Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mikroinjektion af rekombinant RCAS(A)-retrovirus i embryonal kyllingelinse

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65727
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

Summary

Dette protokolpapir beskriver metoden til embryonal mikroinjektion af kyllingelinse af et RCAS(A) retrovirus som et værktøj til at studere in situ-funktion og ekspression af proteiner under linseudvikling.

Abstract

Embryonal kylling (Gallus domesticus) er en veletableret dyremodel til undersøgelse af linseudvikling og fysiologi på grund af dens høje grad af lighed med den menneskelige linse. RCAS (A) er et replikationskompetent kyllingeretrovirus, der inficerer delende celler, der fungerer som et kraftfuldt værktøj til at studere in situ-ekspression og funktion af vildtype- og mutantproteiner under linseudvikling ved mikroinjektion i det tomme lumen i linsevesikel i tidlige udviklingsstadier, hvilket begrænser dets virkning til omgivende prolifererende linseceller. Sammenlignet med andre tilgange, såsom transgene modeller og ex vivo-kulturer , giver brugen af et RCAS (A) replikationskompetent aviær retrovirus et yderst effektivt, hurtigt og tilpasseligt system til at udtrykke eksogene proteiner i kyllingembryoner. Specifikt kan målrettet genoverførsel begrænses til proliferative linsefiberceller uden behov for vævsspecifikke promotorer. I denne artikel vil vi kort gennemgå de trin, der er nødvendige for rekombinant retrovirus RCAS (A) forberedelse, give et detaljeret, omfattende overblik over mikroinjektionsproceduren og give prøveresultater af teknikken.

Introduction

Målet med denne protokol er at beskrive metoden til embryonal mikroinjektion af kyllingelinse af en RCAS (A) (replikationskompetent fuglesarkom / leukose retrovirus A). Effektiv retroviral levering i en embryonal kyllingelinse har vist sig at være et lovende værktøj til in vivo-undersøgelse af linseproteiners molekylære mekanisme og strukturfunktion i normal linsefysiologi, patologiske tilstande og udvikling. Desuden kan denne eksperimentelle model anvendes til identifikation af terapeutiske mål og lægemiddelscreening for tilstande som human medfødt grå stær. Alt i alt har denne protokol til formål at fastlægge de nødvendige trin til udvikling af en tilpasselig platform til undersøgelse af linseproteiner.

Embryonale kyllinger (Gallus domesticus) er på grund af deres lighed i linsestruktur og funktion med den menneskelige linse en veletableret dyremodel til undersøgelse af linseudvikling og fysiologi 1,2,3,4. Anvendelsen af et RCAS(A)-replikationskompetent fugleretrovirus er blevet betragtet som et yderst effektivt, hurtigt og tilpasseligt system til at udtrykke eksogene proteiner i kyllingembryoner. Det har navnlig en unik evne til at begrænse målgenoverførslen til proliferative linsefiberceller uden behov for vævsspecifikke promotorer ved hjælp af den unikke tidsramme for embryonal udvikling, inden for hvilken tilstedeværelsen af tomt linselumen tillader in situ RCAS(A)-mikroinjektion i det begrænsede sted til ekspression af eksogene proteiner i proliferative linsefiberceller5 6,7,8.

Chick embryo mikroinjektionsproceduren, beskrevet dybtgående her, er oprindeligt delvist baseret på Fekete et's arbejde. al.6 og videreudviklet af Jiang et. al.8 og er blevet anvendt som et middel til at indføre både virale og ikke-virale plasmider i linsen hos embryonale kyllinger 1,9,10,11,12,13. Samlet set demonstrerer det tidligere arbejde potentialet ved at udnytte denne metode til at studere linseudvikling, differentiering, cellulær kommunikation og sygdomsprogression og til opdagelse og test af terapeutiske mål for linsepatologiske tilstande såsom grå stær.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med dyrevelfærdsloven og gennemførelsesforordningerne om dyrevelfærd i overensstemmelse med principperne i vejledningen om pasning og brug af forsøgsdyr. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas Health Science Center i San Antonio. For en oversigt over protokollen, se figur 1; Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter, der anvendes i denne protokol.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel oversigt. 1 . Første trin i protokollen er bestemmelse af et eller flere specifikke målproteiner, identifikation af de(n) tilknyttede gensekvens(er) og generering af DNA-fragmenter. 2 . Kloning af gensekvensen/gensekvenserne til en retroviral vektor ved første kloning til en adaptervektor 3. efterfulgt af en viral vektor . 4 . Fremstilling af virale partikler med høj titer ved hjælp af emballageceller til høst og koncentrering. 5 . Det sidste trin og fokus for denne protokol er kyllingelinsemikroinjektionen af RCAS (A) virale partikler i linsens lumen. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Fremstilling af rekombinante retrovira med høj titer

  1. Polymerasekædereaktion (PCR) til fremstilling af målprotein-DNA-fragmenter
    BEMÆRK: Dette afsnit har til formål at forstærke DNA-sekvensen svarende til mållinseproteinet. For yderligere oplysninger, se 7,8.
    1. Design primere til PCR, svarende til det pågældende protein, til fremstilling af DNA-fragmenter med deres carboxyltermini in-frame med eller uden en FLAG-epitopsekvens (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), et stopcodon og et restriktionsenzymsted (dvs. EcoRI), der er til stede inde i polylinkerregionen CLa12NCO)) i henhold til specifikationerne i tidligere offentliggjorte protokoller med sekvenser for passende restriktionsenzymer1, 7,8,10,11.
    2. Udfør PCR-reaktionen10. Kombiner 100 pmol sense og antisense af de designede primere med 0,5 μg connexin cDNA (såsom Cx50, Cx43 eller kimære Cx50*43L kombinationer) til den valgte PCR-reaktionsbuffer. Der udføres 30 cyklusser bestående af 94 °C i 1 min, 58 °C i 1 minut og 72 °C i 1 min, efterfulgt af en endelig forlængelse i 10 minutter ved 72 °C.
    3. Isoler og rens PCR-produkter med et gelrensningssæt.
    4. Fordøje de rensede PCR-produkter ved hjælp af foretrukne restriktionsenzymer i henhold til producentens anvisninger.
  2. Kloning af DNA-indsatser i adaptorplasmid
    BEMÆRK: Indsættelse af DNA-fragmenter i en adaptervektor eliminerer behovet for hjælperceller/vira for at øge RCAS(A)-vektorstabiliteten14. For yderligere oplysninger, se 7,8.
    1. Subklon DNA-fragmenter i et adapterplasmid, Cla12NCO ved hjælp af en klæbrig ligeringsreaktion. Bland PCR-fragmenterne med restriktionsenzymer og Cla12NCO i forholdet 2-5: 1. Udfør ligering og DNA-transformation ved hjælp af kompetente celler.
    2. Isoler DNA ved hjælp af et DNA-isolationssæt.
    3. Sekvenser DNA'et for at sikre nøjagtighed.
  3. Kloning i RCAS (A) viral vektor
    BEMÆRK: DNA-fragmenter indsættes i et køretøj (RCAS (A) retrovirus) til stabil transduktion af et gen i celler i det udviklende kyllingembryo14,15. For flere detaljer, se 7,8,15.
    1. Fordøje Cla12NCO-DNA-fragmentet af interesseholdig vektor med ClaI (1 enhed pr. 1 μg DNA) og gelisoler fragmenterne.
    2. Subklon DNA-fragmenterne til et ClaI-lineariseret RCAS (A) plasmid. Brug restriktionsenzymet SalI til at skelne ClaI-stedet på RCAS (A) plasmidet.
    3. Bekræft den korrekte orientering af de indsatte fragmenter på konstruktionerne ved fordøjelse med ClaI- og SalI-restriktionsenzymer.
    4. Isoler DNA ved hjælp af et DNA-isolationssæt.
    5. Bestem DNA-koncentrationen.
  4. Transfektion af chick embryonal fibroblast (CEF) celler og RCAS (A) høst
    BEMÆRK: Viruspakningsceller, CEF'er, bruges til at opnå/høste cellekulturmedier, der indeholder virale partikler15,16. For flere detaljer, se 7,8,15.
    1. Transfekt CEF-celler med rekombinante retrovirale DNA-konstruktioner ved hjælp af transfektionsmidlet i henhold til producentens anvisninger.
    2. Udfør western blotting af de transfekterede celler for at undersøge deres udtryk for proteinet af interesse.
    3. Når de transfekterede celler når sammenløbet, begynder opsamling af supernatantsubstratet, bearbejdes/filtreres hensigtsmæssigt (for at fjerne celleaffald ved hjælp af et 0,22 μm filter) og opbevares ved -80 °C, indtil det er klar til koncentration.
  5. Koncentration og titering af virale stammer
    BEMÆRK: Pellet og store mængder medier, der stammer fra cellerne, der indeholder viruspartiklerne, skal filtreres. Derudover skal der udføres et viralt titerassay for at fastslå virusets styrke mod værtscellerne. For flere detaljer, se 6,7,8,15.
    1. Optø kulturmediet, der indeholder virionerne.
    2. Drej kulturmediet ved 72.000 × g i 2 timer ved 4 °C.
    3. Supernatanten deponeres, og viruspelletsen resuspenderes med restsubstratet (~50 μL) og opbevares ved -80 °C indtil brug i ~10 μL virale stammer.
    4. Til titering, ved anvendelse af enten QT-6- eller CEF-celler, transfekteres cellerne med en seriel fortynding af virusstammerne.
    5. Efter sammenflugt fastgøres cellerne ved hjælp af 4% formaldehyd.
    6. Immunostain til virale gagproteiner eller proces til alkalisk fosfatase histokemisk for at opnå titeren, defineret som (kolonidannende enheder) CFU pr. milliliter (CFU / ml).

Figure 2
Figur 2: Instrumenter og opsætning til mikroinjektion af chick lins . (A) P-30 manuel lodret mikroelektrode mikropipette trækker. (1) indsats, der viser en glasmikropipette, der trækkes. b) (2) Ægkuvøse. Inkuber kyllingæg i ~65-68 timer i en 37 °C inkubator for at nå trin 18 (med et forseglet, tomt centralt lumen) til injektion af retrovirus. (C) Opsætning af mikroinjektion. (3) belysningsudstyr, (4) Pico-injektor, (5) dissekermikroskop, (6) Drummond mikromanipulator, (7) computer / kamera til visualisering. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Chick linse mikroinjektion

  1. Klargøring af forsyninger
    1. Fremstilling af glasmikropipetter til mikroinjektion17
      BEMÆRK: Glaskapillærer bruges til at fremstille glasmikropipetter med et spidspunkt og en ydre diameter (OD) på ~ 11 μm til mikroinjektion. Opsætningen er vist i figur 2A.
      1. Fastgør borosilikatglaskapillæret til gummipolstrede clips i den manuelle lodrette mikropipetteaftrækker.
      2. Indstil varmetemperaturen (HEAT 1) til 950 °C, og udfør fortræk for at opnå en tyndere og blødere glaskapillær.
      3. Indstil varmetemperaturen (HEAT 2) til 790 °C, og udfør et sekundært træk for at producere de endelige mikropipetter.
      4. Med en mikropipettesliber skærpes spidsåbningen til en OD på ~ 11 μm.
      5. Til fremtidige eksperimenter skal glasmikropipetterne opbevares i en svampespændepude inde i en glasbeholder.
    2. Inkubation af befrugtede æg indtil udviklingsstadium 18
      BEMÆRK: Under linseudvikling, ved ~ 65-68 timers embryonal udvikling, adskiller linsen sig fra ektodermen og danner en forseglet vesikel med et centralt lumen; injektion i denne tomme linse lumen primes for begrænset ekspression til proliferative linseceller 7,8,18.
      1. Der inkuberes befrugtede kyllingæg i ~65-68 timer i en 37 °C befugtet gyngeinkubator (figur 2B).
  2. Åbning af kyllingæg
    BEMÆRK: Dette trin beskriver identifikation og eksponering af embryoet til mikroinjektion. For yderligere oplysninger, se 7,8.
    1. Tør arbejdsområdet grundigt af med 70% ethanol.
    2. Fjern æggene fra inkubatoren, sprøjt dem kraftigt ned med 70% ethanol, og lad dem lufttørre.
    3. Placer ægget med den største ende af ægget opad på en æggeholder.
    4. Brug et par skarptandede tang til at producere et hul på ~ 2 cm diameter på den større ende af ægget ved forsigtigt at banke på æggeskallen og fjerne fragmenter af æggeskallen (figur 3A).
    5. Brug et dissekerende mikroskop til at lokalisere embryoet.
    6. Når embryoet og kyllinglinsen er placeret, skal du bruge dissekeringsmikroskopet og findissekerende tang og saks til at afskære den amnioniske membran, der straks dækker toppen af embryoet (figur 3B).
      BEMÆRK: Skær ikke for bredt (kun nok til at udsætte embryoet ~ 0,5 cm x 0,5 cm), ellers kan embryonerne synke ned i æggeblommemassen; Undgå også at røre blodkarrene, hvis det er muligt.
    7. Dæk åbningen af ægget med en 60 mm petriskål som forberedelse til de næste trin.
  3. Mikroinjektion af koncentreret viralstamme
    BEMÆRK: Virale partikler, der indeholder målprotein-DNA-fragmenter til transduktion, indsættes i celler inde i linsens lumen. Opsætningen er vist i figur 2C. For flere detaljer, se 6,7,8.
    1. Optø de virale aktielagre på is.
    2. Til visualisering af virusstammen under injektion fortyndes 1 μL 10x Fast green i et hætteglas med viral stamme indeholdende 10 μL.
    3. For at sikre, at der ikke er store klumper af uopløst materiale, der kan tilstoppe glasmikropipetten, centrifugeres opløsningerne i 10 s ved 10.000 × g ved 4 °C for at pelletere "store stykker" og overføre supernatanterne til nye rør, alt imens opløsningerne holdes på is.
    4. På en 35 mm x 10 mm kulturskål anbringes en strakt laboratorieparafilm, og der tilsættes 1 μL sterilt saltvand (PBS) oven på filmen (ikke-steriliseret, idet den dækkede side betragtes som "ren").
    5. Tilslut en forberedt glasmikropipette til en automatisk pico-injektor.
    6. Tryk på påfyldningstilstanden for at fylde det sterile saltvand (PBS) i en glasmikropipette, og brug derefter injektionstilstanden til at teste den tildelte 1 μL væske.
    7. Placer en anden strakt laboratorieparafilm på overfladen af en ny 35 mm x 10 mm cellekulturskål, og tilsæt 1 μL hurtige grønfarvede virale lagre oven på filmen.
    8. Sænk spidsen af mikropipetten ned i virusstammen, og tryk på påfyldningsmodellen for at fylde glasmikropipetten med ~1 μL viralt lager.
      BEMÆRK: For at undgå udtørring sættes spidsen af den fyldte mikropipette i sterilt saltvand (PBS), når der er en pause i proceduren.
    9. Sænk den fyldte glasmikropipette, der er forbundet til en automatisk injektor, ned i målområdet for embryolinsens lumen ved hjælp af et dissekerende mikroskop.
    10. Juster lyskilden for at sikre klar visualisering af omridset af objektivvesiklen.
      BEMÆRK: Lumen i højre linse (opadvendt) bruges typisk til injektion, og venstre (nedadvendt) holdes intakt som en kontralateral kontrol.
    11. Når du er sikker på, at placeringen af mikropipetten er inden for det korrekte sted inde i linsens lumen, injiceres 5-40 nL af virusstammen (figur 3C).
      BEMÆRK: Øvelse er meget nødvendig for optimal injektionsplacering.
    12. Vent i ~45 sek., og fjern derefter forsigtigt glasmikropipetten.
    13. Kontroller for den vellykkede mikroinjektion i linselumen ved hjælp af dissekeringsmikroskopet ved at undersøge Fast Green farvestof, der skal forblive i objektivets tomme lumen uden lækage.
    14. Efter injektionsproceduren forsegles æggeskalsåbningen med scotch tape.
    15. Embryoet sættes tilbage i den befugtede inkubator ved 37 °C uden roterende bevægelse, indtil den ønskede fosteralder er nået for linsedissektion.

Figure 3
Figur 3: Microinjection chick prep og skematisk . (A) Åbning af et kyllingæg. (B) Skæring af fosterhinden. (C) Lumen mikroinjektion af kyllingelinse skematisk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter bestemmelse af et eller flere specifikke målproteiner og identifikation af de(n) tilknyttede gensekvens(er) indebærer den overordnede eksperimentelle tilgang kloning af gensekvensen/gensekvenserne til en retroviral RCAS(A)-vektor ved den indledende kloning til en adaptervektor efterfulgt af en viral vektor. For det andet fremstilles virale partikler med høj titer ved hjælp af emballageceller til at høste og koncentrere virionerne. Disse to første vigtige trin er stort set blevet beskrevet, og repræsentative resultater præsenteret andetsteds 6,7,8,14,16.

For denne protokol er hovedfokusområdet trinnet med mikroinjektion. Det er bydende nødvendigt at bestemme succesen af in situ-mikroinjektionen af RCAS(A)-viruspartikler, der indeholder DNA-fragmenter af det pågældende proteinmål, både på injektionstidspunktet og efter linseisolering. Figur 4 viser et billede af objektivets lumen før og efter injektion af de virale vektorer farvet med Fast Green til visualisering og bekræftelse af den korrekte lokalisering i objektivets lumen. Fast Green er et farvestof med en høj grad af sikkerhed og er godkendt af US Food and Drug Administration som et farveadditiv, der bruges til at farve mad, medicin og kosmetik19.

Figur 5 viser den histologiske evaluering gennem immunofluorescens af målproteinet, det kimære connexin Cx50*43L, som blev indført i rekombinante retrovirus med høj titer, mikroinjiceret i linsens lumen og evalueret. Da C-termini af de kimære connexiner var epitop-tagget med FLAG-sekvenser, blev anti-flag-mærkning brugt til at identificere de eksogene konnexiner fra de endogene ved hjælp af standardfarvningsmetode med sagittale og koronale sektioner (sagittal vist her), som beskrevet i Liu et al.10 Selvom Cx50 * 43L er lokaliseret på plasmamembranen på grund af orienteringen af de fremstillede vævssektioner, Det ser ud til at lokalisere inde i linsen i visse regioner. I denne undersøgelse blev interaktionen mellem det intercellulære loopdomæne af Cx50 og AQP0 evalueret og farvet i overensstemmelse hermed10.

Figure 4
Figur 4: Eksempel på mikroinjektion i kyllingelinsens lumen. (A) Forinjektion i linsens lumen. (B) Efter injektion i objektivets lumen. Pil = injektionssted. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Mikroinjektion og histologisk evaluering. På trin 18 af embryonal udvikling, som er ~ 65-68 timer embryonal udvikling, blev en mikroinjektion af rekombinante retrovirus indeholdende kimær Cx50 * 43L mutant udført i det tomme lumen af en kyllinglinse. Vi undersøgte kryosektioner af kyllingelinser dissekeret på embryonal dag 18, som blev immunmærket med FLAG (grøn) og AQP0 (rød) antistoffer. Fluorescein-konjugeret anti-mus IgG blev brugt til at detektere primære antistoffer mod anti-FLAG, mens rhodamin-konjugeret anti-kanin IgG blev brugt til at detektere primære antistoffer mod anti-AQP0. Visualiseringen af immunfarvning blev udført ved anvendelse af konfokal fluorescensmikroskopi. De tilsvarende flettede billeder, mærket som "Flettet", kan ses til højre. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne eksperimentelle model giver mulighed for at udtrykke proteinet (e) af interesse i den intakte linse, hvilket fører til undersøgelsen af disse proteiners funktionelle relevans i linsestruktur og funktion. Den embryonale chick mikroinjektionsmodel er delvist baseret på Fekete et's arbejde. al.6 og blev videreudviklet af Jiang et. al.8 og er blevet anvendt som et middel til at indsætte både virale plasmider og midler såsom agonister, lille interfererende RNA (siRNA) og peptider i linsen på kyllinger 1,9,10,11,12,13. Denne platform er ideel til at undersøge de mekanismer, der udløser sygdomsudvikling sammen med test af mulige lægemiddelmål for linsepatologiske tilstande såsom medfødt grå stær. Efterhånden som vores forståelse af linsepatologiske tilstande forbedres, og genetiske eller erhvervede mutationer identificeres, giver denne omkostningseffektive dyremodel mulighed for at studere de underliggende mekanismer omkring udviklingen af disse tilstande eller resultater af mutationer, hvilket kan hjælpe med at imødekomme det store medicinske behov for ikke-kirurgiske og pålidelige behandlingsregimer for linsetilstande1. Derudover tilbyder dette system et in vivo-system til karakterisering af vildtype- og muterede proteiner med hensyn til proteinsamling og aggregering, som for nylig beskrevet 1,11. Denne model kunne anvendes til bred brug ud over linsen.

RCAS(A) er et replikationskompetent fugleretrovirus8. Dens anvendelse i kombination med en embryonal kyllingelinse (en veletableret dyremodel til undersøgelse af linseudvikling og fysiologi 1,2,3,4) betragtes som et unikt og effektivt middel til at udtrykke eksogene proteiner i kyllingembryoner. I betragtning af den unikke chick embryonale udviklingstidslinje og struktur med linsen på udviklingsstadium 18 (~ 65-68 timer embryonal udvikling), der adskiller sig fra ektodermen og danner en forseglet vesikel med et centralt lumen, primer dette for mikroinjektionen i dette tomme linselumen for at begrænse ekspression til proliferative linseceller 7,8,18. Selvom det mest er en styrke til vores formål, er det også især en begrænsning, da det på grund af arten af den retrovirale injektion kun er proliferative celler, der ændres gennem denne metode. Transfektion (injektion) af retrovirus er ikke et forbigående udtryk, og eksogene gener inkorporeres i genomet. Denne genleveringsmetode er meget effektiv, og tidligere data viser, at næsten alle proliferative celler kan inficeres 8,10. Især viste vores tidligere undersøgelser, at mikroinjektion alene ikke forårsager tilsyneladende skade på linsen som bestemt af linsemorfologi og manglende dannelse af grå stær på injektionsstedet1.

I modsætning til denne tilgang kan in vitro-tilgange, der bruger dyrkede linseceller, anvendes, men er begrænset til rekapitulation af de tidlige stadier af linsefiberudvikling 20,21,22,23,24. Derudover er ex vivo linseeksplanteringssystemer også blevet brugt i vid udstrækning som et middel til at studere linsedifferentiering og kataractogenese25,26. Denne model og relaterede linsekapselkulturer27, selvom de er kraftfulde, er forenklede kulturmodeller, som har begrænsninger og kompleksiteter afhængigt af deres tilsigtede anvendelse24,26. Brugen af transgene tilgange i enten muse- eller kyllingelinse har haft forskellige begrænsninger, idet murinlinsen ikke deler væsentlige ligheder med den menneskelige linse 1,2,3,4, og kyllingelinser har haft begrænsninger i effektivitet og stabilitet28.

Ved udførelse af protokollen skal der udvises stor omhu for at sikre tilstrækkelig amplifikation af DNA-fragmenter, retrovirus-tittering, transfektion og steril forberedelse af virale stammer, fordi bakteriel og gærforurening i mikroinjektion kan forårsage dødelighed for kyllingembryoner7. For selve mikroinjektionen er kritiske trin den korrekte lokalisering af kyllingens embryo og linse sammen med placeringen af mikropipetten i linsens lumen, og der skal udvises omhyggelig opmærksomhed for ikke at overfylde linsekapslen under injektionen. Generelt bør praksis udføres med omhyggelig notation af anatomiske steder, og ekstra æg bør forberedes til eksperimentet for at tage højde for fejl. Anomalier under mikroinjektionsprocessen, såsom utilsigtet brud på blodkarrene, bør noteres, og brugen af disse embryoner bør undgås. Derudover bør RCAS retrovirale system holdes i tankerne, såsom dets evne til at skabe ektopisk ekspression af et gen uden for et bestemt vindue eller sted, manglende let regulering af ekspressionsniveauet, og endelig er der begrænsninger for størrelsen af insertet, især >2 kb15,29. Endelig skal man være omhyggelig med at vælge tidspunktet for evalueringen. I dette eksperiment valgte vi op til embryonal dag 18, som er tæt på ægklækning, for at bestemme den samlede virkning af eksogen genekspression på intakt linse. Efter injektion er rugehastigheden meget lav, og de fleste embryoner kan ikke overleve på grund af forstyrrelse af vitellinmembranen.

Afslutningsvis præsenterer brugen af denne RCAS (A) kyllingelinsemikroinjektionsmodel et yderst effektivt, hurtigt og tilpasseligt system til at udtrykke eksogene proteiner for at muliggøre design og ekspression af proteiner til at adressere deres funktion i linsefysiologi og udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (til J.X.J) og F32DK134051 (til FMA) og Welch Foundation tilskud: AQ-1507 (til J.X.J.). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Figurerne blev delvist skabt med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Filter Corning 431118 For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish FisherScientific 50-202-030 For using during microinjection
Centrifuge Fisherbrand 13-100-676 Spinning down solution
Constructs GENEWIZ - For generation of constructs
Dissecting microscope AmScope SM-4TZ-144A Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers Integrated DNA Technologies - Generation of primers:

Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-50WY Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen For cell culture
Egg Holder - - Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator GQF Manufacturing Company Inc. 1502 For incubation of fertilized eggs
Fast Green Fisher scientific F99-10 For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs Texas A&M University N/A Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone Laboratories For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-095-003 For anti-FLAG  1:500
Forceps FisherScientific 22-327379 For moving things around and isolation
Glass capillaries Sutter Instruments B100-75-10 Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine Invitrogen L3000001 For transfection
Manual vertical micropipette puller Sutter Instruments P-30 To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes FisherScientific 02-682-004 Dissolving solution
Microscope Keyence BZ-X710 For imaging staining
Parafilm FisherScientific 03-448-254 Placing solution
Penicillin/Streptomycin Invitrogen For cell culture
Pico-Injector Harvard Apparatus PLI-100 For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0 Self generated - Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody Rockland Immunichemicals 600-401-383 For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch 111-295-003 For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad Sutter Instruments BX10 For storage of glass micropipette

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
  2. Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
  3. Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
  4. McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
  5. Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
  6. Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
  7. Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
  8. Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
  9. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
  10. Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
  11. Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
  12. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
  13. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
  14. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  15. Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
  16. Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
  17. Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  19. Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
  20. Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
  21. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
  23. Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
  24. Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
  25. West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
  26. Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
  27. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
  28. Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
  29. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).

Tags

Mikroinjektion rekombinant RCAS(A) retrovirus embryonal kylling linseudvikling fysiologi dyremodel in situ-ekspression mutante proteiner tidlige udviklingsstadier linsevesikel prolifererende linseceller transgene modeller ex vivo-kulturer fugleretrovirus målrettet genoverførsel proliferative linsefiberceller
Mikroinjektion af rekombinant RCAS(A)-retrovirus i embryonal kyllingelinse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acosta, F. M., Ma, B., Gu, S.,… More

Acosta, F. M., Ma, B., Gu, S., Jiang, J. X. Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens. J. Vis. Exp. (199), e65727, doi:10.3791/65727 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter