Summary
在这里，我们讨论了一种工作流程，用于准备、解剖、安装和成像来自黑 腹果蝇 第三龄幼虫的活外植体大脑，以观察生理条件下的细胞和亚细胞动力学。
Abstract
果蝇 神经干细胞（神经母细胞，以下简称NBs）经历不对称分裂，再生自我更新的神经母细胞，同时还形成分化神经节母细胞（GMC），该母细胞将经历一次额外的分裂以产生两个神经元或神经胶质细胞。NBs的研究揭示了细胞极性，纺锤体取向，神经干细胞自我更新和分化的分子机制。这些不对称的细胞分裂很容易通过活细胞成像 观察到 ，使幼虫NB非常适合研究活组织中不对称细胞分裂的时空动力学。当在营养补充培养基中正确解剖和成像时，外植体大脑中的NBs强烈分裂12-20小时。前面描述的方法在技术上是困难的，对于那些刚进入该领域的人来说可能具有挑战性。在这里，描述了使用脂肪体补充剂制备、解剖、安装和成像活的三龄幼虫脑外植体的方案。还讨论了潜在的问题，并提供了如何使用这种技术的示例。
Introduction
不对称细胞分裂 （ACD） 是亚细胞成分（如 RNA、蛋白质和细胞器）在子细胞之间分配不均等的过程 1,2。这个过程在干细胞中很常见，干细胞经历ACD以产生具有不同发育命运的子细胞。果蝇NBs不对称地分裂以产生一个NB，保留其干性，以及一个神经节母细胞（GMC）。GMC经历进一步的分裂以产生分化的神经元或神经胶质细胞3。不对称分裂的NBs在三龄幼虫的发育大脑中很丰富，通过显微镜很容易观察到。在第三龄幼虫阶段，每个中枢脑叶中大约有100个NBs3,4,5,6。
不对称细胞分裂是一个高度动态的过程。活细胞成像方案已被用于测量和量化细胞极性7,8,9,10，纺锤体取向11,12,13，肌动肌蛋白皮层14,15,16,17,18，微管和中心体生物学19,20的动力学，21,22,23,24,25,26,27和膜10,28和染色质动力学29。ACD的定性和定量描述依赖于可靠的方法和协议来成像完整活体大脑中的NBs分割。以下协议概述了使用两种不同的安装方法制备，解剖和成像用于体内活细胞成像的第三龄幼虫大脑的方法。这些方法最适合对干细胞分裂以及其他脑细胞分裂的时空动力学感兴趣的研究人员，因为它们允许对细胞事件进行短期和长期观察。此外，这些技术对于该领域的新手来说很容易获得。我们证明了这种方法在表达荧光标记的微管和皮质融合蛋白的幼虫脑中的有效性和适应性。我们还讨论了分析方法和在其他研究中应用的注意事项。
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Protocol
注意： 图1 显示了进行本研究所需的材料。
1. 实验的注意事项和准备
- 防止幼虫过度拥挤。
注意：外植体幼虫大脑的质量与解剖前幼虫的健康和质量直接相关。因过度拥挤而营养不良的幼虫通常会产生质量较低的大脑30。- 确保每个餐盖培养皿的幼虫不超过20-30只，以避免营养不良。这些示例如图 2 所示。
- 使用前过滤并等分施耐德培养基。
- 对于每次解剖，通过用1%牛生长血清（BGS）补充等分的施耐德昆虫培养基来制备新鲜的成像和解剖培养基。5 mL 的解剖和成像介质体积通常足以进行成像实验。
- 使用前将补充的培养基加热至室温 （RT）。
- 考虑要收集的短片的长度，并用它来考虑成像介质的补充、安装方法和显微镜的采集设置。
注意：在最佳条件下，仅补充BGS的大脑中的NB将强有力地分裂3小时以上。- 通过在成像介质中添加幼虫脂肪体组织来补充成像培养基，以支持在进行需要更长电影的实验时超过4小时的分裂。
注意：脂肪体分泌支持NB增殖的有丝分裂原31，来自10个幼虫的整个脂肪体足以支持4到5个大脑。此外，用膜结合载玻片成像的样品已被证明分裂超过10小时13,32，而用多孔载玻片成像的样品通常分裂的频率较低（未发表的观察结果）。 - 或者，为较长的电影实现更复杂的成像介质，如前所述33.通过调整曝光时间、激光功率和采样频率来最大程度地减少光损伤，以获得最佳效果。
- 通过在成像介质中添加幼虫脂肪体组织来补充成像培养基，以支持在进行需要更长电影的实验时超过4小时的分裂。
2. 幼虫分期和收集（图2）
- 将1-5日龄的雌性处女苍蝇与1-7日龄的成年雄性苍蝇杂交，以产生具有所需基因型的后代。为了获得最佳产量，将 10-15 个女性处女与 5-10 个男性杂交。将这些苍蝇放入带有餐盖的苍蝇笼中（图2A-C），并在25°C下孵育。
- 每天交换餐盖。这可以防止餐盖被幼虫过度拥挤，从而降低解剖大脑的质量。
- 如果餐盖被幼虫明显覆盖（即>30），请将该餐盖分成两半，并用同样切成两半的新鲜餐盖代替一半。或者，更频繁地交换餐盖（即每 12 小时而不是每 24 小时）。餐帽过多的示例如图2E，F所示。
- 将餐盖与幼虫在25°C孵育，直到幼虫达到所需年龄。
3.幼虫脂肪体解剖（图3）
注意：本协议描述了使用3孔解剖皿的解剖。
- 将 ~400 μL 解剖和成像培养基移液到 3 孔解剖皿的每个孔中。
- 用解剖钳轻轻握住十只 72-96 小时龄喂养良好的野生型幼虫，并将它们浸入和浸出最底部孔中的解剖溶液，直到所有食物颗粒都被洗掉。冲洗后，将干净的幼虫移到中间孔中。
- 使用一组镊子，用嘴钩握住幼虫。用另一组镊子，破坏幼虫角质层的一侧。
- 这种破裂会导致脂肪体从幼虫中溢出。脂肪体是灰白色和半透明的，将具有格子状结构（图3I）。肥胖的身体也倾向于粘在自己和解剖镊子上。一旦确定，从每个幼虫中收集尽可能多的脂肪体，并用镊子将其转移到带有 400 μL RT 解剖培养基的最顶层孔中。
4.幼虫脑解剖（图3）
- 如上所述在解剖和成像介质中清洗实验幼虫，以清除它们的食物残渣。为获得最佳效果，请避免将未解剖的幼虫存放在解剖溶液中。这将导致幼虫“淹死”，并对解剖大脑的质量产生负面影响。
- 使用一组镊子，用嘴钩握住幼虫。使用另一组镊子，从后侧轻轻切割/撕下大约 1/3 的幼虫（图 3A）。这将导致消化道，脂肪体，结缔组织和神经系统的元素从幼虫破裂的一侧“爆发”出来（图3B）。
- 使用一组镊子，用嘴钩握住幼虫。用另一组镊子，轻轻地将角质层刷向口钩，同时用镊子握住口钩向内“推动”，直到整个幼虫翻过来。这种运动类似于将袜子“从内到外”转动（图3C，D）。
- 将幼虫倒置，使中枢神经系统和其他组织朝外，同时仍与角质层相连。在此步骤中，找到中枢神经系统（CNS）以避免意外移除。使用镊子轻轻去除所有非CNS组织，仅留下附着在角质层上的CNS和大脑（图3E）。
- 大脑将通过轴突连接 附着 在角质层上。使用显微解剖剪刀，切断这些轴突连接，将大脑从角质层释放出来。为此，首先轻轻切开脑叶下方（图3F）。重复腹侧神经索下的连接。
注意：如果没有显微切割剪刀，则可以使用镊子完成此步骤。使用镊子时要特别小心，以确保脑组织在从角质层取出时不会过度拉伸，因为机械应力会对大脑健康产生负面影响。 - 将解剖的大脑转移到带有解剖和成像介质的孔中。对于超过3小时的成像实验，如上所述使用补充脂肪体的解剖和成像介质。分批解剖幼虫，以保持解剖时间在20分钟以下。
5. 安装和成像（图4）
- 对于使用膜结合玻片34成像：
- 在解剖盘的最后一口井中收集解剖的大脑和孤立的脂肪体。
- 通过在载玻片背面放置透气膜来组装载玻片的一半，然后将分体环压入中心，将其固定到位（图4A-C）。
- 使用 200 μL 微量移液器，将 ~130-140 μL 解剖和成像介质中的多达 10 个解剖大脑和尽可能多的脂肪体（见上文）转移到膜上。确保将培养基与样品沉积在透气膜的中心（图4D，E）。
- 针对要成像的NB群体和正在使用的显微镜类型定向大脑（图4E）。将样品放置在尽可能靠近显微镜物镜的位置。例如，要对中央脑叶中的NB进行成像，请调整大脑的方向，使脑叶最接近目标（图4H）。
- 一旦大脑定向，轻轻地将玻璃盖玻片放在膜上的溶液顶部。这将导致含有大脑和脂肪体的溶液扩散到整个膜上（图4F）。
- 通过将实验室组织靠近盖玻片边缘来吸干过量的溶液。当大脑接触盖玻片而不被压扁时，可以达到最佳溶液量。如果在此步骤中需要重新定向，请小心地移动盖玻片以移动大脑。
- 用画笔沿着盖玻片的边缘涂抹融化的凡士林来固定盖玻片。让果冻凝固（图4G）。
- 对于使用多孔成像载玻片成像（图4）：
- 将 400 μL 成像培养基添加到多孔载玻片的孔中（在此处进行的实验中，使用腔室 8 孔微型 [μ] 载玻片; 图4I）。将先前解剖的脂肪体转移到该孔中（见步骤3.4）。
- 在孔中心附近的簇中沉积多达10个大脑（图4J）。
- 如步骤5.1.4（图4K）中所述，针对要成像的NB群体和正在使用的显微镜类型定向大脑。排列样本，使它们彼此靠近。这将最大限度地减少样品台在样品之间必须移动的距离，从而减少采集过程中的样品漂移。
- 一旦大脑在井中定向，让大脑沉淀2-5分钟。这增加了它们在运输/成像过程中的稳定性。在此期间准备显微镜以进行采集。
- 用载玻片盖盖住载玻片μ载玻片，然后将其转移到显微镜上。以尽可能低的激光功率和曝光时间开始采集，以最大限度地减少光漂白。
6. 数据处理和管理最佳实践
- 根据可用的分析软件根据需要处理数据。
- 对于此处显示的示例，使用幻灯片软件将采集的数据保存为幻灯片图像文件 （.sld）。
- 要使用 Imaris 文件转换器转换为 Imaris 的专有文件类型 （.ims），请在单独的窗口中打开 Imaris 文件转换器。单击并将.sld文件拖到Imaris文件转换器的“输入”部分。
- 确定转换后文件的所需输出位置，然后单击“全部启动”。
- 转换后，在Imaris软件中查看和注释数据。
注意：可以使用图像分析的替代方案代替Imaris，例如斐济（https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html），Aivia（https://www.aivia-software.com/），Volocity（https://www.volocity4d.com/）或其他。
- 保留尽可能多的原始数据，以便妥善保存记录。例如，如果采集软件保存为一种文件格式，但转换为另一种格式进行分析，请保留采集的数据版本。
- 对于数据分析，请尽可能多地记录有关样品和采集设置的详细信息。要保留的关键信息包括解剖幼虫的基因型、解剖前幼虫的年龄、饲养它们的餐盖状态、成像期间使用的激光功率、曝光时间、采集时间和时间分辨率。
7. 细胞周期长度定量示例（图5）
注意：在本例中，对表达极性标记针（Pins：：EGFP16）和微管结合蛋白木星25 （樱桃：：木星13）的幼虫进行成像。随后的分析是使用Imaris软件进行的。
- 使用所选的图像分析软件打开电影。滚动浏览电影的长度以识别划分的 NB，并标记它们以供将来参考。通过其不同的有丝分裂纺锤体识别分裂的NB（图5C-E）。
- 确定参考细胞周期阶段以确定细胞周期长度。在本例中，中期用作参考。
- 手动确定连续中期之间的帧数，并将其转换为分钟或小时以确定完成一个细胞周期所需的时间。
- 为此，请采用电影的时间分辨率并将其乘以中期之间的帧数。例如，如果电影的时间分辨率为每 5 分钟一帧，并且在第 13 帧和第 35 帧观察到中期，则这些中期之间的时间为 110 分钟（[35 − 13] × 5）。
- 使用任何适当的软件绘制数据。此处显示的数据是使用PRISM软件绘制的。
8. 细胞纺锤对准的量化示例（图5）
注意：在本例中，使用 Imaris 软件执行分析。
- 在 Imaris 或其他所选软件中打开电影文件。滚动浏览电影的长度以识别划分的 NB，并标记它们以供将来参考。
- 使用顶端和基底中心体（用 m表示）确定纺锤体极形成的载体，如下所示：
其中 Ax、 Ay 和 Az 是顶端中心体的坐标， Bx、 By 和 Bz 是基底中心体的坐标。类似地，分裂向量的轴（用 n表示）由顶端Pins：：EGFP新月形和基底皮层的中点形成：
其中 Ax、 Ay 和 Az 是 Pins：：EGFP 新月形中点的坐标， Bx、 By 和 Bz 是基底皮层中点的坐标。 - 确定向量 m 和 n 的大小：
m的星等：
n 的大小：
- 确定 m 和 n 的点积（用 k 表示）：
- 使用点积 k 和矢量幅度 m 和 n，确定矢量之间的角度：
- 在所选软件中绘制数据。此处显示的数据是在 Excel Microsoft 中准备的，并在 PRISM 中可视化。
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Representative Results
中枢脑叶NBs的解剖和成像表达Pins：：EGFP和樱桃：：木星
为了展示这一协议，表达UAS驱动的樱桃：：木星13和内源性标记的Pins：：EGFP16（w; worGal4，UAS-cherry：：jupiter/CyO;引脚：：EGFP / TM6B，Tb）使用多孔成像载玻片使用所述方案成像4小时（图5C，D）。其他数据取自表达UAS驱动的樱桃：：木星13的幼虫和内源性标记的米兰达：：EGFP （w; worGal4，UAS-cherry：：Zeus/CyO;UAS-Miranda：：GFP / TM6B），使用膜结合载玻片成像10小时（图5E，F）。幼虫按照本议定书第1节所述在网箱中饲养。达到72-96小时时，解剖幼虫（图3），安装（图4）并成像。对于这里进行的实验，561 nm激光器以10%的激光功率和100 ms的曝光时间使用，488 nm的激光器以15%的激光功率和100 ms的曝光时间使用。Z堆栈（41μm）以1μm的步长采集。在智能成像创新（3i）转盘共聚焦系统上每5分钟采集一次图像，该系统由横河电机CSU-W1转盘单元和两台Prime 95B Scientific CMOS相机组成。使用安装在尼康Eclipse Ti显微镜上的60x/1.4NA油浸物镜进行成像。实时成像体素为0.22μm x 0.22μm x 0.75μm（60x/1.4NA旋转盘）。
与之前的报告一致 16，在有丝分裂期间，针在分裂 NB 时形成明显的顶端新月形，并且有丝分裂纺锤体始终与该顶端新月对齐（图 5C）。通过测量各个NB的连续中期之间的时间来确定细胞周期长度（图5D，F）。
在没有补充脂肪体的情况下在多孔成像载玻片上成像4小时的样品中，细胞周期长度随着成像时间的增加而增加（图5C，D）。在膜结合载玻片上在脂肪体补充培养基中成像的样品未显示细胞周期长度增加（图5E，F）。 此外，在10小时膜结合载玻片上观察到具有四个分区的NBs（图5D与图5F）。
最后，使用GFP标记的引脚作为参考确定分割轴和有丝分裂主轴之间的角度（示意图如图 5G所示）。通过识别有丝分裂中针形成的顶端新月的中点并将细胞一分为二来确定分裂轴（图5G，红色虚线）。如前所述，野生型NB显示出距分割轴不超过30°的有丝分裂纺锤体（Loyer和Januschke36 和 图5H）。
图1：材料。 （A）解剖显微镜。（B）收集笼，里面装有所需基因型的苍蝇和幼虫生长的餐盖。（C） 解剖和成像介质，5 mL。（D） 含有来自三个不同集合的幼虫的餐帽。（E，E'）显微切割工具，从左到右：显微切割剪刀、镊子。（F，F'）解剖盘。（G） 用于样品成像的 8 孔μ载玻片。请点击此处查看此图的大图。
图2：示例餐盖 。 （A）两个小瓶，雄性和雌性苍蝇要交叉，一个空的胚胎收集笼和一个新鲜的餐盖。（B）带有新餐盖的胚胎收集笼的底部（左）和带有苍蝇的笼子顶部（右）。（C）完全组装好的飞笼。（D）一个带有幼虫进行解剖的分阶段良好的餐帽的例子。请注意，食物受到幼虫的干扰，但不会过度干扰。（中、女）两个 4 天大、过度拥挤的餐帽的例子。请注意，该食物现在具有汤状的稠度。 请点击此处查看此图的大图。
图3：解剖 。 （A）第三龄幼虫的背视图。幼虫后端的红线表示应该进行第一次切割的位置。（B）切除后端后幼虫的背视图。（C）显示如何倒置幼虫的图表。使用一组镊子，将幼虫握住第一次切口附近的角质层。使用其他镊子，按入幼虫的前端以内陷。黑色箭头表示镊子的方向，一个从前侧“推入”幼虫，另一个将切好的后端向前端移动。较小的红色箭头表示肥胖身体的卡通。（D）倒置幼虫的视图，脂肪体和消化道仍然附着。（E）去除非中枢神经系统组织的倒置幼虫视图。红色虚线勾勒出仍然附着的大脑。（F）显示如何从角质层中取出大脑的示意图。红色虚线表示用显微解剖剪刀切割以将大脑从倒置角质层中释放的路径，黑色箭头表示从角质层中取出大脑。（G）倒置大脑的视图，该视图仍然通过腹侧神经索（VNC）下的少量轴突连接连接到角质层。（H）孤立的幼虫脑。脑叶用橙色虚线勾勒。（一）孤立的脂肪体。 请点击此处查看此图的大图。
图4：装载和成像。 （A） 用于组装膜结合金属载玻片的组件视图。（B）膜结合载玻片的组件及其组件的示意图。（C）膜插入金属载玻片的侧视图，由分体金属环固定到位。（D） 组装好的成像载玻片的顶视图，没有盖玻片。含有脂肪体和解剖大脑的解剖和成像介质已被放置在膜上。（E）中脂肪体和大脑的放大视图。（F）添加玻璃盖玻片后金属载玻片的顶视图。（G）组装好的载玻片的顶视图，玻璃盖玻片用熔化的凡士林固定在载玻片上。用凡士林覆盖盖玻片的边缘也可以防止介质蒸发。（H）组装好的膜载玻片示意图，其大脑定向于在倒置显微镜上观察。蓝色圆圈表示中枢脑叶和VNC中的NB。（I） 空的多孔载玻片视图。（J）多孔成像载玻片的一个孔的放大视图。（K）显示用于在倒置显微镜上使用多孔载玻片对中央脑叶成像的大脑方向示意图。蓝色圆圈表示中枢脑叶和VNC中的NB。 请点击此处查看此图的大图。
图5：细胞周期长度的量化。 （A）第三龄幼虫脑图，突出显示脑叶，视叶（OL，深灰色），腹侧神经索（VNC），NB（深蓝色），GMC（浅蓝色）和神经元（紫色）在中央脑叶和VNC内。（B） NB和GMC划分示意图。（C）野生型NB的图像系列，其中微管标记为白色（MTs，UAS-Cherry：：Jupiter）和顶端针（针：：EGFP绿色），在多孔载玻片中成像，无需补充脂肪体4小时。合并的图像和具有细胞周期时间的相应谱系树如下所示。比例尺 = 10 μm。 （D）在没有脂肪体的多孔载玻片上成像的样品中第一，第二和第三次分裂的细胞周期长度（中期 - 中期）的定量。（E）野生型NB的图像系列，带有白色标记的微管（MTs，UAS-Cherry：：Jupiter），用膜结合的载玻片成像，补充脂肪体10小时，相应的谱系树和细胞周期时间如下所示。比例尺 = 10 μm。 （F） 在具有脂肪体的膜结合载玻片上成像的样品中第一、第二、第三和第四分裂的细胞周期长度（中期 - 中期）的定量。（G） 如何确定主轴轴（橙色虚线）和分割轴（θ，红色虚线）之间的角度示意图。（H）使用没有脂肪体的多孔载玻片成像的10个细胞的θ的定量。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议概述了一种从 黑腹果蝇 幼虫对活外植体大脑进行成像的方法。这里描述的方案允许在正确的实验条件下观察外植体大脑12-20小时。必须特别考虑样品的制备和所需实验的设计。如上所述，决定解剖组织质量的最关键因素之一是幼虫的健康。为了达到尽可能高的质量，必须确保幼虫在采集前得到良好的喂养。不健康的幼虫最常见的原因是过度拥挤。为了解决这个问题，必须确保通过增加收获频率或将新鲜产下的鸡蛋与空盘子分开的盘子来最大限度地减少过度拥挤。
该协议的另一个关键要素是解剖分离脑组织的方法。大脑和其中的NBs对外部因素非常敏感，例如解剖介质的温度和解剖本身的侵入性。太冷的培养基往往会使微管解聚。同样，拉伸或破裂大脑的解剖将对NB的质量产生不利影响。为了防止这种情况，应避免直接拉动脑组织，而是将解剖工具固定在角质层或其他组织上。显微切割剪刀在这方面有很大帮助，因为它们对脑组织的拉动最小。如果没有剪刀，可以使用镊子小心地去除腹侧神经索和角质层之间的连接组织。
该协议提出了两种安装幼虫大脑用于共聚焦显微镜的方法。从技术角度来看，在多孔载玻片中安装样品比在膜结合载玻片上安装更简单。但是，每种方法最适合不同类型的实验。此处显示的数据表明，对于较短的电影（即少于4小时）或具有高时间分辨率的电影（即，每10秒获取一次z-stack），在多孔载玻片中成像足以观察幼虫中枢脑中的多个分裂。对于较长的采集窗口，安装在膜结合载玻片上是理想的选择，因为以这种方式制备的样品在整个电影中更频繁地分裂。通常，野生型幼虫NBs每40-90分钟分裂一次13。尽管多孔载玻片可用于长（>4小时）电影，但在这种情况下观察到细胞周期长度的增加和增殖NB的减少（图5D）。因此，在设计实验时，必须考虑用于安装样品的方法和要测量的数据类型。
该协议建议在一个孔或载玻片中对多个大脑进行成像，因为这可以提高任何给定实验的数据收集效率。然而，由于舞台在大脑位置之间的移动，大脑在井内的方向和位置会影响整部电影中发生的移动程度。将大脑聚集在井中的一个集中位置可以最大限度地减少这个问题。然而，在使用多孔载玻片的实验中，在较长的电影过程中可能会发生一些偏移。在许多情况下，在这些较长的电影中观察到的偏移是最小的，并且可以在分析过程中进行校正。使用金属滑块设置也可以防止大脑运动，因为毛细管力阻止解剖的大脑移动。
使用多孔载玻片，在技术上可以进行多孔成像实验。然而，这需要调整堆栈大小和时间分辨率，以考虑显微镜在位置之间移动所花费的额外时间。这可能有利于大规模的基因筛选实验，其中可以在不同的孔中对多个基因型进行成像。
在某些情况下，大脑在实验过程中很少或根本没有分裂的NB。这可能是由于几个因素，这些因素取决于成像样品的性质、用于饲养幼虫的食物的质量、解剖的质量以及用于生成数据的采集设置。尽管在准备幼虫大脑进行成像时，建议尽可能多地去除组织，但不建议过度修剪大脑以尽量减少机械应力，因为这可能会对数据质量产生负面影响。此外，经常暴露于强大的成像激光会对神经母细胞健康产生负面影响。因此，在收集成像数据时应考虑调整激光功率、曝光时间和成像频率。
对于安装样品，可以使用其他方法。例如，外植体大脑可以安装在固体基质37中。不同安装方案的可用性提供了在各种显微镜上对幼虫脑外植体进行成像的机会。
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Disclosures
作者没有财务披露需要申报。
Acknowledgments
这项研究得到了R35GM148160（C.C.）和美国国立卫生研究院（NIH）培训补助金T32 GM007270（R.C.S）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C.
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
