Summary
Dit protocoldocument beschrijft de methodologie van embryonale micro-injectie van een RCAS(A)-retrovirus met kippenlenzen als een hulpmiddel voor het bestuderen van de in situ functie en expressie van eiwitten tijdens de ontwikkeling van lenzen.
Abstract
Embryonale kip (Gallus domesticus) is een gerenommeerd diermodel voor de studie van lensontwikkeling en fysiologie, gezien de hoge mate van gelijkenis met de menselijke lens. RCAS(A) is een replicatiecompetent kippenretrovirus dat delende cellen infecteert, wat dient als een krachtig hulpmiddel om de in situ expressie en functie van wildtype en mutante eiwitten tijdens de ontwikkeling van de lens te bestuderen door micro-injectie in het lege lumen van het lensblaasje in vroege ontwikkelingsstadia, waardoor de werking ervan wordt beperkt tot de omliggende prolifererende lenscellen. Vergeleken met andere benaderingen, zoals transgene modellen en ex vivo culturen, biedt het gebruik van een RCAS(A)-replicatiecompetent aviair retrovirus een zeer effectief, snel en aanpasbaar systeem om exogene eiwitten in kuikenembryo's tot expressie te brengen. In het bijzonder kan gerichte genoverdracht worden beperkt tot proliferatieve lensvezelcellen zonder dat er weefselspecifieke promotors nodig zijn. In dit artikel geven we een kort overzicht van de stappen die nodig zijn voor de bereiding van recombinant retrovirus RCAS(A), geven we een gedetailleerd, uitgebreid overzicht van de micro-injectieprocedure en geven we voorbeeldresultaten van de techniek.
Introduction
Het doel van dit protocol is het beschrijven van de methodologie van embryonale micro-injectie met kippenlenzen van een RCAS(A) (replicatiecompetent aviair sarcoom/leukose retrovirus A). Effectieve retrovirale toediening in een embryonale kippenlens is een veelbelovend hulpmiddel gebleken voor de in vivo studie van het moleculaire mechanisme en de structuur-functie van lenseiwitten in de fysiologie, pathologische omstandigheden en ontwikkeling van normale lenzen. Bovendien zou dit experimentele model kunnen worden gebruikt voor de identificatie van therapeutische doelwitten en het screenen van geneesmiddelen voor aandoeningen zoals aangeboren staar bij de mens. Al met al is dit protocol bedoeld om de nodige stappen uit te stippelen voor de ontwikkeling van een aanpasbaar platform voor de studie van lenseiwitten.
Embryonale kuikens (Gallus domesticus) zijn, vanwege hun gelijkenis in lensstructuur en functie met de menselijke lens, een gerenommeerd diermodel voor de studie van lensontwikkeling en fysiologie 1,2,3,4. Het gebruik van een RCAS(A)-replicatiecompetent aviair retrovirus wordt beschouwd als een zeer effectief, snel en aanpasbaar systeem om exogene eiwitten tot expressie te brengen in kuikenembryo's. Het heeft met name een uniek vermogen om de doelgenoverdracht te beperken tot proliferatieve lensvezelcellen zonder de noodzaak van weefselspecifieke promotors, gebruikmakend van het unieke embryonale ontwikkelingstijdsbestek waarin de aanwezigheid van leeg lenslumen in situ RCAS(A)-micro-injectie in de beperkte plaats mogelijk maakt voor de expressie van exogene eiwitten in proliferatieve lensvezelcellen5, 6,7,8.
De micro-injectieprocedure voor kuikenembryo's, die hier uitgebreid wordt beschreven, is oorspronkelijk gedeeltelijk gebaseerd op het werk van Fekete et. al.6 en verder ontwikkeld door Jiang et. al.8 en is gebruikt als een middel om zowel virale als niet-virale plasmiden in de lens van embryonale kuikens te introduceren 1,9,10,11,12,13. Over het algemeen toont het eerdere werk het potentieel aan van het gebruik van deze methodologie om de ontwikkeling, differentiatie, cellulaire communicatie en ziekteprogressie van lenzen te bestuderen, en voor het ontdekken en testen van therapeutische doelen voor lenspathologische aandoeningen zoals staar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de Wet dierenwelzijn en de Uitvoeringsregeling dierenwelzijn volgens de principes van de Handreiking verzorging en gebruik van proefdieren. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Health Science Center van de Universiteit van Texas in San Antonio. Voor een overzicht van het protocol, zie figuur 1; zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
Figuur 1: Experimenteel overzicht. 1 . De eerste stap van het protocol is de bepaling van een of meer specifieke doeleiwitten, de identificatie van de bijbehorende gensequentie(n) en het genereren van DNA-fragmenten. 2 . Klonering van de gensequentie(n) in een retrovirale vector door initiële klonering in een adaptervector, 3. gevolgd door een virale vector . 4 . Bereiding van virale deeltjes met een hoge titer met behulp van verpakkingscellen om te oogsten en te concentreren. 5 . De laatste stap, en de focus van dit protocol, is de micro-injectie van de RCAS(A)-virusdeeltjes in het lenslumen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Bereiding van recombinante retrovirussen met een hoge titer
- Polymerasekettingreactie (PCR) om DNA-fragmenten van doeleiwitten te maken
OPMERKING: Deze sectie is bedoeld om de DNA-sequentie te amplificeren die overeenkomt met het doellenseiwit. Voor meer details, zie 7,8.- Ontwerp primers voor PCR, overeenkomend met het eiwit van belang, om DNA-fragmenten te maken met hun carboxyl-termini in frame met of zonder een FLAG-epitoopsequentie (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), een stopcodon en een restrictie-enzymplaats (d.w.z. EcoRI) aanwezig in het polylinkergebied van CLa12NCO)) volgens de specificaties die zijn vermeld in eerder gepubliceerde protocollen, met sequenties voor adequate restrictie-enzymen1, 7,8,10,11.
- Voer de PCR-reactie10 uit. Combineer 100 pmol sense en antisense van de ontworpen primers met 0,5 μg connexine cDNA (zoals Cx50, Cx43 of chimere Cx50*43L-combinaties) tot de PCR-reactiebuffer naar keuze. Voer 30 cycli uit, elk bestaande uit 94 °C gedurende 1 min, 58 °C gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlenging gedurende 10 minuten bij 72 °C.
- Isoleer en zuiver PCR-producten met een gelzuiveringskit.
- Verbeter de gezuiverde PCR-producten met behulp van restrictie-enzymen naar keuze volgens de instructies van de fabrikant.
- Klonen van DNA-inserts in adaptorplasmide
OPMERKING: Het inbrengen van DNA-fragmenten in een adaptervector elimineert de noodzaak voor helpercellen/virussen om de stabiliteit van de RCAS(A)-vector te verhogen14. Voor meer details, zie 7,8.- Subkloon DNA fragmenteert in een adapterplasmide, Cla12NCO met behulp van een kleverige ligatiereactie. Meng de PCR-fragmenten met restrictie-enzymen en Cla12NCO in een verhouding van 2-5:1. Voer ligatie en DNA-transformatie uit met behulp van competente cellen.
- Isoleer DNA met behulp van een DNA-isolatiekit.
- Sequentie van het DNA om nauwkeurigheid te garanderen.
- Klonen in de RCAS(A) virale vector
OPMERKING: DNA-fragmenten worden ingebracht in een vehiculum (RCAS(A)-retrovirus) voor de stabiele transductie van een gen in cellen in het zich ontwikkelende kuikenembryo14,15. Voor meer details, zie 7,8,15.- Verwerk het Cla12NCO-DNA-fragment van belangbevattende vector met ClaI (1 eenheid per 1 μg DNA) en gel-isoleer de fragmenten.
- Subkloon de DNA-fragmenten in een ClaI-gelineariseerd RCAS(A)-plasmide. Gebruik het restrictie-enzym SalI om de ClaI-plaats op het RCAS(A)-plasmide te onderscheiden.
- Bevestig de juiste oriëntatie van de ingebrachte fragmenten op de constructen door vertering met ClaI- en SalI-restrictie-enzymen.
- Isoleer DNA met behulp van een DNA-isolatiekit.
- Bepaal de DNA-concentratie.
- Transfectie van kuikenembryonale fibroblastcellen (CEF) en RCAS(A)-oogst
OPMERKING: Virusverpakkingscellen, CEF's, worden gebruikt om celkweekmedia te verkrijgen/oogsten die virale deeltjesbevatten 15,16. Voor meer details, zie 7,8,15.- Transfecte CEF-cellen met recombinante retrovirale DNA-constructen met behulp van het transfectiemiddel volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer western blotting uit van de getransfecteerde cellen om hun expressie van het eiwit van belang te onderzoeken.
- Wanneer de getransfecteerde cellen samenvloeiing bereiken, begint u met het verzamelen van het supernatantmedium, het op de juiste manier verwerken/filteren (om cellulair afval te verwijderen met behulp van een filter van 0,22 μm) en bewaren bij -80 °C totdat het klaar is voor concentratie.
- Concentratie en titering van virale voorraden
OPMERKING: De pellet en grote hoeveelheden media afkomstig van de cellen die de virale deeltjes bevatten, moeten worden gefilterd. Bovendien moet een virale titertest worden uitgevoerd om de sterkte van het virus tegen de gastheercellen vast te stellen. Voor meer details, zie 6,7,8,15.- Ontdooi de kweekmedia die de virionen bevatten.
- Centrifugeer de voedingsbodems op 72.000 × g gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Decanteer het supernatans en resuspendeer de virale pellet met het resterende (~50 μL) medium en bewaar bij -80 °C tot gebruik, in ~10 μL virale voorraden.
- Voor titeren, met behulp van QT-6- of CEF-cellen, transfecteert u de cellen met een seriële verdunning van de virale voorraden.
- Na confluentie fixeert u de cellen met 4% formaldehyde.
- Immunokleuring voor virale gag-eiwitten of proces voor alkalische fosfatase histochemisch om de titer te verkrijgen, gedefinieerd als (kolonievormende eenheden) CFU per milliliter (CFU/ml).
Figuur 2: Instrumenten en opstelling voor micro-injectie van kuikenslenzen . (A) P-30 handmatige verticale micro-elektrode micropipettrekker. (1) inzet waarop een glazen micropipet wordt getrokken die wordt getrokken. (b) (2) Broedmachine. Broed kippenei gedurende ~65-68 uur uit in een incubator van 37 °C om stadium 18 te bereiken (met een verzegeld, leeg centraal lumen) voor injectie van retrovirus. (C) Opstelling met micro-injectie. (3) verlichtingsapparatuur, (4) Pico-Injector, (5) ontleedmicroscoop, (6) Drummond micromanipulator, (7) computer/camera voor visualisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Micro-injectie van kuikenlens
- Voorbereiding van benodigdheden
- Bereiding van glazen micropipetten voor micro-injectie17
OPMERKING: Glazen capillairen worden gebruikt om glazen micropipetten te maken met een tippunt en een buitendiameter (OD) van ~11 μm voor micro-injectie. De opstelling is weergegeven in figuur 2A.- Bevestig het capillair van borosilicaatglas aan de met rubber beklede clips in de handmatige verticale micropipettrekker.
- Stel de warmtetemperatuur (HEAT 1) in op 950 °C en voer een voortrekken uit om een dunner en zachter glascapillair te verkrijgen.
- Stel de warmtetemperatuur (HEAT 2) in op 790 °C en trek secundair om de uiteindelijke micropipetten te produceren.
- Slijp met een micropipetmolen de puntopening tot een buitendiameter van ~11 μm.
- Bewaar de glazen micropipetten voor toekomstige experimenten in een sponsklemkussen in een glazen pot.
- Incubatie van bevruchte eicellen tot ontwikkelingsstadium 18
OPMERKING: Tijdens de ontwikkeling van de lens, bij ~65-68 uur embryonale ontwikkeling, scheidt de lens zich van het ectoderm en vormt een afgesloten blaasje met een centraal lumen; Injectie in dit lege lenslumen primeert voor beperkte expressie tot proliferatieve lenscellen 7,8,18.- Bevruchte kippeneieren gedurende ~65-68 uur uitbroeden in een bevochtigde schommelbroedmachine van 37 °C (Figuur 2B).
- Bereiding van glazen micropipetten voor micro-injectie17
- Opening van het kippenei
OPMERKING: Deze stap beschrijft de identificatie en blootstelling van het embryo voor micro-injectie. Voor meer details, zie 7,8.- Veeg het werkgebied grondig af met 70% ethanol.
- Haal de eieren uit de broedmachine, spuit ze zwaar in met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen.
- Leg het ei, met het grotere uiteinde van het ei naar boven, op een eierhouder.
- Maak met een pincet met scherpe tanden een gat met een diameter van ~2 cm aan het grotere uiteinde van het ei door voorzichtig op de eierschaal te tikken en fragmenten van de eierschaal te verwijderen (Figuur 3A).
- Gebruik een ontleedmicroscoop om het embryo te lokaliseren.
- Zodra het embryo en de kuikenlens zijn gelokaliseerd, gebruikt u de ontleedmicroscoop en een fijne ontleedtang en schaar om het vruchtwater af te snijden dat onmiddellijk de bovenkant van het embryo bedekt (Figuur 3B).
OPMERKING: Snijd niet te ver (alleen genoeg om het embryo ~ 0,5 cm x 0,5 cm bloot te leggen), anders kunnen de embryo's in de dooiermassa zinken; Vermijd indien mogelijk ook het aanraken van bloedvaten. - Bedek de opening van het ei met een petrischaaltje van 60 mm ter voorbereiding op de volgende stappen.
- Micro-injectie van geconcentreerde virale voorraad
OPMERKING: Virale deeltjes die DNA-fragmenten van doeleiwitten voor transductie bevatten, worden ingebracht in cellen in het lenslumen. De opstelling is weergegeven in figuur 2C. Voor meer details, zie 6,7,8.- Ontdooi de virale voorraadvoorraden op ijs.
- Voor visualisatie van de virale voorraad tijdens injectie, verdunt u 1 μL van 10x Fast green in één injectieflacon met virale voorraad die 10 μL bevat.
- Om er zeker van te zijn dat er geen grote brokken onopgelost materiaal zijn die de glazen micropipet kunnen verstoppen, centrifugeert u de oplossingen gedurende 10 s bij 10.000 × g bij 4 °C om "grote brokken" te pelleteren en de supernatanten over te brengen in nieuwe buizen, terwijl de oplossingen op ijs blijven.
- Plaats op een kweekschaal van 35 mm x 10 mm een uitgerekte laboratoriumparafilm en voeg 1 μL steriele zoutoplossing (PBS) toe aan de film (niet-gesteriliseerd, waarbij de afgedekte kant als "schoon" wordt beschouwd).
- Sluit een geprepareerde glazen micropipet aan op een automatische pico-injector.
- Druk op de vulmodus om de steriele zoutoplossing (PBS) in een glazen micropipet te vullen en gebruik vervolgens de injectiemodus om de toegewezen 1 μL vloeistof te testen.
- Plaats een tweede uitgerekte laboratoriumparafilm op het oppervlak van een nieuwe celkweekschaal van 35 mm x 10 mm en voeg 1 μL Fast groen gekleurde virale voorraden toe aan de film.
- Laat de punt van de micropipet in de virale voorraad zakken en druk op het vulmodel om de glazen micropipet te vullen met ~1 μL virale voorraad.
NOTITIE: Om uitdroging te voorkomen, plaatst u de punt van de gevulde micropipet in steriele zoutoplossing (PBS) wanneer er een pauze in de procedure is. - Laat de gevulde glazen micropipet, aangesloten op een automatische injector, met behulp van een ontleedmicroscoop in het doelgebied van het lumen van de embryolens zakken.
- Pas de lichtbron aan om een duidelijke visualisatie van de omtrek van het lensblaasje te garanderen.
OPMERKING: Het lumen van de rechterlens (naar boven gericht) wordt meestal gebruikt voor injectie en het linker (naar beneden gericht) wordt intact gehouden als contralaterale controle. - Zodra u er zeker van bent dat de micropipet op de juiste plaats in het lenslumen is geplaatst, injecteert u 5-40 nL van de virale voorraad (Figuur 3C).
OPMERKING: Oefening is zeer noodzakelijk voor een optimale plaatsing van de injectie. - Wacht ~45 s en verwijder dan voorzichtig de glazen micropipet.
- Controleer met behulp van de ontleedmicroscoop of de micro-injectie in het lenslumen is gelukt door Fast Green-kleurstof te onderzoeken die zonder lekkage in het lege lumen van de lens moet blijven.
- Sluit na de injectieprocedure de opening van de eierschaal af met plakband.
- Breng het embryo terug naar de 37 °C bevochtigde couveuse, zonder draaiende beweging, totdat de gewenste embryonale leeftijd is bereikt voor lensdissectie.
Figuur 3: Voorbereiding van kuikens met micro-injectie en schema . (A) Opening van een kippenei. (B) Doorsnijden van het vruchtwater. (C) Kippenlens lumen micro-injectie schema. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de bepaling van een of meer specifieke doeleiwitten en de identificatie van de bijbehorende gensequentie(n), omvat de algemene experimentele benadering het klonen van de gensequentie(s) in een retrovirale RCAS(A)-vector door het initiële klonen in een adaptorvector, gevolgd door een virale vector. Ten tweede worden virale deeltjes met een hoge titer bereid met behulp van verpakkingscellen om de virionen te oogsten en te concentreren. Deze eerste twee belangrijke stappen zijn grotendeels beschreven en representatieve resultaten zijn elders gepresenteerd 6,7,8,14,16.
Voor dit protocol is het belangrijkste aandachtsgebied de stap van micro-injectie. Het is absoluut noodzakelijk om het succes te bepalen van de in situ micro-injectie van RCAS(A)-virale deeltjes die DNA-fragmenten van het eiwitdoelwit van belang bevatten, zowel op het moment van injectie als na lensisolatie. Figuur 4 toont een afbeelding van het lenslumen voor en na injectie van de virale vectoren geverfd met Fast Green voor visualisatie en ter bevestiging van de juiste lokalisatie in het lenslumen. Fast Green is een kleurstof met een hoge mate van veiligheid en is door de Amerikaanse Food and Drug Administration goedgekeurd als kleuradditief dat wordt gebruikt om voedsel, medicijnen en cosmetica te kleuren19.
Figuur 5 toont de histologische evaluatie door middel van immunofluorescentie van het doeleiwit, het chimere connexine Cx50*43L, dat werd geïntroduceerd in recombinante retrovirussen met een hoge titer, micro-geïnjecteerd in het lenslumen en geëvalueerd. Aangezien de C-termini van de chimere connexines epitoop-gelabeld waren met FLAG-sequenties, werd anti-flag-labeling gebruikt om de exogene connexines te identificeren van de endogene, met behulp van standaard kleuringsmethodologie, met sagittale en coronale secties (sagittaal hier getoond), zoals beschreven in Liu et al.10 Hoewel Cx50*43L gelokaliseerd is op het plasmamembraan, vanwege de oriëntatie van de voorbereide weefselsecties, Het lijkt in bepaalde regio's in de lens te lokaliseren. In deze studie werd de interactie tussen het intercellulaire lusdomein van Cx50 en AQP0 geëvalueerd en dienovereenkomstig gekleurd10.
Figuur 4: Voorbeeld van micro-injectie in het lumen van de kippenlens . (A) Voorinjectie in het lumen van de lens. (B) Na injectie in lenslumen. Pijl = injectieplaats. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Micro-injectie en histologische evaluatie. In stadium 18 van de embryonale ontwikkeling, dat is ~65-68 uur van de embryonale ontwikkeling, werd een micro-injectie van recombinante retrovirussen met chimere Cx50*43L-mutant gedaan in het lege lumen van een kuikenlens. We onderzochten de cryosecties van kuikenlenzen die op embryonale dag 18 waren ontleed, die immunogelabeld waren met FLAG (groen) en AQP0 (rood) antilichamen. Fluoresceïne-geconjugeerd anti-muis IgG werd gebruikt om primaire antilichamen tegen anti-FLAG te detecteren, terwijl rhodamine-geconjugeerd anti-konijn IgG werd gebruikt om primaire antilichamen tegen anti-AQP0 te detecteren. De visualisatie van immunokleuring werd gedaan met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie. De bijbehorende samengevoegde afbeeldingen, gelabeld als "Samengevoegd", zijn aan de rechterkant te zien. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit experimentele model biedt de mogelijkheid om het eiwit of de eiwitten van belang tot expressie te brengen in de intacte lens, wat leidt tot de studie van de functionele relevantie van deze eiwitten in de structuur en functie van de lens. Het embryonale kuiken-micro-injectiemodel is gedeeltelijk gebaseerd op het werk van Fekete et. al.6 en werd verder ontwikkeld door Jiang et. al.8 en is gebruikt als een middel om zowel virale plasmiden als middelen zoals agonisten, klein interfererend RNA (siRNA) en peptiden in de lens van kuikens in te brengen 1,9,10,11,12,13. Dit platform is ideaal voor het onderzoeken van de mechanismen die de ontwikkeling van ziekten veroorzaken, naast het testen van mogelijke medicijndoelen voor lenspathologische aandoeningen zoals aangeboren staar. Naarmate ons begrip van lenspathologische aandoeningen verbetert en genetische of verworven mutaties worden geïdentificeerd, maakt dit kosteneffectieve diermodel het mogelijk om de onderliggende mechanismen rond de ontwikkeling van deze aandoeningen of uitkomsten van mutaties te bestuderen, wat kan helpen bij het aanpakken van de grote medische behoefte aan niet-chirurgische en betrouwbare behandelingsregimes voorlensaandoeningen1. Bovendien biedt dit systeem een in vivo systeem om wild-type en gemuteerde eiwitten te karakteriseren met betrekking tot eiwitassemblage en -aggregatie, zoals onlangs beschreven 1,11. Dit model kan worden toegepast voor breed gebruik buiten de lens.
RCAS(A) is een replicatiecompetent aviair retrovirus8. Het gebruik ervan, in combinatie met een embryonale kippenlens (een gerenommeerd diermodel voor de studie van lensontwikkeling en fysiologie 1,2,3,4), wordt beschouwd als een uniek en effectief middel om exogene eiwitten tot expressie te brengen in kuikenembryo's. Gezien de unieke tijdlijn en structuur van de embryonale ontwikkeling van het kuiken, waarbij de lens, in ontwikkelingsstadium 18 (~65-68 uur embryonale ontwikkeling), zich scheidt van het ectoderm en een afgesloten blaasje vormt met een centraal lumen, bereidt dit zich voor op de micro-injectie in dit lege lenslumen om de expressie te beperken tot proliferatieve lenscellen 7,8,18. Hoewel het vooral een sterk punt is voor ons doel, is het ook met name een beperking, aangezien vanwege de aard van de retrovirale injectie alleen proliferatieve cellen door deze methodologie worden veranderd. De transfectie (injectie) door retrovirussen is geen voorbijgaande expressie en exogene genen worden in het genoom opgenomen. Deze benadering van genafgifte is zeer effectief en eerdere gegevens tonen aan dat bijna alle proliferatieve cellen kunnen worden geïnfecteerd 8,10. Met name onze eerdere studies toonden aan dat micro-injectie alleen geen duidelijke schade aan de lens veroorzaakt, zoals bepaald door de morfologie van de lens en het ontbreken van cataractvorming op het punt van injectie1.
In tegenstelling tot deze benadering kunnen in vitro benaderingen met behulp van gekweekte lenscellen worden gebruikt, maar deze zijn beperkt tot de recapitulatie van de vroege stadia van de ontwikkeling van lensvezels 20,21,22,23,24. Daarnaast zijn ex vivo lensexplantatiesystemen ook op grote schaal gebruikt als middel om lensdifferentiatie en cataractogenese te bestuderen25,26. Dit model en verwante lenscapsuleculturen27, hoewel krachtig, zijn simplistische kweekmodellen, die beperkingen en complexiteit hebben, afhankelijk van hun beoogde toepassing24,26. Het gebruik van transgene benaderingen in muizen- of kippenlenzen heeft verschillende beperkingen gehad, waarbij de muizenlens geen substantiële overeenkomsten vertoont met de menselijke lens 1,2,3,4, en kippenlenzen beperkingen hebben gehad in efficiëntie en stabiliteit28.
Bij het uitvoeren van het protocol moet grote zorg worden besteed aan adequate amplificatie van DNA-fragmenten, retrovirustittering, transfectie en steriele bereiding van virale voorraden, omdat bacteriële en gistbesmetting bij micro-injectie dodelijkheid kan veroorzaken voor kuikenembryo's7. Voor de micro-injectie zelf zijn de cruciale stappen de juiste lokalisatie van het kuikenembryo en de lens, naast het plaatsen van de micropipet in het lenslumen, en er moet zorgvuldig op worden gelet dat het lenskapsel tijdens de injectie niet te vol raakt. In het algemeen moet worden geoefend met een zorgvuldige notatie van anatomische plaatsen en moeten extra eieren worden voorbereid voor het experiment om rekening te houden met fouten. Afwijkingen tijdens het micro-injectieproces, zoals het per ongeluk scheuren van bloedvaten, moeten worden opgemerkt en het gebruik van die embryo's moet worden vermeden. Bovendien moet rekening worden gehouden met beperkingen van het RCAS-retrovirale systeem, zoals het vermogen om ectopische expressie van een gen buiten een bepaald venster of locatie te creëren, gebrek aan gemakkelijke regulering van het expressieniveau, en ten slotte zijn er beperkingen aan de grootte van de insert, met name >2 kb15,29. Ten slotte moet worden gelet op de keuze van het tijdstip van evaluatie. In dit experiment selecteerden we tot embryonale dag 18, die dicht bij het uitkomen van de eieren ligt, om de algehele impact van exogene genexpressie op intacte lens te bepalen. Na injectie is de uitkomstsnelheid erg laag en de meeste embryo's kunnen niet overleven vanwege verstoring van het vitelline-membraan.
Concluderend presenteert het gebruik van dit RCAS(A)-micro-injectiemodel voor kippenlenzen een zeer effectief, snel en aanpasbaar systeem om exogene eiwitten tot expressie te brengen om het ontwerp en de expressie van eiwitten mogelijk te maken om hun functie in lensfysiologie en -ontwikkeling aan te pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder dat er commerciële of financiële relaties zijn die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (aan J.X.J) en F32DK134051 (aan FMA), en Welch Foundation grant: AQ-1507 (aan J.X.J.). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. De figuren zijn gedeeltelijk gemaakt met Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | - | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | - | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | - | - | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | - | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
References
- Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
- Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
- Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
- McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
- Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
- Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
- Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
- Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
- Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
- Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Yan, R. T., Wang, S. Z.
- Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
- Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
- Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
- Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
- West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
- Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
- Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
- Hughes, S. H.
