Summary
Her diskuterer vi en arbeidsflyt for å forberede, dissekere, montere og avbilde levende eksplante hjerner fra Drosophila melanogaster tredje instar larver for å observere cellulær og subcellulær dynamikk under fysiologiske forhold.
Abstract
Drosophila nevrale stamceller (neuroblaster, NBs heretter) gjennomgår asymmetriske divisjoner, regenererer den selvfornyende neuroblasten, samtidig som den danner en differensierende ganglionmodercelle (GMC), som vil gjennomgå en ekstra deling for å gi opphav til to nevroner eller glia. Studier i NBs har avdekket de molekylære mekanismene som ligger til grunn for cellepolaritet, spindelorientering, neural stamcelle selvfornyelse og differensiering. Disse asymmetriske celledelingene er lett observerbare via levende celleavbildning, noe som gjør larve NBs ideelt egnet for å undersøke den spatiotemporale dynamikken til asymmetrisk celledeling i levende vev. Når de dissekeres riktig og avbildes i næringstilskuddsmedium, deler NBs i eksplantehjerner seg robust i 12-20 timer. Tidligere beskrevne metoder er teknisk vanskelige og kan være utfordrende for de som er nye på feltet. Her beskrives en protokoll for fremstilling, disseksjon, montering og avbildning av levende tredjestjerners larvehjerneplanter ved bruk av fettkroppstilskudd. Potensielle problemer diskuteres også, og det gis eksempler på hvordan denne teknikken kan brukes.
Introduction
Asymmetrisk celledeling (ACD) er prosessen der subcellulære komponenter som RNA, proteiner og organeller fordeles ulikt mellom datterceller 1,2. Denne prosessen er ofte sett i stamceller, som gjennomgår ACD for å gi opphav til datterceller med forskjellige utviklingsskjebner. Drosophila NB deler seg asymmetrisk for å produsere en NB, som beholder sin stamme, og en ganglionmodercelle (GMC). GMC gjennomgår ytterligere divisjoner for å produsere differensierende nevroner eller glia3. Asymmetrisk delende NBs er rikelig i utviklingshjernen til tredje instar larver, som lett observeres via mikroskopi. På det tredje instar larvestadiet er det omtrent 100 NBs tilstede i hver sentral hjernelapp 3,4,5,6.
Asymmetrisk celledeling er en svært dynamisk prosess. Live-cell imaging protokoller har blitt brukt til å måle og kvantifisere dynamikken i cellepolaritet 7,8,9,10, spindelorientering 11,12,13, dynamikken i actomyosin cortex 14,15,16,17,18, mikrotubuli og sentrosombiologi 19,20,21,22,23,24,25,26,27, og membran 10,28 og kromatindynamikk 29. Kvalitative og kvantitative beskrivelser av ACD er avhengige av robuste metoder og protokoller for å avbilde NBs i intakte levende hjerner. Følgende protokoll skisserer metoder for å forberede, dissekere og avbilde tredje instar larvehjerner for live-celleavbildning in vivo ved hjelp av to forskjellige monteringsmetoder. Disse metodene er best egnet for forskere som er interessert i spatiotemporal dynamikk av stamcelledelinger, samt divisjoner i andre hjerneceller, da de tillater kort- og langsiktige observasjoner av cellulære hendelser. I tillegg er disse teknikkene lett tilgjengelige for nykommere til feltet. Vi demonstrerer effektiviteten og tilpasningsevnen til denne tilnærmingen med larvehjerner som uttrykker fluorescerende merkede mikrotubuli og kortikale fusjonsproteiner. I tillegg diskuterer vi analysemetoder og betraktninger for anvendelse i andre studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Figur 1 viser materialene som kreves for å utføre denne studien.
1. Vurderinger og forberedelser til eksperimentet
- Forhindre at larvene overbefolkning.
MERK: Kvaliteten på explant larvehjerner er direkte relatert til larvenes helse og kvalitet før disseksjon. Larver som er underernærte fra overbefolkning vil generelt gi lavere kvalitet hjerner30.- Sørg for at det ikke er mer enn 20-30 larver per måltidsrett, for å unngå underernæring. Eksempler på dette kan ses i figur 2.
- Filter og aliquot Schneiders medium før bruk.
- For hver disseksjon, tilbered ferskt bildebehandlings- og disseksjonsmedium ved å supplere aliquoted Schneiders insektmedium med 1% bovint vekstserum (BGS). Et volum på 5 ml disseksjon og bildebehandlingsmedium er vanligvis tilstrekkelig for et avbildningseksperiment.
- Varm det tilsatte mediet til romtemperatur (RT) før bruk.
- Vurder lengden på filmen som skal samles inn, og bruk den til å faktorisere tilskudd av bildemediet, monteringsmetoden og mikroskopets oppkjøpsinnstillinger.
MERK: Under optimale forhold vil NBs i hjerner supplert med bare BGS robust dele seg i oppover 3 timer.- Suppler bildemediet ved å legge larvefett kroppsvev til bildemediet for å støtte divisjoner over 4 timer når du utfører eksperimenter som krever lengre filmer.
MERK: Fete legemer utskiller mitogener som støtter NB-spredning31, og hele fettlegemer fra 10 larver er tilstrekkelig til å støtte fire til fem hjerner. Videre har prøver avbildet med et membranbundet lysbilde vist seg å dele seg i over 10 t13,32, mens prøver avbildet med et flerbrønnsskred vanligvis deler sjeldnere (upubliserte observasjoner). - Alternativt kan du implementere et mer komplekst bildebehandlingsmedium for lengre filmer, som beskrevet tidligere33. Minimer fotoskader ved å justere eksponeringstiden, lasereffekten og samplingsfrekvensen for best resultat.
- Suppler bildemediet ved å legge larvefett kroppsvev til bildemediet for å støtte divisjoner over 4 timer når du utfører eksperimenter som krever lengre filmer.
2. Larvenes staging og innsamling (figur 2)
- Kryss 1-5 dager gamle kvinnelige jomfrufluer med 1-7 dager gamle voksne hannfluer for å produsere avkom med ønsket genotype. For optimalt utbytte, kryss 10-15 kvinnelige jomfruer med 5-10 hanner. Legg fluene i et fluebur med matlokk (figur 2A-C), og rug ved 25 °C.
- Bytt måltidshetten daglig. Dette forhindrer at måltidshettene blir overfylte med larver, noe som reduserer kvaliteten på de dissekerte hjernene.
- Hvis måltidskorken er betydelig dekket av larver (dvs. >30), deler du måltidskorken i to og erstatter den ene halvdelen med en fersk måltidshette som også er delt i to. Alternativt kan du bytte måltidshettene oftere (dvs. hver 12. time i stedet for hver 24. time). Eksempler på overbefolkede måltidskorker kan ses i figur 2E, F.
- Rug måltidshetten med larver ved 25 °C til larvene når ønsket alder.
3. Kroppsdisseksjon av larvefett (figur 3)
MERK: Denne protokollen beskriver disseksjoner ved hjelp av en 3-brønns disseksjonsfat.
- Pipette ~400 μL disseksjons- og avbildningsmedium i hver brønn i en 3-brønns disseksjonsfat.
- Vask ti 72-96 timer gamle velfødde villtype larver ved å forsiktig holde dem med disseksjonstang, og dyppe dem inn og ut av disseksjonsløsning i den nederste brønnen til alle matpartikler er vasket av. Etter skylling, flytt de rene larver til midten godt.
- Bruk ett sett pinsett, hold larven ved munnkrokene. Med det andre settet med pinsett, brudd den ene siden av larvens kutikula.
- Dette bruddet vil føre til at fettlegemene søler ut av larven. De fete legemene er offwhite og halvgjennomsiktige og vil ha en gitterlignende struktur (figur 3I). De fete kroppene vil også ha en tendens til å holde seg til seg selv og disseksjonspinsetten. Når den er identifisert, samle så mye fett kropp fra hver larve som mulig, og overfør den med tangen til den øverste brønnen med 400 μL RT disseksjonsmedium.
4. Larvehjernedisseksjon (figur 3)
- Vask de eksperimentelle larvene i disseksjons- og bildebehandlingsmedium som ovenfor for å frigjøre dem fra matrester. For best resultat, unngå å lagre udissekerte larver i disseksjonsløsningen. Dette vil føre til at larvene "drukner" og vil påvirke kvaliteten på de dissekerte hjernene negativt.
- Bruk ett sett pinsett, hold larven ved munnkrokene. Bruk en annen pinsettsett, kutt/riv forsiktig av ca. 1/3 av larven fra bakre side (figur 3A). Dette vil føre til at elementer i fordøyelseskanalen, fettlegemer, bindevev og nervesystem "sprekker" ut av sprukket side av larven (figur 3B).
- Bruk ett sett pinsett, hold larven ved munnkrokene. Med det andre settet med pinsett, børst forsiktig neglebåndet mot munnkrokene mens du "presser" innover med pinsetten som holder munnkrokene til hele larven er vendt innvendig ut. Denne bevegelsen ligner på å vri en sokk "innvendig ut" (figur 3C, D).
- Inverter larven slik at sentralnervesystemet og annet vev vender utover mens de fortsatt er koblet til kutikula. På dette trinnet, lokaliser sentralnervesystemet (CNS) for å unngå utilsiktet fjerning. Bruk pinsett, fjern forsiktig alt ikke-CNS-vev, slik at bare CNS og hjernen er festet til neglebåndet (figur 3E).
- Hjernen vil bli festet til neglebåndet via aksonale forbindelser. Bruk mikrodisseksjonssaks til å kutte disse aksonale forbindelsene for å frigjøre hjernen fra kutikula. For å gjøre dette, kutt først forsiktig under hjernelappene (figur 3F). Gjenta med forbindelsene under den ventrale nervestrengen.
MERK: Dette trinnet kan gjøres med pinsett hvis mikrodisseksjonssaks ikke er tilgjengelig. Vær spesielt forsiktig når du bruker pinsett for å sikre at hjernevevet ikke blir overbelastet under fjerning fra neglebåndet fordi mekanisk stress vil påvirke hjernens helse negativt. - Overfør den dissekerte hjernen til en brønn med disseksjon og bildemedium. For bildebehandlingseksperimenter lengre enn 3 timer, bruk disseksjons- og bildebehandlingsmedium supplert med fettlegemer som beskrevet ovenfor. Dissekere larvene i grupper for å holde disseksjonstiden under 20 min.
5. Montering og avbildning (figur 4)
- For avbildning med membranbundet lysbilde34:
- Samle både dissekerte hjerner og isolerte fettlegemer i den siste brønnen i disseksjonsfatet.
- Monter halvparten av lysbildet ved å plassere en gassgjennomtrengelig membran over baksiden av lysbildet, og trykk den delte ringen inn i midten, hold den på plass (figur 4A-C).
- Ved hjelp av en 200 μL mikropipette, overfør opptil 10 dissekerte hjerner og så mye fettlegeme som mulig (se ovenfor) i ~ 130-140 μL disseksjons- og bildebehandlingsmedium til membranen. Sørg for å deponere mediet med prøvene i midten av den gassgjennomtrengelige membranen (figur 4D, E).
- Orienter hjernen for populasjonen av NBs som skal avbildes og for hvilken type mikroskop som brukes (figur 4E). Plasser prøven så nær mikroskopets mål som mulig. For eksempel, for å avbilde NBs i de sentrale hjernelappene, orienter hjernen slik at hjernelappene er nærmest målet (figur 4H).
- Når hjernen er orientert, legg forsiktig et glassdeksel på toppen av løsningen på membranen. Dette vil føre til at løsningen som inneholder hjernen og fettlegemene spres over hele membranen (figur 4F).
- Blett overdreven oppløsning ved å holde et laboratorievev nær dekselkanten. Den optimale mengden løsning oppnås når hjernen berører dekselet uten å bli klemt. Hvis omorientering er nødvendig på dette trinnet, flytt forsiktig dekselet for å bevege hjernen.
- Immobiliser dekselet ved å påføre smeltet vaselin langs kantene på dekselet med en pensel. La geléen stivne (figur 4G).
- For avbildning med et bildelysbilde med flere brønner (figur 4):
- Legg til 400 μL bildebehandlingsmedium til en brønn i et flerbrønnslysbilde (i eksperimentet som ble utført her, ble det brukt et kamret 8-brønns mikro[μ]-lysbilde; Figur 4I). Overfør de tidligere dissekerte fettlegemene til denne brønnen (se trinn 3.4).
- Sett opptil 10 hjerner i en klynge nær midten av brønnen (figur 4J).
- Orienter hjernen for populasjonen av NBs som skal avbildes og for hvilken type mikroskop som brukes, som beskrevet i trinn 5.1.4 (figur 4K). Ordne prøvene slik at de er nær hverandre. Dette vil minimere avstanden scenen må bevege seg mellom prøver, noe som reduserer prøvedrift under innsamling.
- Når hjernen har blitt orientert i brønnen, la hjernen slå seg ned i 2-5 min. Dette øker stabiliteten under transport/bildebehandling. Forbered mikroskopet for oppkjøp i løpet av denne tiden.
- Dekk μ-lysbildet med glidedekselet, og overfør det til mikroskopet. Begynn anskaffelsen med lavest mulig lasereffekt og eksponeringstid for å minimere fotobleking.
6. Beste praksis for databehandling og -administrasjon
- Behandle dataene etter behov i henhold til tilgjengelig analyseprogramvare.
- I eksemplet som vises her, lagrer du de innhentede dataene med SlideBook-programvaren som en SlideBook Image File (.sld).
- For å konvertere til Imaris proprietære filtype (.ims) ved hjelp av Imaris File Converter, åpne Imaris File Converter i et eget vindu. Klikk på og dra .sld-filene til " input" -delen av Imaris File Converter.
- Bestem ønsket utgangssted for de konverterte filene, og klikk på "Start alle."
- Etter konvertering, se og kommentere dataene i Imaris-programvaren.
MERK: Alternativer for bildeanalyse kan brukes i stedet for Imaris, for eksempel Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) eller andre.
- Behold så mye av de opprinnelige dataene som mulig for riktig journalføring. Hvis anskaffelsesprogramvaren for eksempel lagres i ett filformat, men konverteres til et annet format for analyse, beholder du den anskaffede versjonen av dataene.
- For dataanalyse, opprettholde en oversikt over så mange detaljer som mulig om prøven og oppkjøpet innstillinger. Nøkkelinformasjon som skal beholdes inkluderer genotypen til de dissekerte larvene, larvenes alder før disseksjon, tilstanden til måltidshetten de ble oppdrettet i, laserkraften som ble brukt under avbildning, eksponeringstiden, lengden på oppkjøpet og den tidsmessige oppløsningen.
7. Eksempel på kvantifisering av cellesykluslengde (figur 5)
MERK: I dette eksemplet ble larver som uttrykker polaritetsmarkøren Pins (Pins::EGFP16) og det mikrotubulibindende proteinet Jupiter25 (kirsebær::Jupiter13) avbildet. Den påfølgende analysen ble utført ved hjelp av Imaris programvare.
- Åpne filmen ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren du ønsker. Bla gjennom lengden på filmen for å identifisere deler av NB-er, og merk dem for fremtidig referanse. Identifiser de inndelte NB-ene med deres distinkte mitotiske spindler (figur 5C-E).
- Identifiser et referansecellesyklustrinn for å bestemme cellesykluslengden. I dette eksemplet brukes metafase som referanse.
- Bestem manuelt antall delbilder mellom påfølgende metafaser, og konverter det til minutter eller timer for å bestemme tiden det tar å fullføre en cellesyklus.
- Gjør dette ved å ta den tidsmessige oppløsningen til filmen og multiplisere den med antall bilder mellom metafaser. For eksempel, hvis filmens tidsmessige oppløsning er ett bilde hvert 5. minutt, og metafaser observeres i ramme 13 og ramme 35, vil tiden mellom disse metafasene være 110 minutter ([35 − 13] × 5).
- Plott dataene med passende programvare. Dataene som vises her ble plottet ved hjelp av PRISM-programvare.
8. Eksempel på kvantifisering av cellespindeljustering (figur 5)
MERK: I dette eksemplet utføres analysen ved hjelp av Imaris-programvare.
- Åpne filmfilen i Imaris eller en annen programvare du ønsker. Bla gjennom lengden på filmen for å identifisere deler av NB-er, og merk dem for fremtidig referanse.
- Bestem vektoren dannet av spindelpolene ved hjelp av apikale og basale sentrosomer (representert ved m), som følger:
hvor Ax, Ay og Az er koordinatene til det apikale sentrosomet, og Bx, By og Bz er koordinatene til det basale sentrosomet. På samme måte dannes aksen til delingsvektoren (representert ved n) av midtpunktet til de apikale Pins::EGFP-halvmånen og den basale cortexen:
der Ax, Ay og Az er koordinatene til midtpunktet til Pins::EGFP-halvmånen, og Bx, By og Bz er koordinatene til midtpunktet til basal cortex. - Bestem størrelsen på vektorene m og n:
Størrelse på m:
Størrelsen på n:
- Bestem prikkproduktet (representert ved k) av m og n:
- Bruk prikkproduktet k og vektorstørrelser m og n, bestem vinkelen mellom vektorene:
- Plott dataene i programvaren du ønsker. Dataene som vises her ble utarbeidet i Microsoft Excel og visualisert i PRISM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disseksjon og avbildning av sentral hjernelapp NBs som uttrykker Pins::EGFP og Cherry::Jupiter
For å vise frem denne protokollen, larver som uttrykker UAS-drevet kirsebær::Jupiter13 og endogent merket Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) ble avbildet i 4 timer ved hjelp av den beskrevne protokollen ved hjelp av multi-well imaging slides (figur 5C,D). Ytterligere data ble tatt fra larver som uttrykker UAS-drevet kirsebær::Jupiter13 og endogent merket Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), som ble avbildet i 10 timer ved hjelp av et membranbundet lysbilde (figur 5E,F). Larvene ble oppdrettet i bur som beskrevet i avsnitt 1 i denne protokollen. Da larvene ble 72-96 timer gamle, ble de dissekert (figur 3), montert (figur 4) og avbildet. For forsøkene som ble utført her, ble en 561 nm laser brukt ved 10% lasereffekt med 100 ms eksponeringstid, og en 488 nm laser ble brukt ved 15% lasereffekt med 100 ms eksponeringstid. Z-stacks (41 μm) ble anskaffet med en trinnstørrelse på 1 μm. Bilder ble tatt hvert 5. minutt ved RT på et Intelligent Imaging Innovations (3i) spinnende skivekonfokalsystem, bestående av en Yokogawa CSU-W1 spinnende plateenhet og to Prime 95B Scientific CMOS-kameraer. Et oljenedsenkingsmål på 60x/1.4NA montert på et Nikon Eclipse Ti-mikroskop ble brukt til avbildning. De levende bildevokslene var 0,22 μm x 0,22 μm x 0,75 μm (60x/1,4NA spinneskive).
I samsvar med tidligere rapporter16 dannet Pins en markert apikal halvmåne ved å dele NBs under mitose, og de mitotiske spindlene konsekvent justert til denne apikale halvmåne (figur 5C). Cellesykluslengden ble bestemt ved å måle tiden mellom suksessive metafaser av de enkelte NBs (figur 5D,F).
I prøver som ble avbildet på et flerbrønns bildelysbilde i 4 timer uten fettkroppstilskudd, økte cellesykluslengden med økende bildetid (figur 5C, D). Prøver som ble avbildet i fett kroppssupplert medium på et membranbundet lysbilde, viste ikke en økning i cellesykluslengde (figur 5E, F). Videre ble NBs med fire divisjoner observert på 10 timers membranbundet lysbilde (figur 5D vs. figur5F).
Til slutt ble vinkelen mellom delingsaksen og den mitotiske spindelen bestemt ved hjelp av GFP-merkede pinner som referanse (skjematisk vist i figur 5G). Divisjonsaksen ble bestemt ved å identifisere midtpunktet til den apikale halvmåne dannet av Pins i mitose og krysse cellen i to (figur 5G, rødstiplet linje). Som tidligere beskrevet viste villtype NB mitotiske spindler som ikke var orientert mer enn 30° fra delingsaksen (Loyer og Januschke36 og figur 5H).
Figur 1: Materialer. (A) Disseksjonsmikroskop. (B) Oppsamlingsbur som inneholder fluer av ønsket genotype og en måltidshette med voksende larver. (C) Disseksjons- og bildemedium, 5 ml. (D) Måltidshetter med larver fra tre forskjellige samlinger. (E,E') Mikrodisseksjonsverktøy, fra venstre til høyre: mikrodisseksjon saks, tang. (F,F') Disseksjon tallerken. (G) Et 8-brønners μ-lysbilde for avbildning av prøvene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på måltidshetter. (A) To hetteglass med hann- og hunnfluer som skal krysses, et tomt embryooppsamlingsbur og en fersk mathette. (B) Bunnen av embryooppsamlingsburet med den nye måltidshetten (venstre) og toppen av buret med fluer (høyre). (C) Det ferdigmonterte flueburet. (D) Et eksempel på en godt iscenesatt måltidshette med larver for disseksjon. Legg merke til at maten er forstyrret av larver, men ikke overforstyrret. (E,F) To eksempler på 4 dager gamle, overfylte matkorker. Legg merke til at maten nå har en suppelignende konsistens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Disseksjon . (A) Dorsal visning av en tredje stjernelarve. Den røde linjen på bakre ende av larven angir hvor det første kuttet skal gjøres. (B) Dorsal visning av larven etter fjerning av bakre ende. (C) Diagram som viser hvordan larven kan snus. Bruk ett sett tang, hold larven ved neglebåndet i nærheten av der det første kuttet ble gjort. Bruk de andre tangene, trykk inn i den fremre enden av larven for å invertere. De svarte pilene angir tangens retning, der den ene "presser seg inn" i larvene fra fremre side og den andre beveger den kuttede bakre enden mot fremre ende. Den mindre røde pilen betegner en tegneserie av fete kropper. (D) Utsikt over en omvendt larve med fettlegemene og fordøyelseskanalen fortsatt festet. (E) Utsikt over en omvendt larve med ikke-CNS-vevet fjernet. Den røde stiplede linjen skisserer den fortsatt festede hjernen. (F) Skjematisk som viser hvordan du fjerner hjernen fra kutikula. Den røde stiplede linjen indikerer banen for å kutte med mikrodisseksjonsaks for å frigjøre hjernen fra den omvendte kutikula, og de svarte pilene angir fjerning av hjernen fra neglebåndet. (G) En visning av den inverterte hjernen som fortsatt er festet til kutikula av et lite antall aksonale forbindelser under ventral nervestreng (VNC). (H) En isolert larvehjerne. Hjernelappene er skissert med stiplede oransje linjer. (I) Isolerte fettlegemer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Montering og avbildning. (A) Visning av komponentene for montering av et membranbundet metalllysbilde. (B) Skjematisk fremstilling av komponentene i det membranbundne lysbildet og deres montering. (C) Sett fra siden av membranen som er satt inn i metallsklien, holdt på plass av den delte metallringen. (D) Toppvisning av det monterte bildelysbildet uten deksel. Disseksjons- og bildemediet som inneholder fettlegemer og dissekerte hjerner er plassert på membranen. (E) Zoomet inn visning av fettlegemene og hjernene i dråpen medium. (F) Sett ovenfra av metallsklien etter at glassdekselet er lagt til. (G) Toppvisning av det monterte lysbildet med glassdekselet festet til lysbildet med smeltet vaselin. Dekker kantene på dekselet med petroleumjell forhindrer også fordampning av mediet. (H) Skjematisk fremstilling av det sammensatte membranlysbildet med hjerner orientert for observasjon på et invertert mikroskop. De blå sirklene betegner NB i de sentrale hjernelappene og VNC. (I) Utsikt over et tomt flerbrønnslysbilde. (J) Zoomet inn av en brønn i lysbildet med flere brønner. (K) Skjematisk viser hjerneorienteringen for avbildning av de sentrale hjernelappene på et omvendt mikroskop med et flerbrønnslysbilde. De blå sirklene betegner NB i de sentrale hjernelappene og VNC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantifisering av cellesykluslengden . (A) Diagram over en tredje instar larvehjerne, som fremhever hjernelappene, optisk lobe (OL, mørkegrå), ventral nervestreng (VNC), NBs (mørk blå), GMC (lyseblå) og nevroner (lilla) i de sentrale hjernelappene og VNC. (B) Skjematisk oversikt over NB- og GMC-divisjoner. (C) Bildeserie av en villtype NB med mikrotubuli merket i hvitt (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) og apikale Pins (Pins::EGFP i grønt) avbildet i et flerbrønnslysbilde uten fetttilskudd i 4 timer. Sammenslåtte bilder og det tilsvarende avstamningstreet med cellesyklustiming er vist nedenfor. Skala bar = 10 μm. (D) Kvantifisering av cellesykluslengden (metafase - metafase) for første, andre og tredje divisjon i prøver avbildet på et flerbrønnslysbilde uten fete legemer. (E) Bildeserie av en villtype NB med mikrotubuli merket i hvitt (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) avbildet med et membranbundet lysbilde med fettkroppstilskudd i 10 timer med tilsvarende avstamningstre og cellesyklustidspunkt vist nedenfor. Skala bar = 10 μm. (F) Kvantifisering av cellesykluslengde (metafase - metafase) for første, andre, tredje og fjerde divisjon i prøver avbildet på et membranbundet lysbilde med fettlegemer. (G) Skjematisk fremstilling av hvordan vinkelen mellom spindelaksen (oransje stiplet linje) og divisjonsaksen (θ, rødstiplet linje) ble bestemt. (H) Kvantifisering av θ fra 10 celler avbildet ved hjelp av et flerbrønnslysbilde uten fettlegemer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen skisserer en tilnærming for avbildning av levende eksplantehjerner fra Drosophila melanogaster larver. Protokollen beskrevet her gjør det mulig for eksplanthjerner å bli observert i 12-20 timer under de rette eksperimentelle forholdene. Det må tas særlig hensyn til utarbeidelse av prøver og utformingen av de ønskede forsøkene. Som nevnt ovenfor er en av de mest kritiske faktorene som bestemmer kvaliteten på det dissekerte vevet larvens helse. For å oppnå høyest mulig kvalitet må man sørge for at larvene er godt matet før innsamling. Usunne larver stammer oftest fra overbefolkning. For å løse dette må man sørge for at overbefolkning minimeres, enten ved å øke høstfrekvensen eller ved å dele retter med nylagde egg med en tom tallerken.
Et annet kritisk element i denne protokollen er metoden for disseksjon for å isolere hjernevevet. Hjernen og NBene i dem er ekstremt følsomme for ytre faktorer, for eksempel temperaturen på disseksjonsmediet og invasiviteten til selve disseksjonen. Medium som er for kaldt vil ha en tendens til å depolymerisere mikrotubuli. På samme måte vil en disseksjon som strekker eller brister hjernen ha skadelige effekter på kvaliteten på NBene. For å forhindre dette, bør man unngå å trekke i hjernevevet direkte og i stedet forankre disseksjonsverktøyene på neglebåndet eller annet vev. Mikrodisseksjonsaks hjelper sterkt i denne forbindelse, da de minimalt trekker på hjernevævet. Hvis saks ikke er tilgjengelig, kan pinsett brukes til å forsiktig fjerne bindevevet mellom ventralnervestrengen og neglebåndet.
Denne protokollen presenterer to metoder for å montere larvehjerner for konfokal mikroskopi. Fra et teknisk synspunkt er montering av prøver i et flerbrønnsglass enklere enn montering på et membranbundet lysbilde. Imidlertid er hver metode best egnet for ulike typer eksperimenter. Dataene som vises her viser at for kortere filmer (dvs. mindre enn 4 timer) eller filmer med høy temporal oppløsning (dvs. å få en z-stabel hver 10. s), er avbildning i et flerbrønnslysbilde tilstrekkelig til å observere flere divisjoner i larvens sentrale hjerne. For lengre opptaksvinduer er montering på et membranbundet lysbilde ideelt, ettersom prøver tilberedt på denne måten deler seg oftere gjennom filmen. Normalt deler villtype larver seg en gang hver 40-90 min13. Selv om flerbrønnslysbilder kan brukes til lange (> 4 timer) filmer, er det observert en økning i cellesykluslengden og en reduksjon i prolifererende NBs i denne tilstanden (figur 5D). Derfor må metoden som brukes til å montere prøver og typen data som skal måles, vurderes ved utforming av eksperimenter.
Denne protokollen anbefaler avbildning av flere hjerner i en brønn eller lysbilde, da dette øker effektiviteten av datainnsamling for et gitt eksperiment. Imidlertid vil orienteringen og plasseringen av hjernen i brønnen påvirke hvor mye skifting skjer gjennom hele filmen på grunn av at scenen beveger seg mellom hjerneposisjoner. Clustering hjernen sammen på ett sentralisert sted i en brønn minimerer dette problemet. Imidlertid kan det forekomme noe forskyvning i løpet av lengre filmer i eksperimenter med flerbrønnslysbilder. I mange tilfeller er forskyvningen observert i disse lengre filmene minimal og kan korrigeres under analysen. Hjernebevegelse kan også forebygges ved å bruke et metalllysbildeoppsett fordi kapillærkreftene hindrer de dissekerte hjernene i å skifte.
Med et flerbrønnslysbilde er det teknisk mulig å utføre eksperimenter med flere brønner. Dette krever imidlertid justeringer i stakkstørrelsen og tidsoppløsningen for å ta hensyn til den ekstra tiden mikroskopet bruker på å bevege seg mellom posisjoner. Dette kan være gunstig for storskala genetiske screeningforsøk, hvor man kan avbilde flere genotyper i forskjellige brønner.
Det er tilfeller der hjerner vil vise liten eller ingen splittende NB i løpet av et eksperiment. Dette skyldes sannsynligvis flere faktorer som avhenger av arten av prøven som avbildes, kvaliteten på maten som brukes til å heve larvene, kvaliteten på disseksjonen og innsamlingsinnstillingene som brukes til å generere dataene. Selv om det er tilrådelig å fjerne så mye vev som mulig når du forbereder larvehjerner til avbildning, anbefales det ikke å overbeskjære hjernen for å minimere mekanisk stress, da dette kan påvirke kvaliteten på dataene negativt. I tillegg vil hyppig eksponering for kraftige bildebehandlingslasere påvirke neuroblasthelsen negativt. Dermed bør man vurdere å justere lasereffekten, eksponeringstiden og bildefrekvensen når man samler inn bildedataene.
For montering av prøver kan alternative metoder brukes. For eksempel kan eksplanthjerner monteres i en solid matrise37. Tilgjengeligheten av forskjellige monteringsprotokoller gir en mulighet til å avbilde larvehjerneplanter på et bredt utvalg av mikroskoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske avsløringer å erklære.
Acknowledgments
Denne forskningen støttes av R35GM148160 (C. C.) og en National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (RCS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C.
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
