Summary
Este trabalho de protocolo descreve a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um retrovírus RCAS(A) como uma ferramenta para estudar a função in situ e a expressão de proteínas durante o desenvolvimento do cristalino.
Abstract
A galinha embrionária (Gallus domesticus) é um modelo animal bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e fisiologia do cristalino, dado o seu alto grau de similaridade com o cristalino humano. RCAS(A) é um retrovírus de galinha competente em replicação que infecta células em divisão, que serve como uma ferramenta poderosa para estudar a expressão in situ e a função de proteínas selvagens e mutantes durante o desenvolvimento do cristalino por microinjeção no lúmen vazio da vesícula do cristalino nos estágios iniciais de desenvolvimento, restringindo sua ação às células do cristalino em proliferação circundantes. Em comparação com outras abordagens, como modelos transgênicos e culturas ex vivo , o uso de um retrovírus aviário competente em replicação RCAS(A) fornece um sistema altamente eficaz, rápido e personalizável para expressar proteínas exógenas em embriões de pintinhos. Especificamente, a transferência gênica direcionada pode ser confinada a células de fibras proliferativas do cristalino sem a necessidade de promotores tecido-específicos. Neste artigo, faremos uma breve visão geral das etapas necessárias para a preparação de RCAS(A) de retrovírus recombinante, forneceremos uma visão geral detalhada e abrangente do procedimento de microinjeção e forneceremos resultados de amostra da técnica.
Introduction
O objetivo deste protocolo é descrever a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um RCAS(A) (replication-competente avian sarcoma/leukosis retrovirus A). A liberação retroviral efetiva em uma lente de frango embrionária tem se mostrado uma ferramenta promissora para o estudo in vivo do mecanismo molecular e da função-estrutura das proteínas do cristalino na fisiologia normal do cristalino, condições patológicas e desenvolvimento. Além disso, esse modelo experimental poderia ser utilizado para a identificação de alvos terapêuticos e triagem medicamentosa para condições como catarata congênita humana. Ao todo, esse protocolo visa estabelecer as etapas necessárias para o desenvolvimento de uma plataforma customizável para o estudo das proteínas do cristalino.
Pintos embrionários (Gallus domesticus), devido à sua semelhança na estrutura e função do cristalino com o cristalino humano, são um modelo animal bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e fisiologia do cristalino 1,2,3,4. O uso de um retrovírus aviário com competência em replicação RCAS(A) tem sido considerado um sistema altamente eficaz, rápido e personalizável para expressar proteínas exógenas em embriões de pintinhos. Notavelmente, ele tem uma capacidade única de confinar a transferência do gene alvo às células de fibra do cristalino proliferativo sem a necessidade de promotores tecido-específicos, usando o período de tempo de desenvolvimento embrionário único no qual a presença de lúmen vazio do cristalino permite a microinjeção in situ de RCAS(A) no local restrito para a expressão de proteínas exógenas dentro de células de fibras proliferativas do cristalino5, 6,7,8.
O procedimento de microinjeção de embrião de pintinho, descrito em profundidade aqui, é originalmente parcialmente baseado no trabalho de Fekete et. al.6 e desenvolvido por Jiang et. al.8 e tem sido utilizada como meio de introdução de plasmídeos virais e não virais no cristalino de pintos embrionários 1,9,10,11,12,13. Em geral, o trabalho anterior demonstra o potencial da utilização desta metodologia para estudar o desenvolvimento do cristalino, diferenciação, comunicação celular e progressão da doença, e para a descoberta e teste de alvos terapêuticos para condições patológicas do cristalino, como catarata.
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Protocol
Este estudo foi conduzido em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos de Implementação de Bem-Estar Animal de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio. Para obter uma visão geral do protocolo, consulte a Figura 1; consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
Figura 1: Delineamento experimental. 1 . O primeiro passo do protocolo é a determinação de uma(s) proteína(s) alvo(s) específica(s), a identificação da(s) sequência(s) gênica(s) associada(s) e a geração de fragmentos de DNA. 2 . Clonagem da(s) sequência(s) genética(s) em um vetor retroviral por clonagem inicial em um vetor adaptador, 3. seguida de um vetor viral . 4 . Preparação de partículas virais de alto título usando células de embalagem para colheita e concentração. 5 . A etapa final, e o foco deste protocolo, é a microinjeção das partículas virais RCAS(A) no lúmen do cristalino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Preparação de retrovírus recombinantes de alto título
- Reação em cadeia da polimerase (PCR) para produzir fragmentos de DNA da proteína alvo
NOTA: Esta seção tem como objetivo amplificar a sequência de DNA correspondente à proteína alvo da lente. Para mais detalhes, ver 7,8.- Projetar primers para PCR, correspondentes à proteína de interesse, para fazer fragmentos de DNA com seu termini carboxila no quadro com ou sem uma sequência de epítopos FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), um códon de parada e um sítio de enzima de restrição (ou seja, EcoRI) presente dentro da região poliligante de CLa12NCO)) de acordo com as especificações observadas em protocolos publicados anteriormente, com sequências para enzimas de restrição adequadas1, 7,8,10,11.
- Realizar a reação de PCR10. Combine 100 pmol de sentido e antisenso dos primers projetados com 0,5 μg de cDNA conexina (como combinações Cx50, Cx43 ou Cx50*43L quiméricas) ao tampão de reação de PCR de escolha. Realizar 30 ciclos cada um consistindo de 94 °C por 1 min, 58 °C por 1 min e 72 °C por 1 min, seguidos por uma extensão final por 10 min a 72 °C.
- Isolar e purificar produtos de PCR com um kit de purificação em gel.
- Digerir os produtos de PCR purificados usando enzimas de restrição de escolha de acordo com as instruções do fabricante.
- Clonagem de inserções de DNA em plasmídeo adaptador
NOTA: A inserção de fragmentos de DNA em um vetor adaptador elimina a necessidade de células/vírus auxiliares para aumentar a estabilidade do vetor RCAS(A)14. Para mais detalhes, ver 7,8.- Subclone fragmentos de DNA em um plasmídeo adaptador, Cla12NCO usando uma reação de ligadura pegajosa. Misturar os fragmentos de PCR com enzimas de restrição e Cla12NCO na proporção de 2-5:1. Realizar ligadura e transformação de DNA utilizando células competentes.
- Isolar DNA usando um kit de isolamento de DNA.
- Sequencie o DNA para garantir a precisão.
- Clonagem no vetor viral RCAS(A)
OBS: Fragmentos de DNA são inseridos em um veículo (retrovírus RCAS(A)) para a transdução estável de um gene em células do embrião de pintinho em desenvolvimento14,15. Para mais detalhes, ver 7,8,15.- Digerir o fragmento de Cla12NCO-DNA do vetor de interesse com ClaI (1 unidade por 1 μg de DNA) e isolar os fragmentos em gel.
- Subclonar os fragmentos de DNA em um plasmídeo RCAS(A) linearizado por ClaI. Use a enzima de restrição SalI para distinguir o sítio ClaI no plasmídeo RCAS(A).
- Confirmar a orientação correta dos fragmentos inseridos nas construções por digestão com enzimas de restrição ClaI e SalI.
- Isolar DNA usando um kit de isolamento de DNA.
- Determinar a concentração de DNA.
- Transfecção de células de fibroblastos embrionários de pintinhos (CEF) e colheita de RCAS(A)
OBS: Células de empacotamento de vírus, CEFs, são utilizadas para obter/colher meios de cultura celular contendo partículas virais15,16. Para mais detalhes, ver 7,8,15.- Transfect CEF células com DNA retroviral recombinante constrói usando o agente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.
- Realizar western blotting das células transfectadas para examinar sua expressão da proteína de interesse.
- Quando as células transfectadas atingirem a confluência, começar a coletar o meio sobrenadante, processá-lo/filtrá-lo adequadamente (para remover qualquer detrito celular usando um filtro de 0,22μm) e armazenar a -80 °C até que esteja pronto para a concentração.
- Concentração e titulação das existências virais
NOTA: O pellet e grandes volumes de meios derivados das células que contêm as partículas virais devem ser filtrados. Além disso, um ensaio de título viral deve ser realizado para estabelecer a força do vírus contra as células hospedeiras. Para mais detalhes, ver 6,7,8,15.- Descongelar os meios de cultura contendo os virions.
- Girar o meio de cultura a 72.000 × g por 2 h a 4 °C.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender a pastilha viral com o meio residual (~50 μL) e armazenar a -80 °C até o uso, em estoques virais de ~10 μL.
- Para titulação, usando células QT-6 ou CEF, transfecte as células com uma diluição em série dos estoques virais.
- Após a confluência, fixar as células com formol a 4%.
- Imunocoloração para proteínas gag virais ou processo para fosfatase alcalina histoquimicamente para obtenção do título, definido como (unidades formadoras de colônia) UFC por mililitro (UFC/mL).
Figura 2: Instrumentos e setup para microinjeção de lente de pintinho . (A) Puxador manual de micropipeta de microeletrodo vertical P-30. (1) inset mostrando uma micropipeta de vidro sendo puxada. (B) (2) Incubadora de Ovos. Incubar o ovo de galinha por ~65-68 h em uma incubadora de 37 °C para atingir o estágio 18 (com um lúmen central selado e vazio) para injeção de retrovírus. (C) Configuração da microinjeção. (3) equipamento de iluminação, (4) Pico-Injetor, (5) microscópio dissecante, (6) micromanipulador Drummond, (7) computador/câmera para visualização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Microinjeção de lente de pintinho
- Preparação de suprimentos
- Preparação de micropipetas de vidro para microinjeção17
NOTA: Os capilares de vidro são usados para fazer micropipetas de vidro com um ponto de ponta e um diâmetro externo (OD) de ~11 μm para microinjeção. A configuração é mostrada na Figura 2A.- Fixe o capilar de vidro borossilicato aos grampos de borracha almofadados no puxador manual vertical de micropipetas.
- Ajuste a temperatura térmica (HEAT 1) para 950 °C e realize a pré-tração para obter um capilar de vidro mais fino e macio.
- Ajuste a temperatura térmica (HEAT 2) para 790 °C e execute uma tração secundária para produzir micropipetas finais.
- Com um moedor de micropipeta, afie a abertura da ponta para um OD de ~11 μm.
- Para experimentos futuros, mantenha as micropipetas de vidro em uma almofada de fixação de esponja dentro de um frasco de vidro.
- Incubação dos ovos fertilizados até o estágio de desenvolvimento 18
NOTA: Durante o desenvolvimento do cristalino, a ~65-68 h de desenvolvimento embrionário, o cristalino se separa do ectoderma e forma uma vesícula selada com um lúmen central; A injeção nesse lúmen vazio do cristalino estimula a expressão restrita às células proliferativasdo cristalino 7,8,18.- Incubar ovos de galinha fertilizados por ~65-68 h em uma incubadora de balanço umidificada a 37 °C (Figura 2B).
- Preparação de micropipetas de vidro para microinjeção17
- Abertura do ovo de galinha
NOTA: Esta etapa descreve a identificação e exposição do embrião para microinjeção. Para mais detalhes, ver 7,8.- Limpe bem a área de trabalho com etanol 70%.
- Retire os ovos da incubadora, pulverize-os fortemente com etanol 70% e deixe-os secar ao ar.
- Coloque o ovo, com a extremidade maior do ovo virada para cima, sobre um suporte de ovo.
- Usando um par de pinças de dentes afiados, produza um orifício de ~2 cm de diâmetro na extremidade maior do ovo, batendo cuidadosamente na casca do ovo e removendo fragmentos da casca do ovo (Figura 3A).
- Usando um microscópio dissecante, localize o embrião.
- Uma vez localizado o embrião e o cristalino do pintinho, utilizar o microscópio dissecante e a pinça e tesoura finas dissecantes para cortar a membrana amniônica que recobre imediatamente a parte superior do embrião (Figura 3B).
NOTA: Não corte muito (apenas o suficiente para expor o embrião ~0,5 cm x 0,5 cm), ou então os embriões podem afundar na massa vitelírica; Evite também tocar nos vasos sanguíneos, se possível. - Cubra a abertura do ovo com uma placa de Petri de 60 mm em preparação para os próximos passos.
- Microinjeção de estoque viral concentrado
NOTA: Partículas virais contendo fragmentos de DNA da proteína alvo para transdução são inseridas nas células dentro do lúmen do cristalino. A configuração é mostrada na Figura 2C. Para mais detalhes, ver 6,7,8.- Descongele os estoques virais no gelo.
- Para visualização do estoque viral durante a injeção, diluir 1 μL de 10x Fast green em um frasco de estoque viral contendo 10 μL.
- Para garantir que não haja grandes pedaços de material não dissolvido que possam entupir a micropipeta de vidro, centrifugar as soluções por 10 s a 10.000 × g a 4 °C para pellet "grandes pedaços" e transferir os sobrenadantes para novos tubos, tudo mantendo as soluções no gelo.
- Em uma placa de cultura de 35 mm x 10 mm, coloque um parafilme de laboratório esticado e adicione 1 μL de solução salina estéril (PBS) sobre o filme (não esterilizado, com o lado coberto considerado "limpo").
- Conecte uma micropipeta de vidro preparada a um pico-injetor automático.
- Pressione o modo de enchimento para encher o soro fisiológico estéril (PBS) em uma micropipeta de vidro e, em seguida, use o modo de injeção para testar o 1 μL alocado de líquido.
- Coloque um segundo parafilme de laboratório esticado na superfície de uma nova placa de cultura celular de 35 mm x 10 mm e adicione 1 μL de estoques virais corados de verde rápido sobre o filme.
- Abaixe a ponta da micropipeta para o estoque viral e pressione o modelo de enchimento para encher a micropipeta de vidro com ~1 μL de estoque viral.
OBS: Para evitar o ressecamento, coloque a ponta da micropipeta preenchida em soro fisiológico estéril (PBS) sempre que houver pausa no procedimento. - Abaixe a micropipeta de vidro preenchida, conectada a um injetor automático, na região alvo do lúmen da lente embrionária com o auxílio de um microscópio dissecante.
- Ajuste a fonte de luz para garantir uma visualização clara do contorno da vesícula da lente.
NOTA: O lúmen da lente direita (virado para cima) é normalmente usado para injeção e o esquerdo (virado para baixo) é mantido intacto como um controle contralateral. - Uma vez que a colocação da micropipeta está dentro do local correto dentro do lúmen do cristalino, injetar 5-40 nL do estoque viral (Figura 3C).
NOTA: A prática é muito necessária para a colocação ideal da injeção. - Aguarde ~45 s e, em seguida, remova suavemente a micropipeta de vidro.
- Verifique se há microinjeção bem-sucedida no lúmen da lente usando o microscópio dissecante examinando o corante Fast Green que deve permanecer no lúmen vazio da lente sem qualquer vazamento.
- Após o procedimento de injeção, sele a abertura da casca do ovo com fita adesiva.
- Retornar o embrião à incubadora umidificada a 37 °C, sem qualquer movimento de rotação, até atingir a idade embrionária desejada para a dissecção do cristalino.
Figura 3: Preparação e esquema de microinjeção de pintinhos . (A) Abertura de um ovo de galinha. (B) Corte da membrana amniótica. (C) Microinjeção esquemática do lúmen da lente de frango. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Após a determinação de uma(s) proteína(s) alvo(s) específica(s) e a identificação da(s) sequência(s) gênica(s) associada(s), a abordagem experimental global envolve a clonagem da(s) sequência(s) gênica(s) em um vetor retroviral RCAS(A) pela clonagem inicial em um vetor adaptador, seguida por um vetor viral. Em segundo lugar, partículas virais de alto título são preparadas usando células de embalagem para colher e concentrar os vírions. Esses dois primeiros passos principais têm sido amplamente descritos e resultados representativos apresentados em outros periódicos 6,7,8,14,16.
Para este protocolo, a principal área de foco é a etapa de microinjeção. É imperativo determinar o sucesso da microinjeção in situ de partículas virais de RCAS(A) contendo fragmentos de DNA da proteína alvo de interesse, tanto no momento da injeção quanto após o isolamento do cristalino. A Figura 4 mostra uma imagem do lúmen do cristalino pré e pós-injeção dos vetores virais corado com Fast Green para visualização e confirmação da localização adequada no lúmen do cristalino. O Fast Green é um corante com alto grau de segurança e é aprovado pela Food and Drug Administration dos EUA como um aditivo de cor usado para colorir alimentos, medicamentos e cosméticos19.
A Figura 5 mostra a avaliação histológica por imunofluorescência da proteína-alvo, a conexina quimérica Cx50*43L, que foi introduzida em retrovírus recombinantes de alto título, microinjetada no lúmen do cristalino e avaliada. Como os C-termini das conexinas quiméricas foram marcados com epítopos com sequências FLAG, a marcação anti-flag foi utilizada para identificar as conexinas exógenas das endógenas, utilizando metodologia de coloração padrão, com cortes sagitais e coronais (sagital aqui mostrados), como descrito em Liu et al.10 Embora Cx50*43L esteja localizado na membrana plasmática, devido à orientação dos cortes de tecido preparados, ele parece se localizar dentro da lente em certas regiões. Neste estudo, a interação entre o domínio da alça intercelular da Cx50 e da AQP0 foi avaliada e corada de acordo10.
Figura 4: Exemplo de microinjeção no lúmen da lente de frango . (A) Pré-injeção no lúmen do cristalino. (B) Pós-injeção no lúmen do cristalino. Seta = local de injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Microinjeção e avaliação histológica. No estágio 18 do desenvolvimento embrionário, que é ~65-68 h de desenvolvimento embrionário, uma microinjeção de retrovírus recombinantes contendo o mutante quimérico Cx50*43L foi feita no lúmen vazio de uma lente de pintinho. Foram examinadas as criossecções de lentes de pintinhos dissecados no 18º dia embrionário, as quais foram imunomarcadas com anticorpos FLAG (verde) e AQP0 (vermelho). IgG de camundongo conjugada à fluoresceína foi usada para detectar anticorpos primários contra anti-FLAG, enquanto IgG anti-coelho conjugada à rodamina foi usada para detectar anticorpos primários contra anti-AQP0. A visualização da imunomarcação foi feita por microscopia confocal de fluorescência. As imagens mescladas correspondentes, rotuladas como "Mescladas", podem ser vistas à direita. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este modelo experimental oferece a oportunidade de expressar a(s) proteína(s) de interesse no cristalino intacto, levando ao estudo da relevância funcional dessas proteínas na estrutura e função do cristalino. O modelo de microinjeção de pintinhos embrionários é parcialmente baseado no trabalho de Fekete et. al.6 e foi desenvolvido por Jiang et. al.8 e tem sido utilizada como meio de inserção de plasmídeos virais e agentes como agonistas, pequenos RNAs interferentes (siRNA) e peptídeos no cristalino de pintos 1,9,10,11,12,13. Esta plataforma é ideal para investigar os mecanismos que desencadeiam o desenvolvimento de doenças, juntamente com testar possíveis alvos de drogas para condições patológicas do cristalino, como catarata congênita. À medida que nossa compreensão das condições patológicas do cristalino melhora e mutações genéticas ou adquiridas são identificadas, este modelo animal custo-efetivo permite o estudo dos mecanismos subjacentes que cercam o desenvolvimento dessas condições ou desfechos de mutações, o que pode ajudar a resolver a grande necessidade médica de regimes de tratamento não cirúrgicos e confiáveis para condições do cristalino1. Além disso, esse sistema oferece um sistema in vivo para caracterizar proteínas selvagens e mutadas com relação à montagem e agregação de proteínas, como recentemente descrito 1,11. Este modelo poderia ser aplicado para uso amplo além da lente.
RCAS(A) é um retrovírus aviário competente em replicação8. Seu uso, em combinação com uma lente embrionária de galinha (um modelo animal bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e fisiologia do cristalino 1,2,3,4), é considerado um meio único e eficaz de expressar proteínas exógenas em embriões de pintinhos. Dada a linha do tempo e a estrutura única do desenvolvimento embrionário do pintinho, com o cristalino, no estágio de desenvolvimento 18 (~65-68 h de desenvolvimento embrionário), separando-se do ectoderma e formando uma vesícula selada com um lúmen central, isso prepara para a microinjeção nesse lúmen vazio do cristalino restringir a expressão às células proliferativas do cristalino 7,8,18 . Embora seja principalmente um ponto forte para o nosso propósito, também é notavelmente uma limitação, pois devido à natureza da injeção retroviral, apenas as células proliferativas são alteradas através desta metodologia. A transfecção (injeção) por retrovírus não é uma expressão transitória e genes exógenos são incorporados ao genoma. Essa abordagem de liberação gênica é muito eficaz e dados prévios mostram que quase todas as células proliferativas podem estar infectadas 8,10. Notavelmente, nossos estudos anteriores mostraram que a microinjeção isolada não causa danos aparentes ao cristalino, como determinado pela morfologia do cristalino e ausência de formação de catarata no ponto de injeção1.
Em contraste com essa abordagem, abordagens in vitro utilizando células do cristalino cultivadas podem ser utilizadas, mas são limitadas à recapitulação dos estágios iniciais do desenvolvimento das fibras do cristalino 20,21,22,23,24. Além disso, sistemas ex vivo de explantes de lentes também têm sido amplamente utilizados como meio de estudo da diferenciação do cristalino e da cataratogênese25,26. Este modelo e as culturas de cápsulas de lentes relacionadas27, embora potentes, são modelos de cultura simplistas, que apresentam limitações e complexidades dependendo de sua aplicação pretendida24,26. O uso de abordagens transgênicas em lentes de camundongo ou de galinha tem apresentado várias limitações, sendo que a lente murina não compartilha semelhanças substanciais com a lente humana 1,2,3,4, e as lentes de frango têm apresentado limitações de eficiência e estabilidade28.
Na realização do protocolo, muito cuidado deve ser tomado para garantir a adequada amplificação dos fragmentos de DNA, titulação dos retrovírus, transfecção e preparo estéril dos estoques virais, pois a contaminação bacteriana e por leveduras em microinjeção pode causar letalidade aos embriões de pintinhos7. Para a microinjeção em si, as etapas críticas são a localização correta do embrião e da lente do pintinho ao lado do posicionamento da micropipeta no lúmen da lente e atenção cuidadosa deve ser dada para não encher demais a cápsula da lente durante a injeção. Em geral, a prática deve ser feita com notação cuidadosa dos locais anatômicos e ovos extras devem ser preparados para o experimento para explicar o erro. Anomalias durante o processo de microinjeção, como ruptura acidental dos vasos sanguíneos, devem ser observadas, e o uso desses embriões evitado. Além disso, limitações do sistema retroviral RCAS devem ser lembradas, como sua capacidade de criar expressão ectópica de um gene fora de uma janela ou local definido, falta de facilidade de regulação do nível de expressão e, finalmente, há limitações no tamanho da inserção, particularmente >2 kb15,29. Por fim, deve-se ter cuidado na escolha do momento da avaliação. Neste experimento, selecionamos até o 18º dia embrionário, próximo à eclosão dos ovos, para determinar o impacto global da expressão gênica exógena no cristalino intacto. Após a injeção, a taxa de eclosão é muito baixa e a maioria dos embriões não consegue sobreviver devido à ruptura da membrana vitelina.
Em conclusão, o uso deste modelo de microinjeção de lente de frango RCAS(A) apresenta um sistema altamente eficaz, rápido e personalizável para expressar proteínas exógenas para permitir o design e a expressão de proteínas para abordar sua função na fisiologia e desenvolvimento do cristalino.
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Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (para J.X.J) e F32DK134051 (para F.M.A), e concessão da Fundação Welch: AQ-1507 (para J.X.J.). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. As figuras foram parcialmente criadas com Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | - | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | - | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | - | - | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | - | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
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