Summary
Ici, nous discutons d’un flux de travail pour préparer, disséquer, monter et imager des cerveaux d’explants vivants de larves du troisième stade de Drosophila melanogaster afin d’observer la dynamique cellulaire et subcellulaire dans des conditions physiologiques.
Abstract
Les cellules souches neurales de la drosophile (neuroblastes, NBs ci-après) subissent des divisions asymétriques, régénérant le neuroblaste auto-renouvelant, tout en formant une cellule mère ganglionnaire différenciatrice (GMC), qui subira une division supplémentaire pour donner naissance à deux neurones ou glies. Des études sur les NB ont révélé les mécanismes moléculaires sous-jacents à la polarité cellulaire, à l’orientation du fuseau, à l’auto-renouvellement des cellules souches neurales et à la différenciation. Ces divisions cellulaires asymétriques sont facilement observables par imagerie de cellules vivantes, ce qui rend les NB larvaires idéales pour étudier la dynamique spatio-temporelle de la division cellulaire asymétrique dans les tissus vivants. Lorsqu’ils sont correctement disséqués et imagés dans un milieu enrichi en nutriments, les NB dans les cerveaux explantés se divisent vigoureusement pendant 12 à 20 heures. Les méthodes décrites précédemment sont techniquement difficiles et peuvent être difficiles pour ceux qui débutent dans le domaine. Ici, un protocole est décrit pour la préparation, la dissection, le montage et l’imagerie d’explants cérébraux larvaires vivants du troisième stade à l’aide de suppléments de corps gras. Les problèmes potentiels sont également discutés, et des exemples sont fournis sur la façon dont cette technique peut être utilisée.
Introduction
La division cellulaire asymétrique (DCA) est le processus par lequel les composants subcellulaires tels que l’ARN, les protéines et les organites sont répartis de manière inégale entre les cellules filles 1,2. Ce processus est couramment observé dans les cellules souches, qui subissent une DCA pour donner naissance à des cellules filles avec des destins de développement différents. Drosophile Les NB se divisent de manière asymétrique pour produire un NB, qui conserve sa souche, et une cellule mère ganglionnaire (GMC). Le GMC subit d’autres divisions pour produire des neurones différenciateurs ou glies3. Les NB à division asymétrique sont abondants dans le cerveau en développement des larves du troisième stade, qui sont facilement observées par microscopie. Au stade larvaire du troisième stade, il y a environ 100 NB présents dans chaque lobe central du cerveau 3,4,5,6.
La division cellulaire asymétrique est un processus très dynamique. Des protocoles d’imagerie de cellules vivantes ont été utilisés pour mesurer et quantifier la dynamique de la polarité cellulaire 7,8,9,10, l’orientation du fuseau 11,12,13, la dynamique du cortex actomyosine 14,15,16,17,18, la biologie des microtubules et des centrosomes 19,20,21,22,23,24,25,26,27, et membrane 10,28 et dynamique de la chromatine 29. Les descriptions qualitatives et quantitatives de la DCA reposent sur des méthodes et des protocoles robustes pour diviser les NB dans des cerveaux vivants intacts. Le protocole suivant décrit les méthodes de préparation, de dissection et d’imagerie des cerveaux larvaires du troisième stade pour l’imagerie de cellules vivantes in vivo à l’aide de deux approches de montage différentes. Ces méthodes conviennent mieux aux chercheurs qui s’intéressent à la dynamique spatio-temporelle des divisions de cellules souches, ainsi qu’aux divisions dans d’autres cellules du cerveau, car elles permettent d’observer des événements cellulaires à court et à long terme. De plus, ces techniques sont facilement accessibles aux nouveaux arrivants sur le terrain. Nous démontrons l’efficacité et l’adaptabilité de cette approche avec des cerveaux larvaires exprimant des microtubules marqués par fluorescence et des protéines de fusion corticale. Nous discutons également des méthodes d’analyse et des considérations pour l’application dans d’autres études.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE : La figure 1 montre les matériaux requis pour réaliser cette étude.
1. Considérations et préparatifs de l’expérience
- Empêchez les larves de surpeupler.
REMARQUE : La qualité des cerveaux larvaires d’explantation est directement liée à la santé et à la qualité des larves avant la dissection. Les larves qui souffrent de malnutrition à cause de la surpopulation produiront généralement des cerveaux de qualité inférieure30.- Assurez-vous qu’il n’y a pas plus de 20 à 30 larves par plat de chapeau de repas pour éviter la malnutrition. Des exemples de ceux-ci peuvent être vus dans la figure 2.
- Filtrer et aliquote le milieu de Schneider avant utilisation.
- Pour chaque dissection, préparer un nouveau milieu d’imagerie et de dissection en complétant le milieu insecte aliquote de Schneider avec du sérum de croissance bovine (BGS) à 1 %. Un volume de 5 mL de dissection et de milieu d’imagerie est habituellement suffisant pour une expérience d’imagerie.
- Réchauffer le milieu supplémenté à température ambiante (RT) avant utilisation.
- Tenez compte de la longueur du film à collecter et utilisez-la pour prendre en compte la supplémentation du support d’imagerie, l’approche de montage et les paramètres d’acquisition du microscope.
NOTE: Dans des conditions optimales, les NB dans les cerveaux supplémentés uniquement par BGS se diviseront vigoureusement pendant plus de 3 heures.- Complétez le milieu d’imagerie en ajoutant des tissus adipeux larvaires au milieu d’imagerie pour soutenir les divisions au-delà de 4 heures lors de la réalisation d’expériences nécessitant des films plus longs.
REMARQUE : Les corps adipeux sécrètent des mitogènes qui favorisent la proliférationNB 31, et les corps gras entiers de 10 larves sont suffisants pour soutenir quatre à cinq cerveaux. De plus, il a été démontré que les échantillons imagés avec une lame liée à la membrane se divisent pendant plus de 10 h13,32, tandis que les échantillons imagés avec une lame multipuits se divisent généralement moins souvent (observations non publiées). - Vous pouvez également mettre en œuvre un support d’imagerie plus complexe pour les films plus longs, comme décrit précédemment33. Minimisez les photodommages en ajustant le temps d’exposition, la puissance laser et la fréquence d’échantillonnage pour de meilleurs résultats.
- Complétez le milieu d’imagerie en ajoutant des tissus adipeux larvaires au milieu d’imagerie pour soutenir les divisions au-delà de 4 heures lors de la réalisation d’expériences nécessitant des films plus longs.
2. Mise en scène et collecte des larves (figure 2)
- Croisez des mouches vierges femelles âgées de 1 à 5 jours avec des mouches mâles adultes âgées de 1 à 7 jours pour produire une progéniture avec le génotype souhaité. Pour un rendement optimal, croisez 10-15 vierges femelles avec 5-10 mâles. Déposer ces mouches dans une cage à mouches munie d’un bouchon de repas (figure 2A-C) et incuber à 25 °C.
- Échangez le bouchon de repas tous les jours. Cela empêche les bouchons de repas de devenir surpeuplés de larves, ce qui réduit la qualité des cerveaux disséqués.
- Si le bouchon de farine est recouvert de larves (c.-à-d. >30), divisez-le en deux et remplacez-le par un bouchon de repas frais qui a également été coupé en deux. Sinon, échangez les bouchons de repas plus fréquemment (c.-à-d. toutes les 12 heures au lieu de toutes les 24 heures). Des exemples de bouchons de repas surpeuplés peuvent être vus à la figure 2E, F.
- Incuber le chapeau de farine avec les larves à 25 °C jusqu’à ce que les larves atteignent l’âge désiré.
3. Dissection larvaire du corps adipeux (figure 3)
NOTE: Ce protocole décrit les dissections utilisant une boîte de dissection à 3 puits.
- Pipeter ~400 μL de dissection et de milieu imageur dans chaque puits d’une boîte de dissection à 3 puits.
- Lavez dix larves de type sauvage bien nourries âgées de 72 à 96 heures en les tenant doucement avec des pinces à dissection et en les plongeant dans et hors de la solution de dissection dans le puits le plus bas jusqu’à ce que toutes les particules alimentaires aient été lavées. Après le rinçage, déplacez les larves propres vers le puits du milieu.
- À l’aide d’une pince à épiler, tenez la larve par les crochets buccaux. Avec l’autre pince à épiler, rupture d’un côté de la cuticule de la larve.
- Cette rupture provoquera le débordement des corps graisseux hors de la larve. Les corps gras sont blanc cassé et semi-translucides et auront une structure en forme de réseau (Figure 3I). Les corps gras auront également tendance à coller à eux-mêmes et aux pincettes à dissection. Une fois identifié, prélever autant de graisse que possible sur chaque larve et la transférer avec la pince au puits le plus haut avec 400 μL de milieu de dissection RT.
4. Curage cérébral larvaire (figure 3)
- Laver les larves expérimentales dans un milieu de dissection et d’imagerie comme ci-dessus pour les libérer des résidus alimentaires. Pour de meilleurs résultats, évitez de stocker les larves non disséquées dans la solution de dissection. Cela provoquera la « noyade » des larves et aura un impact négatif sur la qualité des cerveaux disséqués.
- À l’aide d’une pince à épiler, tenez la larve par les crochets buccaux. À l’aide d’une autre pince à épiler, coupez ou arrachez doucement environ 1/3 de la larve du côté postérieur (figure 3A). Cela fera éclater des éléments du tube digestif, des corps adipeux, du tissu conjonctif et du système nerveux du côté rompu de la larve (Figure 3B).
- À l’aide d’une pince à épiler, tenez la larve par les crochets buccaux. Avec l’autre pince à épiler, brossez doucement la cuticule vers les crochets buccaux tout en « poussant » vers l’intérieur avec la pince à épiler qui tient les crochets buccaux jusqu’à ce que toute la larve soit retournée à l’envers. Ce mouvement est similaire à tourner une chaussette « à l’envers » (Figure 3C, D).
- Inversez la larve de sorte que le système nerveux central et les autres tissus soient tournés vers l’extérieur tout en étant connectés à la cuticule. À cette étape, localisez le système nerveux central (SNC) pour éviter une ablation accidentelle. À l’aide d’une pince à épiler, retirez délicatement tout le tissu autre que le SNC, en ne laissant que le SNC et le cerveau attachés à la cuticule (figure 3E).
- Le cerveau sera attaché à la cuticule via des connexions axonales. À l’aide de ciseaux de microdissection, coupez ces connexions axonales pour libérer le cerveau de la cuticule. Pour ce faire, coupez d’abord doucement sous les lobes du cerveau (Figure 3F). Répétez avec les connexions sous le cordon nerveux ventral.
REMARQUE: Cette étape peut être effectuée avec une pince à épiler si les ciseaux de microdissection ne sont pas disponibles. Prenez des précautions particulières lors de l’utilisation d’une pince à épiler pour vous assurer que le tissu cérébral n’est pas trop étiré lors du retrait de la cuticule, car le stress mécanique affectera négativement la santé du cerveau. - Transférer le cerveau disséqué dans un puits avec dissection et milieu d’imagerie. Pour les expériences d’imagerie de plus de 3 heures, utiliser la dissection et le milieu d’imagerie complétés par des corps adipeux comme décrit ci-dessus. Disséquer les larves par lots pour maintenir le temps de dissection en dessous de 20 min.
5. Montage et imagerie (Figure 4)
- Pour l’imagerie avec une lame membranaire34 :
- Rassemblez à la fois les cerveaux disséqués et les corps graisseux isolés dans le dernier puits du plat de dissection.
- Assemblez la moitié de la lame en plaçant une membrane perméable aux gaz à l’arrière de la glissière et appuyez sur l’anneau fendu au centre, en le maintenant en place (Figure 4A-C).
- À l’aide d’une micropipette de 200 μL, transférer jusqu’à 10 cerveaux disséqués et autant de graisse que possible (voir ci-dessus) dans ~130-140 μL de dissection et de milieu d’imagerie à la membrane. Assurez-vous de déposer le milieu avec les échantillons au centre de la membrane perméable aux gaz (Figure 4D, E).
- Orientez les cerveaux en fonction de la population de NB à imager et du type de microscope utilisé (figure 4E). Placez l’échantillon aussi près que possible de l’objectif du microscope. Par exemple, pour imager les NB dans les lobes centraux du cerveau, orientez les cerveaux de manière à ce que les lobes cérébraux soient les plus proches de l’objectif (Figure 4H).
- Une fois que le cerveau est orienté, placez doucement une lamelle de verre sur le dessus de la solution sur la membrane. Cela provoquera la propagation de la solution contenant le cerveau et les corps adipeux sur l’ensemble de la membrane (Figure 4F).
- Éponger une solution excessive en tenant un mouchoir de laboratoire près du bord de la lame. La quantité optimale de solution est obtenue lorsque le cerveau touche la lamelle de couverture sans être écrasé. Si une réorientation est nécessaire à cette étape, déplacez délicatement la lamelle de couverture pour déplacer le cerveau.
- Immobiliser le bordereau de couverture en appliquant de la vaseline fondue le long des bords du bordereau de couverture avec un pinceau. Laisser la gelée se solidifier (Figure 4G).
- Pour l’imagerie avec une lame d’imagerie multipuits (Figure 4) :
- Ajouter 400 μL de milieu d’imagerie à un puits d’une lame multipuits (dans l’expérience réalisée ici, une micro[μ]-lame chambrée à 8 puits a été utilisée; Figure 4I). Transférer les corps graisseux précédemment disséqués dans ce puits (voir étape 3.4).
- Déposez jusqu’à 10 cerveaux dans un groupe près du centre du puits (Figure 4J).
- Orientez les cerveaux en fonction de la population de NB à imager et du type de microscope utilisé, tel que décrit à l’étape 5.1.4 (figure 4K). Disposez les échantillons de manière à ce qu’ils soient proches les uns des autres. Cela minimisera la distance que l’étage doit parcourir entre les échantillons, ce qui réduit la dérive de l’échantillon lors de l’acquisition.
- Une fois que les cerveaux ont été orientés dans le puits, laissez-les s’installer pendant 2 à 5 minutes. Cela augmente leur stabilité pendant le transport/l’imagerie. Préparez le microscope pour l’acquisition pendant ce temps.
- Couvrez la lame de μ avec le couvercle de la lame et transférez-la au microscope. Commencez l’acquisition avec la puissance laser et le temps d’exposition les plus faibles possibles pour minimiser le photoblanchiment.
6. Meilleures pratiques de traitement et de gestion des données
- Traiter les données selon les besoins selon le logiciel d’analyse disponible.
- Pour l’exemple présenté ici, enregistrez les données acquises avec le logiciel SlideBook en tant que fichier image SlideBook (.sld).
- Pour convertir en type de fichier propriétaire d’Imaris (.ims) à l’aide du convertisseur de fichiers Imaris, ouvrez le convertisseur de fichiers Imaris dans une fenêtre séparée. Cliquez sur et faites glisser les fichiers .sld dans la section " entrée " du convertisseur de fichiers Imaris.
- Déterminez l’emplacement de sortie souhaité pour les fichiers convertis, puis cliquez sur « Tout commencer ».
- Après la conversion, visualisez et annotez les données dans le logiciel Imaris.
REMARQUE: Des alternatives pour l’analyse d’images peuvent être utilisées à la place d’Imaris, telles que Fidji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) ou autres.
- Conservez autant de données originales que possible pour une bonne tenue des dossiers. Par exemple, si le logiciel d’acquisition est enregistré dans un format de fichier, mais est converti dans un format différent pour analyse, conservez la version acquise des données.
- Pour l’analyse des données, conservez un enregistrement d’autant de détails que possible sur les paramètres d’échantillonnage et d’acquisition. Les informations clés à retenir comprennent le génotype des larves disséquées, l’âge des larves avant la dissection, l’état du chapeau de farine dans lequel elles ont été élevées, la puissance laser utilisée pendant l’imagerie, le temps d’exposition, la durée d’acquisition et la résolution temporelle.
7. Exemple de quantification de la longueur du cycle cellulaire (Figure 5)
REMARQUE: dans cet exemple, les larves exprimant le marqueur de polarité Pins (Pins::EGFP16) et la protéine de liaison aux microtubules Jupiter25 (cherry::Jupiter13) ont été imagées. L’analyse ultérieure a été réalisée à l’aide du logiciel Imaris.
- Ouvrez le film à l’aide du logiciel d’analyse d’image de votre choix. Faites défiler la longueur du film pour identifier les NB qui se divisent et étiquetez-les pour référence future. Identifier les NB divisés par leurs fuseaux mitotiques distincts (figure 5C-E).
- Identifier une étape de cycle cellulaire de référence pour déterminer la durée du cycle cellulaire. Dans cet exemple, la métaphase est utilisée comme référence.
- Déterminez manuellement le nombre d’images entre les métaphases successives et convertissez-le en minutes ou en heures pour déterminer le temps nécessaire pour terminer un cycle cellulaire.
- Pour ce faire, prenez la résolution temporelle du film et multipliez-la par le nombre d’images entre les métaphases. Par exemple, si la résolution temporelle du film est d’une image toutes les 5 minutes et que des métaphases sont observées dans l’image 13 et l’image 35, le temps entre ces métaphases serait de 110 minutes ([35 − 13] × 5).
- Tracez les données avec n’importe quel logiciel approprié. Les données présentées ici ont été tracées à l’aide du logiciel PRISM.
8. Exemple de quantification de l’alignement de la broche cellulaire (Figure 5)
REMARQUE : Dans cet exemple, l’analyse est effectuée à l’aide du logiciel Imaris.
- Ouvrez le fichier vidéo dans Imaris ou un autre logiciel de votre choix. Faites défiler la longueur du film pour identifier les NB qui se divisent et étiquetez-les pour référence future.
- Déterminer le vecteur formé par les pôles fusiformes à l’aide des centrosomes apical et basal (représentés par m), comme suit:
où Ax, Ay et Az sont les coordonnées du centrosome apical, et Bx, By et Bz sont les coordonnées du centrosome basal. De même, l’axe du vecteur division (représenté par n) est formé par le point médian du croissant apical Pins::EGFP et le cortex basal:
où Ax, Ay et Az sont les coordonnées du point médian du croissant Pins::EGFP, et Bx, By et Bz sont les coordonnées du point médian du cortex basal. - Déterminer l’amplitude des vecteurs m et n :
Magnitude de m:
Magnitude de n :
- Déterminez le produit ponctuel (représenté par k) de m et n :
- À l’aide du produit ponctuel k et des magnitudes vectorielles m et n, déterminer l’angle entre les vecteurs:
- Tracez les données dans le logiciel de votre choix. Les données présentées ici ont été préparées dans Microsoft Excel et visualisées dans PRISM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissection et imagerie du lobe central du cerveau NBs exprimant Pins::EGFP et Cherry::Jupiter
Pour présenter ce protocole, les larves exprimant Cherry::Jupiter13 pilotées par UAS et marquées de manière endogène Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) ont été imagées pendant 4 heures à l’aide du protocole décrit à l’aide de lames d’imagerie multipuits (Figure 5C,D). Des données supplémentaires ont été prises à partir de larves exprimant Cherry::Jupiter13 piloté par UAS et marquées de manière endogène Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), qui ont été imagés pendant 10 h à l’aide d’une lame liée à la membrane (Figure 5E,F). Les larves ont été élevées dans des cages décrites à la section 1 du présent protocole. À l’âge de 72 à 96 h, les larves ont été disséquées (Figure 3), montées (Figure 4) et imagées. Pour les expériences réalisées ici, un laser de 561 nm a été utilisé à 10% de puissance laser avec 100 ms de temps d’exposition, et un laser de 488 nm a été utilisé à 15% de puissance laser avec 100 ms de temps d’exposition. Les piles en Z (41 μm) ont été acquises avec une taille de pas de 1 μm. Les images ont été acquises toutes les 5 minutes à RT sur un système confocal à disque rotatif Intelligent Imaging Innovations (3i), composé d’une unité de disque rotatif Yokogawa CSU-W1 et de deux caméras CMOS Prime 95B Scientific. Un objectif d’immersion dans l’huile 60x/1.4NA monté sur un microscope Nikon Eclipse Ti a été utilisé pour l’imagerie. Les voxels d’imagerie en direct étaient de 0,22 μm x 0,22 μm x 0,75 μm (disque rotatif 60x/1,4NA).
Conformément aux rapports précédents16, les épingles ont formé un croissant apical prononcé en divisant les NB pendant la mitose, et les fuseaux mitotiques se sont constamment alignés sur ce croissant apical (figure 5C). La longueur du cycle cellulaire a été déterminée en mesurant le temps entre les métaphases successives des NB individuels (Figure 5D,F).
Dans les échantillons qui ont été imagés sur une lame d’imagerie multipuits pendant 4 heures sans supplémentation corporelle graisseuse, la durée du cycle cellulaire augmentait avec l’augmentation du temps d’imagerie (Figure 5C,D). Les échantillons qui ont été imagés dans un milieu supplémenté en corps gras sur une lame liée à la membrane n’ont pas montré d’augmentation de la longueur du cycle cellulaire (Figure 5E, F). De plus, des NB avec quatre divisions ont été observés sur la lame membranaire de 10 h (figure 5D vs figure 5F).
Enfin, l’angle entre l’axe de division et la broche mitotique a été déterminé à l’aide de broches marquées GFP comme référence (schéma illustré à la figure 5G). L’axe de division a été déterminé en identifiant le point médian du croissant apical formé par les épingles en mitose et en divisant la cellule en deux (Figure 5G, ligne pointillée rouge). Comme décrit précédemment, les NB de type sauvage présentaient des fuseaux mitotiques qui n’étaient pas orientés à plus de 30° de l’axe de division (Loyer et Januschke36 et Figure 5H).
Figure 1 : Matériaux. (A) Microscope à dissection. (B) Cage de collecte contenant des mouches du génotype désiré et un chapeau de farine avec des larves en croissance. (C) Dissection et milieu d’imagerie, 5 mL. (D) Chapeaux de farine avec larves de trois collections différentes. (E,E') Outils de microdissection, de gauche à droite : ciseaux de microdissection, pinces. (F,F') Plat de dissection. (G) Une lame de μ à 8 puits pour l’imagerie des échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemples de capsules de repas. (A) Deux flacons avec des mouches mâles et femelles à croiser, une cage de collecte d’embryons vide et un bouchon de repas frais. (B) Le fond de la cage de collecte d’embryons avec le nouveau bonnet de repas (à gauche) et le haut de la cage avec les mouches (à droite). (C) La cage à mouches entièrement assemblée. (D) Un exemple de bouchon de repas bien mis en scène avec des larves pour la dissection. Notez que la nourriture est perturbée par les larves, mais pas trop perturbée. (E,F) Deux exemples de bouchons de repas surpeuplés vieux de 4 jours. Notez que cette nourriture a maintenant une consistance semblable à celle d’une soupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dissection. (A) Vue dorsale d’une larve du troisième stade. La ligne rouge à l’extrémité postérieure de la larve indique l’endroit où la première coupe doit être faite. (B) Vue dorsale de la larve après avoir enlevé l’extrémité postérieure. (C) Schéma montrant comment inverser la larve. À l’aide d’un jeu de pinces, tenez la larve par la cuticule près de l’endroit où la première coupe a été faite. À l’aide des autres pinces, appuyez sur l’extrémité antérieure de la larve pour l’inverser. Les flèches noires indiquent la direction des pinces, l’une « poussant » les larves du côté antérieur et l’autre déplaçant l’extrémité postérieure coupée vers l’extrémité antérieure. La plus petite flèche rouge désigne un dessin animé de corps gras. (D) Vue d’une larve inversée avec les corps adipeux et le tube digestif encore attachés. (E) Vue d’une larve inversée avec le tissu non SNC enlevé. La ligne pointillée rouge décrit le cerveau encore attaché. (F) Schéma montrant comment retirer le cerveau de la cuticule. La ligne pointillée rouge indique le chemin à couper avec des ciseaux de microdissection pour libérer le cerveau de la cuticule inversée, et les flèches noires indiquent l’enlèvement du cerveau de la cuticule. (G) Vue du cerveau inversé qui est encore attaché à la cuticule par un petit nombre de connexions axonales sous le cordon nerveux ventral (VNC). (H) Un cerveau larvaire isolé. Les lobes cérébraux sont soulignés de lignes orange pointillées. (I) Corps adipeux isolés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : montage et imagerie. (A) Vue des composants pour l’assemblage d’une lame métallique liée à la membrane. (B) Schéma des composants de la lame membranaire et de leur assemblage. (C) Vue latérale de la membrane insérée dans la glissière métallique, maintenue en place par l’anneau métallique fendu. (D) Vue de dessus de la lame d’imagerie assemblée sans lamelle de couverture. Le milieu de dissection et d’imagerie contenant des corps adipeux et des cerveaux disséqués a été placé sur la membrane. (E) Vue zoomée des corps gras et des cerveaux dans la goutte de milieu. (F) Vue de dessus de la glissière métallique après l’ajout de la lamelle de couverture en verre. (G) Vue de dessus de la glissière assemblée avec la lamelle de verre fixée à la glissière avec de la vaseline fondue. Couvrir les bords de la lamelle de couverture avec de la vaseline empêche également l’évaporation du milieu. (H) Schéma de la lame de membrane assemblée avec des cerveaux orientés pour l’observation sur un microscope inversé. Les cercles bleus indiquent les NB dans les lobes centraux du cerveau et VNC. (I) Vue d’une glissière vide à puits multiples. (J) Vue agrandie d’un puits de la diapositive d’imagerie multipuits. (K) Schéma montrant l’orientation du cerveau pour l’imagerie des lobes centraux du cerveau sur un microscope inversé avec une lame multipuits. Les cercles bleus indiquent les NB dans les lobes centraux du cerveau et VNC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Quantification de la durée du cycle cellulaire. (A) Schéma d’un cerveau larvaire du troisième stade, mettant en évidence les lobes cérébraux, le lobe optique (OL, gris foncé), le cordon nerveux ventral (VNC), les NB (bleu foncé), les GMC (bleu clair) et les neurones (violet) dans les lobes centraux du cerveau et VNC. (B) Schéma des divisions NB et GMC. (C) Série d’images d’un NB de type sauvage avec des microtubules marqués en blanc (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) et des épingles apicales (Pins::EGFP en vert) imagées dans une lame multipuits sans supplémentation corporelle grasse pendant 4 h. Les images fusionnées et l’arbre de lignée correspondant avec la synchronisation du cycle cellulaire sont indiqués ci-dessous. Barre d’échelle = 10 μm. (D) Quantification de la longueur du cycle cellulaire (métaphase - métaphase) pour les première, deuxième et troisième divisions dans des échantillons imagés sur une lame multipuits sans corps adipeux. (E) Série d’images d’un NB de type sauvage avec des microtubules marqués en blanc (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) imagée avec une lame membranaire avec supplémentation en corps gras pendant 10 h avec l’arbre de lignée correspondant et le calendrier du cycle cellulaire indiqués ci-dessous. Barre d’échelle = 10 μm. (F) Quantification de la longueur du cycle cellulaire (métaphase - métaphase) pour les première, deuxième, troisième et quatrième divisions dans des échantillons imagés sur une lame liée à la membrane avec des corps adipeux. (G) Schéma de la façon dont l’angle entre l’axe de la broche (ligne pointillée orange) et l’axe de division (θ, ligne pointillée rouge) a été déterminé. (H) Quantification de θ à partir de 10 cellules imagées à l’aide d’une lame multipuits sans corps adipeux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit une approche pour l’imagerie de cerveaux d’explants vivants provenant de larves de Drosophila melanogaster . Le protocole décrit ici permet d’observer les cerveaux d’explant pendant 12 à 20 h dans les bonnes conditions expérimentales. Une attention particulière doit être accordée à la préparation des échantillons et à la conception des expériences souhaitées. Comme mentionné ci-dessus, l’un des facteurs les plus critiques qui détermine la qualité du tissu disséqué est la santé des larves. Pour obtenir la meilleure qualité possible, il faut s’assurer que les larves sont bien nourries avant la collecte. Les larves en mauvaise santé proviennent le plus souvent de la surpopulation. Pour y remédier, il faut s’assurer que la surpopulation est minimisée, soit en augmentant la fréquence de la récolte, soit en divisant les plats avec des œufs fraîchement pondus avec un plat vide.
Un autre élément critique de ce protocole est la méthode de dissection pour isoler le tissu cérébral. Le cerveau et les NB qu’ils contiennent sont extrêmement sensibles aux facteurs extérieurs, tels que la température du milieu de dissection et le caractère invasif de la dissection elle-même. Un milieu trop froid aura tendance à dépolymériser les microtubules. De même, une dissection qui étire ou rompt le cerveau aura des effets néfastes sur la qualité des NB. Pour éviter cela, il faut éviter de tirer directement sur le tissu cérébral et plutôt ancrer les outils de dissection sur la cuticule ou un autre tissu. Les ciseaux de microdissection aident grandement à cet égard, car ils tirent le moins possible sur le tissu cérébral. Si les ciseaux ne sont pas disponibles, une pince à épiler peut être utilisée pour retirer soigneusement le tissu de connexion entre le cordon nerveux ventral et la cuticule.
Ce protocole présente deux méthodes pour monter des cerveaux larvaires pour la microscopie confocale. D’un point de vue technique, le montage d’échantillons dans une lame multipuits est plus simple que le montage sur une lame à membrane. Cependant, chaque méthode est la mieux adaptée à différents types d’expériences. Les données présentées ici démontrent que pour les films plus courts (c.-à-d. moins de 4 h) ou les films à haute résolution temporelle (c.-à-d. l’acquisition d’une pile z toutes les 10 s), l’imagerie dans une lame multipuits est suffisante pour observer plusieurs divisions dans le cerveau central larvaire. Pour les fenêtres d’acquisition plus longues, le montage sur une lame liée à la membrane est idéal, car les échantillons préparés de cette façon se divisent plus fréquemment tout au long du film. Normalement, les larves NB de type sauvage se divisent une fois toutes les 40 à 90 minutes13. Bien que les lames multipuits puissent être utilisées pour de longs films (> 4 heures), une augmentation de la durée du cycle cellulaire et une diminution de la prolifération des NB ont été observées dans cette condition (figure 5D). Par conséquent, la méthode utilisée pour monter les échantillons et le type de données à mesurer doivent être pris en compte lors de la conception des expériences.
Ce protocole recommande d’imager plusieurs cerveaux dans un puits ou une lame, car cela augmente l’efficacité de la collecte de données pour une expérience donnée. Cependant, l’orientation et le placement des cerveaux dans le puits affecteront le décalage qui se produit tout au long du film en raison du déplacement de l’étape entre les positions cérébrales. Regrouper les cerveaux en un seul endroit centralisé dans un puits minimise ce problème. Cependant, certains décalages peuvent se produire au cours de films plus longs dans des expériences utilisant des diapositives multi-puits. Dans de nombreux cas, le décalage observé dans ces films plus longs est minime et peut être corrigé au cours de l’analyse. Les mouvements cérébraux peuvent également être évités en utilisant une configuration de glissière métallique, car les forces capillaires empêchent les cerveaux disséqués de se déplacer.
Avec une lame multi-puits, il est techniquement possible d’effectuer des expériences d’imagerie multi-puits. Cependant, cela nécessite des ajustements de la taille de la pile et de la résolution temporelle pour tenir compte du temps supplémentaire passé par le microscope à se déplacer entre les positions. Cela peut être bénéfique pour les expériences de dépistage génétique à grande échelle, où l’on peut imager plusieurs génotypes dans différents puits.
Il y a des cas où les cerveaux afficheront peu ou pas de NB de division au cours d’une expérience. Cela est probablement dû à plusieurs facteurs qui dépendent de la nature de l’échantillon à imager, de la qualité de la nourriture utilisée pour élever les larves, de la qualité de la dissection et des paramètres d’acquisition utilisés pour générer les données. Bien qu’il soit conseillé d’enlever autant de tissu que possible lors de la préparation des cerveaux larvaires pour l’imagerie, il est mal avisé de trop tailler le cerveau pour minimiser le stress mécanique, car cela pourrait avoir un impact négatif sur la qualité des données. De plus, une exposition fréquente à de puissants lasers d’imagerie aura un impact négatif sur la santé des neuroblastes. Ainsi, il faut envisager d’ajuster la puissance du laser, le temps d’exposition et la fréquence d’imagerie lors de la collecte des données d’imagerie.
Pour le montage d’échantillons, d’autres méthodes peuvent être utilisées. Par exemple, les cerveaux d’explant peuvent être montés dans une matrice solide37. La disponibilité de différents protocoles de montage permet d’imager les explants cérébraux larvaires sur une grande variété de microscopes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation financière à déclarer.
Acknowledgments
Cette recherche est soutenue par R35GM148160 (C. C.) et une subvention de formation T32 GM007270 (R. C. S) des National Institutes of Health (NIH)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C.
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
