Summary
Här diskuterar vi ett arbetsflöde för att förbereda, dissekera, montera och avbilda levande explanthjärnor från Drosophila melanogaster tredje instar larver för att observera den cellulära och subcellulära dynamiken under fysiologiska förhållanden.
Abstract
Drosophila neurala stamceller (neuroblaster, NBs nedan) genomgår asymmetriska uppdelningar, regenererar den självförnyande neuroblasten, samtidigt som de bildar en differentierande ganglionmodercell (GMC), som kommer att genomgå ytterligare en delning för att ge upphov till två neuroner eller glia. Studier av NB har avslöjat de molekylära mekanismerna bakom cellpolaritet, spindelorientering, självförnyelse av neurala stamceller och differentiering. Dessa asymmetriska celldelningar är lätt observerbara via levande cellavbildning, vilket gör larvala NB idealiska för att undersöka den spatiotemporala dynamiken hos asymmetrisk celldelning i levande vävnad. När de är korrekt dissekerade och avbildade i näringskompletterat medium, delar NB i explanthjärnor robust i 12-20 timmar. Tidigare beskrivna metoder är tekniskt svåra och kan vara utmanande för dem som är nya inom området. Här beskrivs ett protokoll för beredning, dissektion, montering och avbildning av levande tredje instar larvala hjärnexplantat med hjälp av fettkroppstillskott. Potentiella problem diskuteras också, och exempel ges på hur denna teknik kan användas.
Introduction
Asymmetrisk celldelning (ACD) är den process genom vilken subcellulära komponenter såsom RNA, proteiner och organeller delas ojämnt mellan dotterceller 1,2. Denna process ses ofta i stamceller, som genomgår ACD för att ge upphov till dotterceller med olika utvecklingsöden. Drosophila NB delar sig asymmetriskt för att producera en NB, som behåller sin stamhet, och en ganglionmodercell (GMC). GMC genomgår ytterligare uppdelningar för att producera differentierande neuroner eller glia3. Asymmetriskt delande NB är rikligt förekommande i de utvecklande hjärnorna hos larver från tredje instar, som lätt observeras via mikroskopi. Vid det tredje larvstadiet finns det ungefär 100 NB närvarande i varje central hjärnlob 3,4,5,6.
Asymmetrisk celldelning är en mycket dynamisk process. Live-cell imaging protokoll har använts för att mäta och kvantifiera dynamiken i cellpolaritet 7,8,9,10, spindelorientering11,12,13, dynamiken i aktomyosin cortex14,15,16,17,18, mikrotubuli och centrosombiologi 19,20,21,22,23,24,25,26,27 och membran 10,28 och kromatindynamik 29. Kvalitativa och kvantitativa beskrivningar av ACD bygger på robusta metoder och protokoll för att avbilda uppdelning av NB i intakta levande hjärnor. Följande protokoll beskriver metoder för att förbereda, dissekera och avbilda larvhjärnor från tredje instar för avbildning av levande celler in vivo med hjälp av två olika monteringsmetoder. Dessa metoder passar bäst för forskare som är intresserade av den spatiotemporala dynamiken i stamcellsdelningar, liksom delningar i andra hjärnceller, eftersom de möjliggör kort- och långsiktiga observationer av cellulära händelser. Dessutom är dessa tekniker lättillgängliga för nykomlingar på fältet. Vi demonstrerar effektiviteten och anpassningsförmågan hos detta tillvägagångssätt med larvhjärnor som uttrycker fluorescerande märkt mikrotubuli och kortikala fusionsproteiner. Vi diskuterar dessutom analysmetoder och överväganden för tillämpning i andra studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Figur 1 visar de material som krävs för att utföra denna studie.
1. Överväganden och förberedelser för experimentet
- Förhindra att larverna är överfulla.
OBS: Kvaliteten på explanterade larvhjärnor är direkt relaterad till larvernas hälsa och kvalitet före dissektion. Larver som är undernärda från överbeläggning kommer i allmänhet att ge hjärnor av lägre kvalitet30.- Se till att det inte finns mer än 20-30 larver per måltidsfat för att undvika undernäring. Exempel på dessa kan ses i figur 2.
- Filtrera och alikvotera Schneiders medium före användning.
- För varje dissektion, förbered färskt bild- och dissektionsmedium genom att komplettera Alikvoterade Schneiders insektsmedium med 1% bovint tillväxtserum (BGS). En volym på 5 ml dissektion och bildmedium är vanligtvis tillräcklig för ett avbildningsexperiment.
- Värm det tillsatta mediet till rumstemperatur (RT) före användning.
- Tänk på längden på filmen som ska samlas in och använd den för att ta hänsyn till kompletteringen av bildmediet, monteringsmetoden och mikroskopets förvärvsinställningar.
OBS: Under optimala förhållanden kommer NB i hjärnor kompletterade med endast BGS att dela sig robust i uppåt 3 timmar.- Komplettera bildmediet genom att tillsätta larvfettkroppsvävnader till bildmediet för att stödja uppdelningar över 4 timmar när man utför experiment som kräver längre filmer.
OBS: Fettkroppar utsöndrar mitogener som stöder NB-proliferation31, och hela fettkroppar från 10 larver är tillräckliga för att stödja fyra till fem hjärnor. Vidare har prover avbildade med en membranbunden bild visat sig dela sig i över 10 h13,32, medan prover avbildade med en flerbrunnsbild vanligtvis delar sig mindre ofta (opublicerade observationer). - Alternativt kan du implementera ett mer komplext bildmedium för längre filmer, som beskrivits tidigare33. Minimera fotoskador genom att justera exponeringstid, lasereffekt och samplingsfrekvens för bästa resultat.
- Komplettera bildmediet genom att tillsätta larvfettkroppsvävnader till bildmediet för att stödja uppdelningar över 4 timmar när man utför experiment som kräver längre filmer.
2. Iscensättning och insamling av larver (figur 2)
- Korsa 1-5 dagar gamla kvinnliga jungfruflugor med 1-7 dagar gamla vuxna hanflugor för att producera avkomma med önskad genotyp. För optimalt utbyte, korsa 10-15 kvinnliga jungfrur med 5-10 män. Sätt dessa flugor i en flugbur med mjöllock (figur 2A–C) och inkubera vid 25 °C.
- Byt måltidslock dagligen. Detta förhindrar att måltidsmössorna blir överfulla med larver, vilket minskar kvaliteten på de dissekerade hjärnorna.
- Om måltidslocket är betydligt täckt av larver (dvs. >30), dela denna måltidslock i hälften och ersätt hälften med en ny måltidslock som också har skurits i hälften. Alternativt kan du byta måltidslock oftare (dvs. var 12: e timme istället för var 24: e timme). Exempel på överbefolkade måltidsmössor kan ses i figur 2E, F.
- Inkubera mössan med larver vid 25 °C tills larverna uppnår önskad ålder.
3. Larvfettkroppsdissektion (figur 3)
OBS: Detta protokoll beskriver dissektioner med hjälp av en 3-brunns dissektionsskål.
- Pipettera ~400 μL dissektions- och bildmedium i varje brunn i en 3-brunns dissektionsskål.
- Tvätta tio 72-96-h gamla välmatade vildtypslarver genom att försiktigt hålla dem med dissektionspincett och doppa dem in och ut ur dissektionslösningen i den nedersta brunnen tills alla matpartiklar har tvättats bort. Efter sköljning, flytta de rena larverna till mittbrunnen.
- Använd en uppsättning pincett, håll larven i munkrokarna. Med den andra uppsättningen pincett, brista ena sidan av larvens nagelband.
- Detta brott kommer att få fettkropparna att spillas ut ur larven. De feta kropparna är benvita och halvgenomskinliga och kommer att ha en gitterliknande struktur (figur 3I). De feta kropparna tenderar också att hålla sig till sig själva och dissektionpincetten. När den har identifierats, samla så mycket fettkropp från varje larv som möjligt och överför den med pincetten till den översta brunnen med 400 μL RT-dissektionsmedium.
4. Larvens hjärndissektion (figur 3)
- Tvätta experimentlarverna i dissektion och bildmedium enligt ovan för att befria dem från matrester. För bästa resultat, undvik att lagra odissekerade larver i dissektionslösningen. Detta kommer att få larverna att "drunkna" och kommer att påverka kvaliteten på de dissekerade hjärnorna negativt.
- Använd en uppsättning pincett, håll larven i munkrokarna. Klipp/riv försiktigt av ungefär 1/3 av larven från den bakre sidan med hjälp av en annan pincett (figur 3A). Detta kommer att orsaka att delar av matsmältningskanalen, fettkroppar, bindväv och nervsystem "spricker" ut ur larvens brutna sida (figur 3B).
- Använd en uppsättning pincett, håll larven i munkrokarna. Med den andra uppsättningen pincett, borsta försiktigt nagelbandet mot munkrokarna medan du "trycker" inåt med pincetten som håller munkrokarna tills hela larven vänds ut och in. Denna rörelse liknar att vrida en strumpa "inifrån och ut" (figur 3C, D).
- Invertera larven så att centrala nervsystemet och andra vävnader vetter utåt medan de fortfarande är anslutna till nagelbandet. Vid detta steg, lokalisera centrala nervsystemet (CNS) för att undvika oavsiktlig borttagning. Använd pincett, ta försiktigt bort all icke-CNS-vävnad och lämna endast CNS och hjärnan fäst vid nagelbandet (figur 3E).
- Hjärnan kommer att fästas vid nagelbandet via axonala anslutningar. Använd mikrodissektionssax, klipp dessa axonala anslutningar för att frigöra hjärnan från nagelbandet. För att göra detta, skär först försiktigt under hjärnloberna (figur 3F). Upprepa med anslutningarna under den ventrala nervkabeln.
OBS: Detta steg kan göras med pincett om mikrodissektionssax inte är tillgänglig. Var särskilt försiktig när du använder pincett för att säkerställa att hjärnvävnaden inte är översträckt under borttagning från nagelbandet eftersom mekanisk stress kommer att påverka hjärnans hälsa negativt. - Överför den dissekerade hjärnan till en brunn med dissektion och bildmedium. För avbildningsexperiment längre än 3 timmar, använd dissektion och bildmedium kompletterat med fettkroppar enligt beskrivningen ovan. Dissekera larverna i omgångar för att hålla dissektionstiden under 20 minuter.
5. Montering och avbildning (figur 4)
- För avbildning med membranbunden bild34:
- Samla både dissekerade hjärnor och isolerade fettkroppar i den sista brunnen i dissektionsskålen.
- Montera halva glaset genom att placera ett gasgenomsläppligt membran över baksidan av objektglaset och tryck in den delade ringen i mitten och håll den på plats (figur 4A-C).
- Använd en 200 μL mikropipett, överför upp till 10 dissekerade hjärnor och så mycket fettkropp som möjligt (se ovan) i ~ 130-140 μL dissektion och bildmedium till membranet. Se till att deponera mediet med proverna i mitten av det gasgenomsläppliga membranet (figur 4D, E).
- Orientera hjärnorna för populationen av NB som ska avbildas och för vilken typ av mikroskop som används (figur 4E). Placera provet så nära mikroskopets mål som möjligt. Till exempel, för att avbilda NB i de centrala hjärnloberna, orientera hjärnorna så att hjärnloberna är närmast målet (figur 4H).
- När hjärnorna är orienterade, placera försiktigt ett glastäcke ovanpå lösningen på membranet. Detta kommer att leda till att lösningen som innehåller hjärnor och fettkroppar sprids över hela membranet (figur 4F).
- Tappa överdriven lösning genom att hålla en laboratorievävnad nära täckkanten. Den optimala mängden lösning uppnås när hjärnorna vidrör täckglaset utan att klämmas. Om omorientering krävs i detta steg, flytta försiktigt täckglaset för att flytta hjärnorna.
- Immobilisera täckglaset genom att applicera smält vaselin längs kanterna på täckglaset med en pensel. Låt gelén stelna (figur 4G).
- För avbildning med en multibrunnsbild (bild 4):
- Tillsätt 400 μL bildmedium till en brunn i en flerbrunnsglas (i experimentet som utfördes här användes en kammare med 8 brunnar mikro [μ] -glid; Figur 4I). Överför de tidigare dissekerade fettkropparna till denna brunn (se steg 3.4).
- Deponera upp till 10 hjärnor i ett kluster nära mitten av brunnen (figur 4J).
- Orientera hjärnorna för populationen av NB som ska avbildas och för den typ av mikroskop som används, enligt beskrivningen i steg 5.1.4 (figur 4K). Ordna proverna så att de ligger nära varandra. Detta minimerar avståndet som steget måste flytta mellan prover, vilket minskar provdrift under förvärvet.
- När hjärnorna har orienterats i brunnen, låt hjärnorna nöja sig i 2-5 minuter. Detta ökar deras stabilitet under transport/avbildning. Förbered mikroskopet för förvärv under denna tid.
- Täck μ-bilden med glidskyddet och överför den till mikroskopet. Börja förvärvet med lägsta möjliga lasereffekt och exponeringstid för att minimera fotoblekning.
6. Bästa praxis för databehandling och hantering
- Bearbeta data efter behov enligt tillgänglig analysprogramvara.
- I exemplet som visas här sparar du inhämtade data med SlideBook-programvaran som en SlideBook-bildfil (.sld).
- För att konvertera till Imaris proprietära filtyp (.ims) med hjälp av Imaris File Converter, öppna Imaris File Converter i ett separat fönster. Klicka på och dra .sld-filerna till avsnittet "input" i Imaris File Converter.
- Bestäm önskad utmatningsplats för de konverterade filerna och klicka på "Starta alla."
- Efter konvertering, visa och kommentera data i Imaris-programvaran.
OBS: Alternativ för bildanalys kan användas istället för Imaris, såsom Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) eller andra.
- Behåll så mycket av originaldata som möjligt för korrekt registrering. Om förvärvsprogrammet till exempel sparas i ett filformat men konverteras till ett annat format för analys, behåller du den inhämtade versionen av data.
- För dataanalys bör du föra ett register med så många detaljer som möjligt om exempel- och förvärvsinställningarna. Viktig information att behålla inkluderar genotypen hos de dissekerade larverna, larvernas ålder före dissektion, tillståndet för den måltidslock de föddes i, lasereffekten som användes under avbildning, exponeringstiden, förvärvets längd och den tidsmässiga upplösningen.
7. Exempel på kvantifiering av cellcykellängd (figur 5)
OBS: i detta exempel avbildades larver som uttrycker polaritetsmarkören Pins (Pins::EGFP16) och det mikrotubulibindande proteinet Jupiter25 (körsbär::Jupiter13). Den efterföljande analysen utfördes med hjälp av Imaris programvara.
- Öppna filmen med valfri bildanalysprogramvara. Bläddra igenom filmens längd för att identifiera delande NB och märk dem för framtida referens. Identifiera de delande NB med hjälp av deras distinkta mitotiska spindlar (figur 5C-E).
- Identifiera ett referenscellcykelsteg för att bestämma cellcykellängden. I det här exemplet används metafas som referens.
- Bestäm manuellt antalet bildrutor mellan på varandra följande metafaser och konvertera det till minuter eller timmar för att bestämma hur lång tid det tar att slutföra en cellcykel.
- Gör detta genom att ta filmens tidsupplösning och multiplicera den med antalet bildrutor mellan metafaser. Till exempel, om filmens tidsupplösning är en bildruta var 5: e minut och metafaser observeras i bildruta 13 och ram 35, skulle tiden mellan dessa metafaser vara 110 min ([35 − 13] × 5).
- Plotta data med lämplig programvara. Uppgifterna som visas här plottades med hjälp av PRISM-programvara.
8. Exempel på kvantifiering av cellspindelns inriktning (figur 5)
OBS: I det här exemplet utförs analysen med hjälp av Imaris-programvaran.
- Öppna filmfilen i Imaris eller annan valfri programvara. Bläddra igenom filmens längd för att identifiera delande NB och märk dem för framtida referens.
- Bestäm vektorn som bildas av spindelpolerna med hjälp av apikala och basala centrosomer (representerade av m) enligt följande:
där Ax, Ay och Az är koordinaterna för den apikala centrosomen, och Bx, By och Bz är koordinaterna för den basala centrosomen. På liknande sätt bildas delningsvektorns axel (representerad av n) av mittpunkten för apikala stift::EGFP-halvmånen och basalcortexen:
där Ax, Ay och Az är koordinaterna för mittpunkten för stiften::EGFP halvmåne, och Bx, By och Bz är koordinaterna för mittpunkten för basala cortex. - Bestäm storleken på vektorerna m och n:
Storlek på m:
Magnitud på n:
- Bestäm punktprodukten (representerad av k) av m och n:
- Använd punktprodukten k och vektorstorlekarna m och n för att bestämma vinkeln mellan vektorerna:
- Plotta data i valfri programvara. De data som visas här har utarbetats i Microsoft Excel och visualiserats i PRISM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissektion och avbildning av central hjärnlob NBs som uttrycker Pins::EGFP och Cherry::Jupiter
För att visa upp detta protokoll, larver som uttrycker UAS-driven Cherry::Jupiter13 och endogent taggade Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Stift::EGFP/TM6B, Tb) avbildades i 4 timmar med hjälp av det beskrivna protokollet med hjälp av multi-well imaging slides (figur 5C,D). Ytterligare data togs från larver som uttrycker UAS-driven Cherry::Jupiter13 och endogent märkta Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), som avbildades i 10 timmar med hjälp av ett membranbundet glas (figur 5E,F). Larverna har fötts upp i burar enligt beskrivningen i avsnitt 1 i detta protokoll. När de nådde 72-96 h gamla dissekerades larverna (figur 3), monterades (figur 4) och avbildades. För experimenten som utfördes här användes en 561 nm laser vid 10% lasereffekt med 100 ms exponeringstid och en 488 nm laser användes vid 15% lasereffekt med 100 ms exponeringstid. Z-staplar (41 μm) förvärvades med en stegstorlek på 1 μm. Bilder togs var 5:e minut vid RT på ett Intelligent Imaging Innovations (3i) spinning disc confocal system, bestående av en Yokogawa CSU-W1 spinning disc-enhet och två Prime 95B Scientific CMOS-kameror. Ett 60x/1.4NA-oljefilter monterat på ett Nikon Eclipse Ti-mikroskop användes för avbildning. De levande avbildningsvoxelerna var 0,22 μm x 0,22 μm x 0,75 μm (60x / 1,4NA snurrskiva).
I överensstämmelse med tidigare rapporter16 bildade stiften en uttalad apikal halvmåne när de delade NB under mitos, och de mitotiska spindlarna anpassade sig konsekvent till denna apikala halvmåne (figur 5C). Cellcykelns längd bestämdes genom att mäta tiden mellan successiva metafaser av de enskilda NB (figur 5D,F).
I prover som avbildades på en bildglas med flera brunnar i 4 timmar utan fettkroppstillskott ökade cellcykellängden med ökande bildtid (figur 5C, D). Prover som avbildades i fettkroppskompletterat medium på ett membranbundet glas visade inte en ökning av cellcykellängden (figur 5E, F). Dessutom observerades NB med fyra divisioner på 10 timmars membranbundet glas (figur 5D jämfört med figur5F).
Slutligen bestämdes vinkeln mellan delningsaxeln och den mitotiska spindeln med hjälp av GFP-märkta stift som referens (schematisk visas i figur 5G). Delningsaxeln bestämdes genom att identifiera mittpunkten för den apikala halvmånen som bildades av stiften i mitos och halvera cellen i hälften (figur 5G, röd streckad linje). Som tidigare beskrivits uppvisade de vilda NB-enheterna mitotiska spindlar som inte var orienterade mer än 30° från delningsaxeln (Loyer och Januschke36 och figur 5H).
Figur 1: Material. (A) Dissektionsmikroskop. b) Uppsamlingsbur med flugor av önskad genotyp och en mössa med växande larver. (C) Dissektion och bildmedium, 5 ml. (D) Måltidsmössor med larver från tre olika samlingar. (E,E') Mikrodissektionsverktyg, från vänster till höger: mikrodissektion sax, pincett. (F,F') Dissektion maträtt. (G) En 8-brunns μ-glas för avbildning av proverna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på måltidsmössor. (A) Två injektionsflaskor med han- och honflugor som ska korsas, en tom embryouppsamlingsbur och en ny måltidslock. B) Botten av embryosamlingsburen med det nya mjöllocket (vänster) och toppen av buren med flugor (höger). c) Den färdigmonterade buren. (D) Ett exempel på en väl iscensatt måltidsmössa med larver för dissektion. Observera att maten störs av larverna, men inte störd. (E,F) Två exempel på 4 dagar gamla, överfulla måltidsmössor. Observera att den maten nu har en soppliknande konsistens. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Dissektion . (A) Ryggvy av en tredje instar larv. Den röda linjen på larvens bakre ände anger var det första snittet ska göras. (B) Ryggvy av larven efter avlägsnande av den bakre änden. (C) Diagram som visar hur man inverterar larven. Använd en uppsättning pincett och håll larven vid nagelbandet nära där det första snittet gjordes. Använd de andra pincetten, tryck in i larvens främre ände för att invertera. De svarta pilarna anger pincettens riktning, med en "skjuter in" larverna från den främre sidan och den andra flyttar den skurna bakre änden mot den främre änden. Den mindre röda pilen betecknar en tecknad film av feta kroppar. (D) Vy av en inverterad larv med fettkropparna och matsmältningskanalen fortfarande fästa. (E) Vy av en inverterad larv med icke-CNS-vävnaden borttagen. Den röda streckade linjen konturerar den fortfarande fästa hjärnan. (F) Schematisk bild av hur man tar bort hjärnan från nagelbanden. Den röda streckade linjen indikerar vägen att klippa med mikrodissektion sax för att frigöra hjärnan från den inverterade nagelbandet, och de svarta pilarna betecknar avlägsnandet av hjärnan från nagelbandet. (G) En bild av den inverterade hjärnan som fortfarande är fäst vid nagelbandet genom ett litet antal axonala anslutningar under den ventrala nervkabeln (VNC). (H) En isolerad larvhjärna. Hjärnloberna är skisserade med streckade orange linjer. (I) Isolerade fettkroppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Montering och avbildning. (A) Vy över komponenterna för montering av en membranbunden metallglid. b) En skiss över komponenterna i det membranbundna objektglaset och deras sammansättning. (C) Sidovy av membranet insatt i metallglaset, som hålls på plats av den delade metallringen. (D) Ovanifrån av den monterade bildrutschkanan utan täckglas. Dissektions- och avbildningsmediet som innehåller fettkroppar och dissekerade hjärnor har placerats på membranet. (E) Inzoomad vy av fettkroppar och hjärnor i droppen av medium. (F) Ovanifrån av metallbilden efter tillsats av glastäcket. (G) Ovanifrån av den monterade glasskivan med glastäcket fäst vid glaset med smält vaselin. Att täcka kanterna på täckglaset med vaselin förhindrar också avdunstning av mediet. (H) Schematisk bild av det sammansatta membranglaset med hjärnor orienterade för observation i ett inverterat mikroskop. De blå cirklarna betecknar NB i centrala hjärnloberna och VNC. (I) Vy av ett tomt flerbrunnsglas. (J) Inzoomad vy av en brunn i multibrunnsbildbilden. (K) Schematiskt som visar hjärnans orientering för avbildning av de centrala hjärnloberna på ett inverterat mikroskop med en flerbrunnsglas. De blå cirklarna betecknar NB i centrala hjärnloberna och VNC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kvantifiering av cellcykelns längd . (A) Diagram över en tredje instar larvhjärna, som markerar hjärnloberna, den optiska loben (OL, mörkgrå), den ventrala nervkabeln (VNC), NB (mörkblå), GMC (ljusblå) och neuroner (lila) inom de centrala hjärnloberna och VNC. b) Skiss över NB- och GMC-avdelningar. (C) Bildserie av en vildtyp NB med mikrotubuli märkta i vitt (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) och apikala Pins (Pins::EGFP i grönt) avbildade i en flerbrunnsbild utan fettkroppstillskott i 4 timmar. Sammanfogade bilder och motsvarande härstamningsträd med cellcykeltiming visas nedan. Skalstapel = 10 μm. (D) Kvantifiering av cellcykelns längd (metafas - metafas) för första, andra och tredje delningarna i prover avbildade på ett flerbrunnsglas utan fettkroppar. (E) Bildserie av en vildtyp NB med mikrotubuli märkta i vitt (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) avbildad med en membranbunden bild med fettkroppstillskott i 10 timmar med motsvarande härstamningsträd och cellcykeltiming som visas nedan. Skalstapel = 10 μm. (F) Kvantifiering av cellcykelns längd (metafas - metafas) för den första, andra, tredje och fjärde delningen i prover avbildade på ett membranbundet objektglas med fettkroppar. (G) Schematisk bild av hur vinkeln mellan spindelaxeln (orange streckad linje) och delningsaxeln (θ, röd streckad linje) bestämdes. (H) Kvantifiering av θ från 10 celler avbildade med hjälp av ett flerbrunnsglas utan fettkroppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt för avbildning av levande explanthjärnor från Drosophila melanogaster larver. Protokollet som beskrivs här gör det möjligt att observera explanthjärnor i 12-20 timmar under rätt experimentella förhållanden. Särskild hänsyn måste tas till beredningen av prover och utformningen av de önskade experimenten. Som nämnts ovan är en av de mest kritiska faktorerna som bestämmer kvaliteten på den dissekerade vävnaden larvernas hälsa. För att uppnå högsta möjliga kvalitet måste man se till att larverna matas väl före insamling. Ohälsosamma larver härrör oftast från överbeläggning. För att ta itu med detta måste man se till att överbeläggningen minimeras, antingen genom att öka skördefrekvensen eller genom att dela rätter med nylagda ägg med en tom maträtt.
Ett annat kritiskt element i detta protokoll är dissektionsmetoden för att isolera hjärnvävnaden. Hjärnan och NB inom dem är extremt känsliga för yttre faktorer, såsom dissektionsmediets temperatur och själva dissektionens invasivitet. Medium som är för kallt tenderar att depolymerisera mikrotubuli. På samma sätt kommer en dissektion som sträcker sig eller brister hjärnan att ha skadliga effekter på kvaliteten på NB: erna. För att förhindra detta bör man undvika att dra i hjärnvävnaden direkt och istället förankra dissektionsverktygen på nagelbandet eller annan vävnad. Mikrodissektion sax hjälper mycket i detta avseende, eftersom de minimalt drar på hjärnvävnaden. Om sax inte är tillgänglig kan pincett användas för att försiktigt ta bort anslutningsvävnaden mellan den ventrala nervkabeln och nagelbandet.
Detta protokoll presenterar två metoder för att montera larvhjärnor för konfokalmikroskopi. Ur teknisk synvinkel är montering av prover i en flerbrunnsglas enklare än montering på en membranbunden glid. Varje metod är dock bäst lämpad för olika typer av experiment. De data som visas här visar att för kortare filmer (dvs. mindre än 4 timmar) eller filmer med hög tidsupplösning (dvs. förvärva en z-stack var 10: e s) är avbildning i en flerbrunnsglas tillräcklig för att observera flera divisioner i larvens centrala hjärna. För längre förvärvsfönster är montering på en membranbunden bild idealisk, eftersom prover som förbereds på detta sätt delas oftare under hela filmen. Normalt delar sig larver av vildtyp en gång var 40-90 min13. Även om flerbrunnsglas kan användas för långa (> 4 timmar) filmer, har en ökning av cellcykellängden och en minskning av prolifererande NB observerats i detta tillstånd (figur 5D). Därför måste metoden som används för att montera prover och vilken typ av data som ska mätas beaktas vid utformningen av experiment.
Detta protokoll rekommenderar att avbilda flera hjärnor i en brunn eller bild, eftersom detta ökar effektiviteten i datainsamlingen för ett givet experiment. Orienteringen och placeringen av hjärnorna i brunnen kommer dock att påverka hur mycket förskjutning som sker under hela filmen på grund av att scenen rör sig mellan hjärnpositioner. Att samla hjärnorna på en central plats i en brunn minimerar problemet. Viss förskjutning kan dock inträffa under längre filmer i experiment med flerbrunnsbilder. I många fall är förskjutningen som observeras i dessa längre filmer minimal och kan korrigeras under analysen. Hjärnrörelser kan också förebyggas genom att använda en metallglidinställning eftersom kapillärkrafterna hindrar de dissekerade hjärnorna från att skifta.
Med en multi-well slide är det tekniskt möjligt att utföra multi-well imaging experiment. Detta kräver dock justeringar i stackstorleken och tidsupplösningen för att ta hänsyn till den extra tid som mikroskopet spenderar på att flytta mellan positioner. Detta kan vara fördelaktigt för storskaliga genetiska screeningexperiment, där man kan avbilda flera genotyper i olika brunnar.
Det finns fall där hjärnor kommer att visa lite eller inga delande NB under ett experiment. Detta beror sannolikt på flera faktorer som beror på vilken typ av prov som avbildas, kvaliteten på maten som används för att baka larverna, kvaliteten på dissektionen och förvärvsinställningarna som används för att generera data. Även om det är lämpligt att ta bort så mycket vävnad som möjligt när man förbereder larvhjärnor för avbildning, är det olämpligt att beskära hjärnan för att minimera mekanisk stress, eftersom detta kan påverka datakvaliteten negativt. Dessutom kommer frekvent exponering för kraftfulla bildlasrar att påverka neuroblasthälsan negativt. Därför bör man överväga att justera lasereffekten, exponeringstiden och bildfrekvensen när man samlar in bilddata.
För monteringsprover kan alternativa metoder användas. Till exempel kan explanthjärnor monteras i en fast matris37. Tillgängligheten av olika monteringsprotokoll ger möjlighet att avbilda larvhjärnexplantat på en mängd olika mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga finansiella upplysningar att deklarera.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av R35GM148160 (C. C.) och ett National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (RCS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C.
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
