkronisert RNA-seq-eksperiment. Før justering viste de to mikroarray-replikatene lignende synkroniserings- og cellesyklusdynamikk, men Tilstand 1 Microarray 2-replikaten virket litt forsinket (figur 5A). Den mest slående forskjellen ble funnet når man sammenlignet de ujusterte datasettene; Tilstand 1 RNA-seq andre syklus syntes å være på linje med den første syklusen av de to mikroarray-eksperimentene. Forskjellen var sannsynligvis ikke relatert til de forskjellige transkriptomiske plattformene, men heller de forskjellige synkroniseringsmetodene. Cellepopulasjonene i mikroarray-forsøkene ble synkronisert ved sentrifugal eluriering, mens populasjonen for RNA-seq-eksperimentet ble synkronisert ved en parringsferomonbehandling. Synkronisering med parringsferomon reduserte faktisk restitusjonstiden betydelig sammenlignet med eluering (figur 5A og tabell 2).

Til tross for de åpenbare forskjellene mellom replikater når de ble plottet i form av forløpt tid, etter livslinjejusteringen, var kurvene nesten identiske, og mer detaljerte og relevante sammenligninger på tvers av replikater ble gjort mulig (figur 5B). Gjenopprettingsfasen ble justert slik at hvert eksperiment begynte på samme livslinjepunkt, og variasjonene i periode ble normalisert ved livslinjejustering. På grunn av justeringen oppstod eksperimentelle verdier på samme livslinjepunkt på tvers av replikater i samme cellesyklusfase, og muliggjorde dermed beregninger av eksperimentell varians på tvers av replikater. Gjenopprettings- og cellesyklusfasene er merket i figur 5B for å gi ytterligere informasjon om cellesyklusfaser i hvert av eksperimentene. Denne livslinjejusteringen kan deretter brukes på det eksperimentelle datasettet (figur 5C, D) ved hjelp av Python-funksjonen df_conversion_from_parameters gitt i verktøyfilen, som beskrevet ovenfor.

I figur 5D ble de transkriptomiske dataene justert, og ekspresjonsdynamikken for CDC20-genet ble plottet ved hjelp av plot_linegraph_comparison Python-funksjonen i en Python-notatbok. Før justering virket det som om det første topputtrykket av mikroarray-eksperimentene var på linje med den andre toppen av RNA-seq-eksperimentet (figur 5C); Etter justering ble imidlertid de første cellesyklustoppene i hvert datasett riktig justert (figur 5D). Videre syntes toppbredden av forsøkene å variere mellom RNA-seq-datasettet og mikroarray-datasettene, men etter justering var toppbredden mer justert (figur 5C, D).

Den andre sammenligningen er mellom eksperimenter i forskjellige miljøforhold med forskjellige cellesyklusperioder (figur 6). Som beskrevet ovenfor, sammenlignet vi her S. cerevisiae-datasett i tilstand 1 med tilstand 2 og tilstand 3, som tilsvarer cellesyklusperioder på henholdsvis 71, 82 og 110 minutter. Disse forskjellene i cellesyklusperioden introduserte usikkerhet ved sammenligning på tvers av eksperimenter før cellesyklusfasejustering, som vist i de ujusterte spirende kurvene. Periodeforskjellene er synlige i de ujusterte spirende kurvene (figur 6A). Men da de var CLOCCS justert ved hjelp av denne protokollen, så de tre kurvene bemerkelsesverdig like ut, og dermed gjorde sammenligninger av eksperimentelle data mulig (figur 6B).

Ved hjelp av flowcytometri CLOCCS-parametrene ble tilstand 1 og tilstand 2 justert til en felles livslinjeskala, og histogrammer for DNA-innhold ble plottet i tilstand 2 og ved ekvivalente livslinjepunkter i tilstand 1. Flowcytometriske målinger av DNA-innhold over livslinjepunkter ble sammenlignet (figur 6C). Siden DNA-innholdsmålingene ikke var kontinuerlige og ikke lett interpolerte, kunne vi bare sammenligne de nærmeste livslinjepunktene. Cellesyklusfasedataene for hvert sammenlignbare livslinjepunkt var ikke identiske mellom de to tilstandene (figur 6C), noe som indikerer at CLOCCS-tilpasningene og resulterende parametere sannsynligvis var litt feiljustert for tilstand 1. Dette skyldtes sannsynligvis dårligere CLOCCS-tilpasning til flowcytometriske data for tilstand 1 sammenlignet med tilstand 2 (tilleggsfigur 2). Justeringen avvek imidlertid bare i ett utvalg, og gir dermed fortsatt mulighet for forbedrede fasespesifikke sammenligninger.

Den spirende livslinjejusteringen ble deretter brukt på eksperimentelle data for RNA-seq-eksperimentene i tilstand 1, tilstand 2 og tilstand 3 (figur 7) ved å bruke de spirende CLOCCS-parametrene i df_conversion_from_parameters-funksjonen på eksperimentelle data. De transkriptomiske dataene ble justert, og genuttrykket av genet CDC20 for hver tidsserie ble vist for de tre eksperimentene. Før justering var transkripsjonsdynamikken til CDC20 ikke-overlappende (figur 7A). Etter justeringen var den første og andre toppen av CDC20-genuttrykket mye nærmere justert for alle tre datasettene. Etter justering ble det klart at toppene skjedde i samme cellesyklusfase, men formene på kurvene var forskjellige (figur 7B). Tilstand 3 hadde en lavere og bredere første topp sammenlignet med de to andre tilstandene, selv etter å ha tatt hensyn til forskjellene i cellesyklusperioden, noe som tyder på at disse forskjellene sannsynligvis var relatert til de eksperimentelle forholdene som ble testet (figur 7B).

Storskala transkriptomiske sammenligninger kan også gjøres. For disse sammenligningene ble 278 gener valgt ved å kjøre periodisitetsalgoritmen JTK_CYCLE23 på hvert datasett og ta skjæringspunktet mellom de øverste periodiske gener. Imidlertid kan gener velges ved hjelp av hvilken som helst ønsket metode eller fra litteraturen. Disse genene ble plottet i samme rekkefølge for alle tre tilstandene både for de ujusterte (figur 7C) og de justerte (figur 7D) varmekartene ved hjelp av plot_heatmap_comparison Python-funksjonen i en Python-notatbok. Disse varmekartene gjør det mulig å gjøre hundrevis av sammenligninger på gennivå samtidig. Sammenligninger på tvers av ujusterte eksperimenter kan gjøres angående endringen i kurvedynamikk, topptiden i forhold til nabogener, og periodelengden, etc. (figur 7C). Detaljerte fasespesifikke sammenligninger kunne imidlertid ikke gjøres fordi tidspunktene ikke nødvendigvis korrelerer med samme cellesyklusfase på tvers av forhold. Selv om de andre syklusene så like ut etter justering, ble de første syklusene litt forskjøvet mellom forholdene (figur 7D). Dette skiftet kan gjenspeile det faktum at den spirende cellesyklusfaseinformasjonen var av lavere kvalitet for tilstand 3. Ikke desto mindre tillot justeringen av forsøkene for de tre forholdene en forbedret fasespesifikk sammenligning. Før justering var det uklart om den første ekspresjonstoppen i hver tilstand ville oppstå i samme cellesyklusfase (figur 7C); Men etter justering kunne eksperimentene sammenlignes på en fasespesifikk måte (figur 7D). Før justering virket toppene i tilstand 3 mye bredere enn i de to andre tilstandene (figur 7C); Etter justering ble det imidlertid klart at toppene i tilstand 3 hadde samme bredde som de andre forholdene når de ble justert (figur 7D).

Disse representative resultatene demonstrerer prosessen for bruk av CLOCCS for å justere eksperimenter til en felles tidsskala. Før justering korrelerer ofte ikke direkte tidspunktsammenligninger med en lignende cellesyklusfase. Konverteringen av den forløpne eksperimentelle tiden i minutter til livslinjepunkter som representerer cellesyklusfasen, muliggjør fasespesifikke og biologisk relevante sammenligninger mellom eksperimenter på samme punkt i cellesyklusen.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over arbeidsflyten for CLOCCS-justering av livslinje. Den eksperimentelle arbeidsflyten for justering av to eksempeldatasett ved hjelp av CLOCCS, etterfulgt av representative sammenligninger mellom datasettene. De viktigste trinnene fra protokollen er illustrert: innsamling av ujustert cellesyklusfase og eksperimentelle data for hvert av datasettene (trinn 1), bruk av CLOCCS for parametrisering av hvert datasett (trinn 2 og trinn 3), justering av datasettene til en felles livslinje (trinn 4), og til slutt sammenligningen av cellesyklusfasen og eksperimentell dynamikk (trinn 5 og trinn 6). De ikke-justerte cellesyklusfasedataene legges inn i CLOCCS for å gi lærte parametere, som deretter brukes til justering til en felles livslinjeskala. Disse justerte datasettene sammenlignes deretter. Forkortelse: CLOCCS = Karakteriserer tap av cellesyklussynkroni. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Format for cellesyklusfasen og eksperimentelle data som kreves for arbeidsflyten. Dataene som kreves for arbeidsflyten består av to hovedkomponenter: cellesyklusfasedata og eksperimentelle data for cellesyklus. Cellesyklusfasedataene kan bestå av cellesyklusspirende data eller flow-cytometriske DNA-innholdsdata for hvert tidspunkt i tidsserien. De eksperimentelle dataene kan ta mange former, men i dette tilfellet er transkriptomiske data, som består av genuttrykksdata for hvert gen for hvert tidspunkt i tidsserien. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på resultater fra kjøring av CLOCCS på et S. cerevisiae cellesyklusdatasett. (A) Et skjermbilde av det grafiske brukergrensesnittet i CLOCCS med inndataverdiene og innstillingene som følger med for spirende data i tilstand 2. Tidene, antall ubudded celler og antall budded celler er lagt inn, samt modelltype, iterasjoner og forhold, etc. (B) Et skjermbilde av den resulterende CLOCCS-spirende passformen for tilstand 2 under fanen "Predicted Fit" i resultatene. Hvert datapunkt har en tilknyttet utvalgsfeillinje som tilsvarer 95 % binomisk proporsjon konfidensintervall for dataene (for hvert tidspunkt ble minst 200 celler talt [mellom 204 og 295 celler]). Den resulterende spirende tilpasningskurven viser konfidensbåndet for 95 % konfidensintervall for CLOCCS-tilpasningen i lilla. (C) Et skjermbilde av den resulterende "Posterior Parameters"-tabellen for den spirende CLOCCS-kjøringen i tilstand 2 som består av CLOCCS-parametrene ved gjennomsnittet, 2,5 % konfidensintervall og 97,5 % konfidensintervall. Bakre og akseptrater vises også. (D) Et skjermbilde av flowcytometrien CLOCCS passer for tilstand 2 ved 70 min og 150 min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Eksempel på konverteringsprosessen fra tidspunkter til justerte livslinjepunkter for Betingelse 2-datasettet. (A) Konverteringsformlene som brukes til å konvertere fra tidspunkter til livslinjepunkter. Et skjermbilde av Python-funksjonene i Python-notatboken for konvertering og plotting av spirende kurver. (B) Den ujusterte spirende kurven for betingelse 2 som viser den spirende prosenten for hvert tidspunkt i minutter. Cellesyklus- og restitusjonsfasene er uthevet som følger: restitusjon (grå), første cellesyklus (blå), andre cellesyklus (magenta) og tredje cellesyklus (laks). (C) Den spirende kurven for justert betingelse 2 som viser de samme spirende prosentandelene, men plottet på den livslinjejusterte skalaen. Cellesyklus- og gjenopprettingsfasene er uthevet som i panel C. (D) De justerte flowcytometriplottene for utvalgte tidspunkter fra tilstand 2 som tilsvarer distinkte cellesyklusfaser basert på livslinjeskalaen: begynnelsen av G1, begynnelsen av S-fasen, begynnelsen av G2/M og sen G2/M. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater for sammenligning av de justerte og ikke-justerte replikasjonseksperimentene i tilstand 1. Sammenligning av betingelse 1 replikerer: Betingelse 1 RNA-seq (blå), Betingelse 1 mikromatrise 1 (lilla) og Tilstand 1 mikromatrise 2 (grå). (A) Den ujusterte spirende kurven for Betingelse 1-datasettene. (B) Den justerte spirende kurven for Betingelse 1-datasettene. Livslinjepunktene er konvertert til cellesyklusfasen og er fargekodet under x-aksen. (C) Det ujusterte genuttrykket til et representativt gen, CDC20, for tilstand 1-datasettene. (D) Det justerte genuttrykket til et representativt gen, CDC20, for tilstand 1-datasettene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representative resultater for sammenligning av justerte og ujusterte cellesyklusfasedata på tvers av eksperimenter med varierende perioder. Sammenligning av cellesyklusfasedata for datasett med tre forskjellige miljøforhold og dermed tre forskjellige cellesyklusperioder: Tilstand 1 RNA-seq (cellesyklusperiode: 71 min), Tilstand 2 RNA-seq (cellesyklusperiode: 82 min) og Tilstand 3 RNA-seq (cellesyklusperiode: 110 min). (A) Den ujusterte spirende kurven for datasettene. (B) Den justerte spirende kurven for datasettene. (C) Histogrammene for flowcytometrisk DNA-innhold for tilstand 2 (øverste rad) sammenlignet med de tilsvarende livslinjepunktene i betingelse 1 (nederste rad). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representative resultater for sammenligning av justerte og ikke-justerte transkriptomiske data på tvers av eksperimenter med varierende perioder. Sammenligning av transkriptomiske data assosiert med datasettene i figur 6: Tilstand 1 RNA-seq, tilstand 2 og tilstand 3. (A) Det ujusterte genuttrykket til et representativt gen, CDC20, for datasettene Tilstand 1, Tilstand 2 og Tilstand 3 RNA-seq. (B) Det justerte genuttrykket av CDC20 for datasettene. (C) Det ujusterte varmekartet for de øverste cellesyklusperiodiske genene i samme rekkefølge for hvert datasett. (D) De livslinjejusterte varmekartene for de samme periodiske genene fra cellesyklus fra panel C i samme rekkefølge. De stiplede lilla linjene tilsvarer livslinjepunktene 100 og 200. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Livslinjepunkt til cellesyklusfasekonvertering. Konverteringsnøkkelen mellom livslinjepunktskalaen og den tilsvarende fasen i eksperimentet. Lifeline-punktene 0-100 tilsvarer restitusjon fra synkroni. Hvert påfølgende 100 livslinjepunkter tilsvarer en ny cellesyklus, der de første 15,5 livslinjepunktene tilsvarer G1, de neste 20 tilsvarer S-fasen, og de gjenværende livslinjepunktene tilsvarer G2/M. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Spirende CLOCCS-parametere. De resulterende spirende CLOCCS-parametrene "lambda" og "mu0" for hvert eksperiment fra de representative resultatene. I tillegg vises den datterspesifikke forsinkelsen "Delta" og den beregnede cellesyklusperioden for hvert eksperiment. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Konverteringstabell som viser konverteringen mellom tidspunktene i minutter og de respektive tilsvarende livslinjepunktene for vilkår 2. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfigur S1: CLOCCS-spirende passer for tilstand 1 og tilstand 3. Skjermbilde av den resulterende CLOCCS-spirende tilpasningen for (A) spirende data for tilstand 1 RNA seq, (B) spirende data for tilstand 1 mikromatrise 1, (C) spirende data for tilstand 1 mikromatrise 2 og for (D) spirende data for tilstand 3. CLOCCS-spirende passform for tilstand 2 kan sees i figur 3B. 95 % konfidensbånd og sampling error bars er som beskrevet i CLOCCS-dokumentasjonen14,15 og i figur 3. For hvert tidspunkt for hver tidsserie ble ca. 200 celler talt opp. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S2: CLOCCS flowcytometri passer for tilstand 1 og tilstand 2. Skjermbilde av flowcytometrien CLOCCS passer for prøvene vist i figur 6C for tilstand 2 (øverste rad: A-D) og betingelse 1 (nederste rad: E,F). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S3: Følsomheten til justeringen for variasjoner i CLOCCS-parametrene. Sammenligning av justeringen av RNA-Seq-datasettet Tilstand 1 ved bruk av (A-C) variasjoner i CLOCCS-parametrene λ og μ0 innenfor konfidensintervallet til CLOCCS-tilpasningen og (D,E) med store variasjoner i parametrene. Sammenligning mellom gjennomsnittsverdien med 2,5 % og 97,5 % konfidensverdier i parametertabellen av CLOCCS for (A) parameteren μ0, (B) parameteren λ og (C) for begge parameterne μ0 og λ. (D) Sammenligning mellom justeringen ved hjelp av middelverdien for μ0 sammenlignet med store variasjoner i μ0-parameteren (200 % til 0,25 % av μ0). (E) Sammenligning mellom justeringen ved hjelp av middelverdien for λ sammenlignet med store variasjoner i λ-parameteren (200 % til 0,25 % av λ). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S1: Beskrivelse av datainnsamlingen for hvert eksperiment. For hvert eksperiment gir denne tabellen en beskrivelse av spirende data, flowcytometridata, transkriptomiske data og synkroniseringsmetode. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S2: CLOCCS-parametere fra de flowcytometriske CLOCCS-løpene. CLOCCS-parametrene "mu0" og "lambda" for flowcytometrien CLOCCS i tilstand 1 og tilstand 2 kjører. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Instruksjoner for konvertering av flow-cytometriske data til CLOCCS inndataformat. For bruk av CLOCCS med flow-cytometriske data kreves et spesifikt inputformat. Denne filen gir mer detaljerte instruksjoner angående protokolltrinn 3.4.1 for å forklare hvordan du bruker Python-verktøyfunksjonene til å utføre denne konverteringen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen presenterer en metode for mer nøyaktig og kvantitativt å vurdere data fra tidsserieeksperimenter på synkroniserte populasjoner av celler. Metoden benytter lærte parametere fra CLOCCS, en bayesiansk inferensmodell som bruker inngangscellesyklusfasedata, for eksempel spirende data og flow-cytometriske DNA-innholdsdata, for å parameterisere hvert eksperiment14,15. CLOCCS bruker inndatacellesyklusfasedataene til å utlede parametrene for hvert eksperiment, som deretter brukes til justering til en felles livslinjeskala. Konvertering av flere synkrone / utgivelsestidsserieeksperimenter til en enkelt livslinjejustert tidsskala muliggjør fasespesifikke og relevante sammenligninger mellom eksperimenter og aggregering av flere replikateksperimenter, som tidligere var vanskelige eller umulige.

De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer å samle inn dataene, kjøre CLOCCS, justere datasettene og sammenligne på tvers av datasettene. Først må data samles inn for bruk i denne protokollen. Dataene må bestå av både eksperimentelle data som inneholder informasjon om spørsmålet om interesse (dvs. transkriptomiske data, genuttrykksdata, proteomiske data) - og cellesyklusfasedata som inneholder informasjon om fasen av cellesyklusen (dvs. spirende data, flow-cytometriske DNA-innholdsdata). Deretter kan cellesyklusfasedataene brukes i CLOCCS for å samle parameterinformasjonen for hvert eksperiment. Parametrene μ0 (gjenopprettingsfaselengde) og λ (modercellesyklusperiode) brukes til å konvertere tidspunktene til livslinjepunkter. Linjepunktjusteringen gjør det mulig å sammenligne de justerte tidsseriene direkte.

En begrensning ved metoden er at riktig justering er avhengig av å identifisere en god tilpasning til dataene. Å oppnå den beste CLOCCS-tilpasningen avhenger av kvaliteten på cellesyklusfasedataene og bruken av de riktige inngangsinnstillingene for eksperimentet i CLOCCS. Tilpasningen til cellesyklusfasedataene bestemmer nøyaktigheten av de lærte parametrene og påvirker dermed nøyaktigheten av justeringen, fordi den avhenger av bruken av disse parametrene. Siden store endringer i parametrene i stor grad vil påvirke justeringen, forblir endringene minimale innenfor konfidensintervallet som ble oppgitt i CLOCCS-utgangen (tilleggsfigur S3). Det er viktig å merke seg at denne følsomheten for variasjoner i parametrene også er det som muliggjør justering mellom datasett med varierende cellesyklustiming.

Nøyaktigheten til CLOCCS-tilpasningen kan bestemmes ved hjelp av den resulterende CLOCCS-tilpasningskurven og de tilsvarende feilfeltene og feilbåndene (figur 3B, D, tilleggsfigur S1 og tilleggsfigur S2). Tilpassingsfanen CLOCCS viser de opprinnelige datapunktene, samt CLOCCS-tilpasningskurven med konfidensbåndet som tilsvarer konfidensintervallet for CLOCCS-tilpasningen og feilfeltene som tilsvarer 95 % binomisk proporsjon konfidensintervall for dataene, siden tellingene antas å være uavhengige binomiske tilfeldige variabler14. Konfidensstolpene på de spirende dataene måler for eksempel konfidensen i andelen buddede celler for en gitt prøve.

En metode for å bestemme kvaliteten på CLOCCS-tilpasningen innebærer å avgjøre om feilfeltene i dataene overlapper med konfidensintervallbåndet til CLOCCS-tilpasningen. En annen indikasjon er bredden på 95% konfidensbåndet til CLOCCS-passformen. Generelt reduseres bredden på båndet med økt godhet av passform. En indikasjon på dårlig justering er hvis cellesyklusfasen til de opprinnelige dataene ikke samsvarer med cellesyklusfasen som er avledet fra justeringen. Hver justering kan dobbeltsjekkes ved å bekrefte at for hvert tidspunkt samsvarer fasen indikert av cellesyklusfaseinformasjonsdataene med cellesyklusfasen som er tildelt av justeringen.

En dårlig CLOCCS-tilpasning eller dårlig justering kan være et resultat av cellesyklusfasedata av lav kvalitet. Spirende data av høy kvalitet vil ha en svært lav spirende prosentandel umiddelbart etter arrestasjon og en veldig høy spirende prosentandel ved første topp. De påfølgende toppene og bunnene vil miste synkroni, men bør være tydelige og jevnt fordelt. Siden livslinjepunktene representerer den gjennomsnittlige cellesyklusfasen i populasjonen, kan dårlig synkronisering også hindre riktig justering. Data av høy kvalitet flow-cytometrisk DNA-innhold vil ha distinkte 1C- og 2C-topper for hvert tidspunkt som tilsvarer den aktuelle cellesyklusfasen. I tillegg introduserer utilstrekkelige cellesyklusfasedata problemer med parameteridentifiserbarhet. Dersom det foreligger tilstrekkelige data, kan parametrene utledes og endres ikke vesentlig mellom CLOCCS-kjøringer. Parametrene beskrevet i denne protokollen (lambda, delta, mu0) kan imidlertid ikke løsnes når cellesyklusfasedataene bare inneholder en full cellesyklus. For å muliggjøre forbedret parameterestimering, bør tilstrekkelige og godt konstruerte cellesyklusdata brukes for CLOCCS passer14,15. Videre bruker CLOCCS-modellen tidligere informasjon som beskrevet i Orlando et al.15, men denne informasjonen kan justeres for å passe bedre til de eksperimentelle forholdene som brukes.

Hvis kvaliteten på cellesyklusfasedataene er god, kan justering av CLOCCS-innstillingene bidra til å produsere en mer nøyaktig passform. Antall iterasjoner som velges, kan for eksempel økes for å forbedre nøyaktigheten. Det kan også være nyttig å bekrefte at riktig synkroniseringsmetode ble valgt i CLOCCS, siden alfafaktorarrest er assosiert med kortere restitusjonstid sammenlignet med eluering.

Denne metoden er også begrenset når det gjelder hvilke typer cellesyklusfasedata som for øyeblikket støttes. CLOCCS er imidlertid fleksibel og kan tilpasses for å støtte andre typer data. For eksempel har CLOCCS tidligere blitt tilpasset for å støtte cellesyklusfluorescerende merking av spindelpollegemer, myosinringer og kjerner11 for bruk som cellesyklusfaseidentifikatorer. Videre har bruk av CLOCCS med andre arter enn S. cerevisiae blitt muliggjort. CLOCCS aksepterer septasjonsindekser som markør for cellesyklusfasen i S. pombe14, samt flow-cytometriske DNA-innholdsdata, som lett kan samles inn for mange arter15. Dette gjør det mulig å sammenligne eksperimentelle data i samme fase av cellesyklusen for to helt forskjellige arter og kan gi innsikt i endringer i cellesyklusen gjennom evolusjonen.

Selv om bare støttede former for cellesyklusfasedata kan brukes med denne livslinjejusteringsmetoden, er denne metoden agnostisk til typen tidsserieeksperimentelle data som brukes. I denne protokollen har vi demonstrert bruken av den ved å justere genuttrykket til et individuelt gen, samt tidsserietranskriptomiske data for hundrevis av gener i tandem. Vi har vist at denne metoden kan brukes til å sammenligne på tvers av plattformer og dermed gjøre sammenligninger mellom RNA-seq datasett og microarray datasett tatt under lignende forhold. Vi har også vist at denne metoden kan brukes til å justere datasett med forskjellige synkroniseringsmetoder ved å sammenligne mellom et datasett som ble eluert (Condition 1 Microarray) med et datasett som var alfafaktorarrestert (Condition 1 RNA-seq). Tidligere har CLOCCS også blitt brukt til å justere tidsserietranskriptomiske og tidsserieproteomiske data ved hjelp av spirende cellesyklusfasedata22, noe som tillot direkte sammenligninger mellom mRNA-dynamikken og dynamikken til det tilsvarende proteinet. CLOCCS har også blitt brukt til å justere tidsseriedata på tvers av arter, for eksempel for justering mellom S. cerevisiae og S. pombe14 og mellom den første syklusen av S. cerevisiae og den patogene gjæren Cryptococcus neoformans21. Endelig er CLOCCS-justering for tiden spesifikk for cellesyklustidsseriedata og har ennå ikke blitt tilpasset for bruk med andre typer rytmiske prosesser. Et område hvor dette vil være av spesiell interesse er for sirkadiske rytmer, hvor sirkadisk tid (CT) konvensjonelt brukes til å justere eksperimenter, selv om implementeringen ikke brukes konsekvent. Et annet område av interesse er for å undersøke utviklingsrytmer, som for eksempel malariaparasitten. For eksempel vil justeringen av Plasmodium falciparum-stammer med forskjellige perioder, som beskrevet i Smith et al.25, tillate mer detaljerte sammenligninger på tvers av stammer. Justeringen av disse periodiske prosessene for sammenligning vil gi en bedre forståelse av disse viktige rytmiske biologiske funksjonene. Disse typene cellesyklussammenligninger er gjort mulig ved å bruke CLOCCS for livslinjejustering, som beskrevet i denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

S. Campione og S. Haase ble støttet av finansiering fra National Science Foundation (DMS-1839288) og National Institutes of Health (5R01GM126555). I tillegg vil forfatterne takke Huarui Zhou (Duke University) for kommentarer til manuskriptet og for betatesting av protokollen. Vi takker også Francis Motta (Florida Atlantic University) og Joshua Robinson for deres hjelp med Java-koden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x PBS For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde For Fixative Solution.
100% Ethanol For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer For flow cytometry protocol.
Git https://git-scm.com/
Java 19 https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope For counting cells and buds.
Miniconda https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris pH 7.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 196 justering tidsserier transkriptomikk synkronisering cellesyklus flowcytometri modeller programvare
Justering av synkroniserte tidsseriedata ved bruk av karakteriserende tap av cellesyklussynkronimodell for sammenligninger på tvers av eksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campione, S. A., Kelliher, C. M.,… More

Campione, S. A., Kelliher, C. M., Orlando, D. A., Tran, T. Q., Haase, S. B. Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons. J. Vis. Exp. (196), e65466, doi:10.3791/65466 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter