Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A) לעדשת עוף עוברית

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65727
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

Summary

מאמר פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס RCAS(A) בעדשת עוף עוברית ככלי לחקר תפקוד באתרו וביטוי חלבונים במהלך התפתחות העדשה.

Abstract

עוף עוברי (Gallus domesticus) הוא מודל חייתי מבוסס היטב לחקר התפתחות העדשה והפיזיולוגיה, בהתחשב במידת הדמיון הגבוהה שלה לעדשה האנושית. RCAS(A) הוא רטרו-וירוס עוף בעל יכולת שכפול המדביק תאים מתחלקים, המשמש ככלי רב עוצמה לחקר הביטוי באתרו ותפקודם של חלבונים מסוג בר וחלבונים מוטנטיים במהלך התפתחות העדשה על ידי מיקרו-הזרקה ללומן הריק של שלפוחית העדשה בשלבי התפתחות מוקדמים, ומגביל את פעולתו לתאי עדשה מתרבים סביב. בהשוואה לגישות אחרות, כגון מודלים טרנסגניים ותרביות ex vivo, השימוש ברטרו-וירוס עופות בעל יכולת שכפול RCAS(A) מספק מערכת יעילה, מהירה וניתנת להתאמה אישית לביטוי חלבונים אקסוגניים בעוברי אפרוחים. באופן ספציפי, העברת גנים ממוקדת יכולה להיות מוגבלת לתאי סיבי עדשה מתרבים ללא צורך במקדמים ספציפיים לרקמות. במאמר זה, נסקור בקצרה את השלבים הדרושים להכנת רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A), נספק סקירה מפורטת ומקיפה של הליך המיקרו-הזרקה, ונספק תוצאות לדוגמה של הטכניקה.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של עדשת עוף עוברית של RCAS(A) (סרקומה של עופות / רטרו-וירוס לויקוזיס A). העברה רטרו-ויראלית יעילה בעדשת עוף עוברית הוכחה ככלי מבטיח לחקר in vivo של המנגנון המולקולרי והמבנה-תפקוד של חלבוני עדשה בפיזיולוגיה רגילה של העדשה, בתנאים פתולוגיים ובהתפתחות. יתר על כן, מודל ניסיוני זה יכול לשמש לזיהוי מטרות טיפוליות וסינון תרופות למצבים כגון קטרקט מולד אנושי. בסך הכל, פרוטוקול זה נועד לפרוס את הצעדים הדרושים לפיתוח פלטפורמה להתאמה אישית לחקר חלבוני עדשה.

אפרוחים עובריים (Gallus domesticus), בשל הדמיון שלהם במבנה העדשה ובתפקודה עם העדשה האנושית, הם מודל חייתי מבוסס היטב לחקר התפתחות העדשה ופיזיולוגיה 1,2,3,4. השימוש ברטרו-וירוס עופות RCAS(A) בעל יכולת שכפול נחשב למערכת יעילה, מהירה וניתנת להתאמה אישית לביטוי חלבונים אקסוגניים בעוברי אפרוחים. יש לציין כי יש לו יכולת ייחודית להגביל את העברת גן המטרה לתאי סיבי עדשה שגשוגיים ללא צורך במקדמים ספציפיים לרקמות, תוך שימוש במסגרת הזמן הייחודית להתפתחות עוברית שבה נוכחות לומן עדשה ריק מאפשרת באתרו מיקרו-הזרקה RCAS(A) לאתר המוגבל לביטוי חלבונים אקסוגניים בתוך תאי סיבי עדשה מתרבים5, 6,7,8.

הליך המיקרו-הזרקה של עובר אפרוח, המתואר כאן בהרחבה, מבוסס בחלקו על עבודתו של Fekete et. al.6 ופותח עוד יותר על ידי Jiang et. al.8 ושימש כאמצעי להחדרת פלסמידים נגיפיים ולא ויראליים לעדשת אפרוחים עובריים 1,9,10,11,12,13. בסך הכל, העבודה הקודמת מדגימה את הפוטנציאל של שימוש במתודולוגיה זו לחקר התפתחות עדשות, התמיינות שלהן, תקשורת תאית והתקדמות מחלות, ולגילוי ובדיקה של מטרות טיפוליות למצבים פתולוגיים של עדשות כגון קטרקט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לחוק צער בעלי חיים ולתקנות צער בעלי חיים בהתאם לעקרונות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו. לסקירה כללית של הפרוטוקול, ראו איור 1; עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

Figure 1
איור 1: מתווה ניסויי. 1 . השלב הראשון של הפרוטוקול הוא קביעת חלבון מטרה ספציפי, זיהוי רצפי הגנים הקשורים ויצירת מקטעי DNA. 2 . שיבוט רצפי הגן לווקטור רטרו-ויראלי על ידי שיבוט ראשוני לווקטור מתאם, 3. ואחריו וקטור ויראלי . 4 . הכנת חלקיקים נגיפיים בעלי טיטר גבוה באמצעות תאי אריזה לקציר והתרכיז. 5 . השלב האחרון, והמוקד של פרוטוקול זה, הוא מיקרו-הזרקה של חלקיקי נגיפים RCAS(A) לתוך לומן העדשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת רטרו-וירוסים רקומביננטיים בעלי טיטר גבוה

  1. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ליצירת מקטעי DNA של חלבון מטרה
    הערה: סעיף זה נועד להגביר את רצף הדנ"א המתאים לחלבון עדשת המטרה. לקבלת פרטים נוספים, ראה 7,8.
    1. תכנון פריימרים עבור PCR, המתאימים לחלבון המעניין, כדי ליצור מקטעי DNA עם termini carboxyl שלהם בתוך מסגרת עם או בלי רצף אפיטופ FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), קודון עצירה, ואתר אנזים הגבלה (כלומר, EcoRI) נוכח בתוך אזור פולילינקר של CLa12NCO)) על פי המפרטים שצוינו בפרוטוקולים שפורסמו בעבר, עם רצפים עבור אנזימי הגבלה נאותים1, 7,8,10,11.
    2. בצע את תגובת ה-PCR10. שלב 100 pmol של חישה ואנטיסנס של הפריימרים המעוצבים עם 0.5 מיקרוגרם של connexin cDNA (כגון Cx50, Cx43, או שילובים כימריים Cx50*43L), למאגר התגובה PCR הנבחר. בצע 30 מחזורים שכל אחד מהם מורכב מ- 94 ° C למשך דקה אחת, 58 ° C למשך דקה אחת ו- 72 ° C למשך דקה אחת, ולאחר מכן הארכה סופית למשך 10 דקות ב- 72 ° C.
    3. בודדו וטיהרו מוצרי PCR עם ערכת טיהור ג'ל.
    4. לעכל את מוצרי ה-PCR המטוהרים באמצעות אנזימי הגבלה לפי בחירתכם בהתאם להוראות היצרן.
  2. שיבוט של החדרת DNA לפלסמיד מתאם
    הערה: החדרת מקטעי DNA לווקטור מתאם מבטלת את הצורך בתאים/וירוסים מסייעים כדי להגביר את יציבות וקטור RCAS(A)14. לקבלת פרטים נוספים, ראה 7,8.
    1. תת-שכפול מקטעי DNA לתוך פלסמיד מתאם, Cla12NCO באמצעות תגובת קשירה דביקה. ערבבו את מקטעי ה-PCR עם אנזימי הגבלה ו-Cla12NCO ביחס של 2-5:1. ביצוע קשירה וטרנספורמציה של DNA באמצעות תאים מתאימים.
    2. בודדו DNA באמצעות ערכת בידוד DNA.
    3. רצף את הדנ"א כדי להבטיח דיוק.
  3. שיבוט לווקטור הנגיפי RCAS(A)
    הערה: מקטעי DNA מוחדרים לרכב (RCAS(A) רטרו-וירוס) לצורך העברה יציבה של גן לתאים בעובר אפרוח מתפתח14,15. לקבלת פרטים נוספים, ראה 7,8,15.
    1. עיכלו את מקטע Cla12NCO-DNA של וקטור המכיל עניין עם ClaI (יחידה אחת לכל 1 מיקרוגרם של DNA) ובודדו את המקטעים.
    2. לשכפל את מקטעי הדנ"א לפלסמיד RCAS(A) ליניארי ClaI. השתמש באנזים ההגבלה SalI כדי להבחין באתר ClaI על פלסמיד RCAS(A).
    3. אשר את הכיוון הנכון של המקטעים שהוכנסו על המבנים על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה ClaI ו- SalI.
    4. בודדו DNA באמצעות ערכת בידוד DNA.
    5. לקבוע את ריכוז ה- DNA.
  4. טרנספקציה של תאי פיברובלסט עוברי אפרוח (CEF) וקציר RCAS(A)
    הערה: תאי אריזה של וירוסים, CEFs, משמשים להשגה/קצירת מדיה של תרבית תאים המכילה חלקיקים נגיפיים15,16. לקבלת פרטים נוספים, ראה 7,8,15.
    1. Transfect תאי CEF עם מבני DNA רטרו-ויראליים רקומביננטיים באמצעות סוכן transfection על פי הוראות היצרן.
    2. לבצע ניקוי מערבי של התאים הנגועים כדי לבחון את הביטוי שלהם של החלבון המעניין.
    3. כאשר התאים הנגועים מגיעים למפגש, התחילו לאסוף את התווך הסופרנאטנטי, לעבד/לסנן אותו כראוי (כדי להסיר פסולת תאית באמצעות מסנן 0.22μm), ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לריכוז.
  5. ריכוז וטירינג של מניות ויראליות
    הערה: יש לסנן את הכדוריות ואת כמויות המדיה הגדולות שמקורן בתאים המכילים את החלקיקים הנגיפיים. בנוסף, יש לבצע בדיקת טיטר נגיפי כדי לקבוע את חוזק הנגיף כנגד התאים המארחים. לקבלת פרטים נוספים, ראה 6,7,8,15.
    1. הפשירו את אמצעי התרבות המכילים את הוויריונים.
    2. סובב את מדיה התרבות ב 72,000 × גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C.
    3. דקרו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה הוויראלית עם התווך השיורי (~50 μL) ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש, ב~10 μL ויראלי.
    4. עבור titering, באמצעות תאי QT-6 או CEF, transfecate את התאים עם דילול סדרתי של מלאי ויראלי.
    5. לאחר המפגש, לתקן את התאים באמצעות 4% פורמלדהיד.
    6. Immunostain עבור חלבוני gag נגיפי או תהליך עבור phosphatase אלקליין היסטוכימית כדי לקבל את titer, מוגדר כמו (יחידות יוצרות מושבה) CFU למיליליטר (CFU/mL).

Figure 2
איור 2: מכשירים והתקנה למיקרו-הזרקה של עדשת אפרוח . (A) P-30 מושך מיקרופיפטה אנכי ידני. (1) כניסה המראה משיכה של מיקרופיפטה מזכוכית. (ב) (2) אינקובטור ביצים. לדגור על ביצת תרנגולת במשך ~ 65-68 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי להגיע לשלב 18 (עם לומן מרכזי אטום וריק) להזרקת רטרו-וירוס. (C) הגדרת מיקרו-הזרקה. (3) ציוד תאורה, (4) Pico-Injector, (5) מיקרוסקופ ניתוח, (6) מיקרומניפולטור Drummond, (7) מחשב/מצלמה להדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. מיקרו-הזרקה של עדשת צ'יק

  1. הכנת אספקה
    1. הכנת מיקרופיפטות זכוכית למיקרו-הזרקה17
      הערה: נימי זכוכית משמשים לייצור מיקרופיפטות זכוכית עם נקודת קצה וקוטר חיצוני (OD) של ~ 11 מיקרומטר למיקרו-הזרקה. ההגדרה מוצגת באיור 2A.
      1. חבר את נימי זכוכית הבורוסיליקט לאטבים המרופדים בגומי במושך המיקרופיפטה האנכי הידני.
      2. כוונו את טמפרטורת החום (חום 1) ל-950°C ובצעו משיכה מקדימה לקבלת נימי זכוכית דקים ורכים יותר.
      3. הגדר את טמפרטורת החום (חום 2) ל 790 ° C ובצע משיכה משנית כדי לייצר מיקרופיפטות סופיות.
      4. בעזרת מטחנת מיקרופיפטה, מחדדים את פתח החוד ל-OD של ~11 מיקרומטר.
      5. לניסויים עתידיים, שמרו את מיקרופיפטות הזכוכית במשטח הידוק ספוג בתוך צנצנת זכוכית.
    2. דגירה של ביציות מופרות עד לשלב ההתפתחות 18
      הערה: במהלך התפתחות העדשה, ב~65-68 שעות של התפתחות עוברית, העדשה נפרדת מהאקטודרם ויוצרת שלפוחית אטומה עם לומן מרכזי; הזרקה לתוך עדשה ריקה זו לומן ראשונים לביטוי מוגבל לתאי עדשה שגשוג 7,8,18.
      1. דגרו על ביצי תרנגולות מופרות במשך ~65-68 שעות באינקובטור נדנדה לח של 37°C (איור 2B).
  2. פתיחת ביצת התרנגולת
    הערה: שלב זה מתאר את הזיהוי והחשיפה של העובר למיקרו-הזרקה. לקבלת פרטים נוספים, ראה 7,8.
    1. נגבו היטב את אזור העבודה עם 70% אתנול.
    2. מוציאים את הביצים מהאינקובטור, מרססים אותן בכבדות באתנול 70% ונותנים להן להתייבש באוויר.
    3. מניחים את הביצה, כאשר הקצה הגדול יותר של הביצה פונה כלפי מעלה, על מחזיק ביצים.
    4. באמצעות זוג מלקחיים חדי שיניים, יוצרים חור בקוטר ~2 ס"מ בקצה הגדול יותר של הביצה על-ידי הקשה זהירה על קליפת הביצה והסרת שברים מקליפת הביצה (איור 3A).
    5. באמצעות מיקרוסקופ מנתח, אתר את העובר.
    6. לאחר איתור עדשת העובר והאפרוח, השתמשו במיקרוסקופ המנתח ובמלקחיים ובמספריים לניתוח עדין כדי לחתוך את קרום מי השפיר המכסה מיד את החלק העליון של העובר (איור 3B).
      הערה: אין לחתוך רחב מדי (רק מספיק כדי לחשוף את העובר ~ 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ), אחרת העוברים עלולים לשקוע לתוך מסת החלמון; כמו כן, הימנעו מלגעת בכלי הדם, במידת האפשר.
    7. מכסים את פתח הביצה בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ כהכנה לשלבים הבאים.
  3. מיקרו-הזרקה של מלאי ויראלי מרוכז
    הערה: חלקיקים נגיפיים המכילים מקטעי DNA של חלבון מטרה לצורך התמרה מוחדרים לתאים בתוך לומן העדשה. ההגדרה מוצגת באיור 2C. לקבלת פרטים נוספים, ראה 6,7,8.
    1. הפשירו את מניות המניות הוויראליות על הקרח.
    2. להדמיה של המלאי הנגיפי במהלך ההזרקה, לדלל 1 μL של 10x ירוק מהיר לתוך בקבוקון אחד של מלאי ויראלי המכיל 10 μL.
    3. כדי להבטיח שאין גושים גדולים של חומר בלתי מומס שעלולים לסתום את מיקרופיפטת הזכוכית, צנטריפוגו את התמיסות למשך 10 שניות ב-10,000 × גרם ב-4°C כדי לפלוט "גושים גדולים" ולהעביר את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים, כל זאת תוך שמירה על התמיסות על קרח.
    4. על צלחת תרבית בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ, מניחים פרפילם מעבדה מתוח ומוסיפים 1 μL של מלח סטרילי (PBS) על גבי הסרט (לא מעוקר, כאשר הצד המכוסה נחשב "נקי").
    5. חבר מיקרופיפט זכוכית מוכן למזרק פיקו אוטומטי.
    6. לחץ על מצב המילוי כדי למלא את המלח הסטרילי (PBS) לתוך מיקרופיפטה זכוכית, ולאחר מכן השתמש במצב הזרקה כדי לבדוק את 1 μL המוקצה של נוזל.
    7. הניחו פרפילם מעבדה מתוח שני על פני צלחת תרבית תאים חדשה בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ והוסיפו 1 μL של מלאי נגיפים מוכתמים בירוק מהיר על גבי הסרט.
    8. הורידו את קצה המיקרופיפטה למלאי הנגיפי ולחצו על דגם המילוי כדי למלא את מיקרופיפטת הזכוכית ב~1 μL של מלאי נגיפי.
      הערה: כדי למנוע התייבשות, שים את קצה המיקרופיפטה המלאה במי מלח סטריליים (PBS) בכל פעם שיש הפסקה בהליך.
    9. הורידו את מיקרופיפטת הזכוכית המלאה, המחוברת למזרק אוטומטי, לאזור המטרה של לומן עדשת העובר בעזרת מיקרוסקופ מנתח.
    10. כוונן את מקור האור כדי להבטיח הדמיה ברורה של קווי המתאר של שלפוחית העדשה.
      הערה: לומן העדשה הימנית (פונה כלפי מעלה) משמש בדרך כלל להזרקה והשמאלית (פונה כלפי מטה) נשמרת שלמה כבקרה נגדית.
    11. ברגע שאתם בטוחים שמיקום המיקרופיפטה נמצא במיקום הנכון בתוך לומן העדשה, הזריקו 5-40 nL של הזן הנגיפי (איור 3C).
      הערה: תרגול הוא הכרחי מאוד עבור מיקום הזרקה אופטימלי.
    12. המתן ~ 45 שניות ולאחר מכן הסר בעדינות את מיקרופיפטת הזכוכית.
    13. בדוק את המיקרו-הזרקה המוצלחת לתוך לומן העדשה באמצעות המיקרוסקופ המנתח על ידי בדיקת צבע ירוק מהיר שאמור להישאר בלומן הריק של העדשה ללא כל דליפה.
    14. לאחר הליך ההזרקה, אוטמים את פתח קליפת הביצה בסרט סקוטש.
    15. יש להחזיר את העובר לאינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ללא כל תנועה סיבובית, עד להגעה לגיל העוברי הרצוי לדיסקציה של העדשה.

Figure 3
איור 3: הכנת אפרוח במיקרו-הזרקה וסכמטית . (א) פתיחת ביצת תרנגולת. (B) חיתוך קרום מי השפיר. (C) סכימת מיקרו-הזרקה של עדשת עוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר קביעת חלבון מטרה ספציפי וזיהוי רצפי הגנים הקשורים, הגישה הניסויית הכוללת כוללת שיבוט של רצפי הגן לווקטור RCAS(A) רטרו-ויראלי על ידי השיבוט הראשוני לווקטור מתאם, ואחריו וקטור נגיפי. שנית, חלקיקים נגיפיים בעלי טיטר גבוה מוכנים באמצעות תאי אריזה כדי לקצור ולרכז את הנגיפים. שני הצעדים העיקריים הראשונים תוארו במידה רבה והתוצאות המייצגות הוצגו במקומות אחרים 6,7,8,14,16.

עבור פרוטוקול זה, תחום המיקוד העיקרי הוא שלב המיקרו-הזרקה. הכרחי לקבוע את הצלחת המיקרו-הזרקה באתרו של חלקיקים נגיפיים מסוג RCAS(A) המכילים מקטעי DNA של יעד החלבון המעניין, הן בזמן ההזרקה והן לאחר בידוד העדשה. איור 4 מראה תמונה של לומן העדשה לפני ואחרי הזרקת הווקטורים הנגיפיים שנצבעו בירוק מהיר לצורך הדמיה ואישור הלוקליזציה הנכונה לתוך לומן העדשה. ירוק מהיר הוא צבע בעל רמה גבוהה של בטיחות והוא מאושר על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקני כתוסף צבע המשמש לצביעת מזון, תרופות וקוסמטיקה19.

איור 5 מראה את ההערכה ההיסטולוגית באמצעות אימונופלואורסנציה של חלבון המטרה, הקונקסין הכימרי Cx50*43L, שהוכנס לרטרו-וירוסים רקומביננטיים בעלי טיטר גבוה, הוזרק במיקרו לתוך לומן העדשה והוערך. מכיוון שה-C-termini של הקונקסינים הכימריים תויגו כאפיטופים עם רצפי FLAG, נעשה שימוש בתיוג אנטי-דגלים כדי לזהות את הקונקסינים האקסוגניים מהאנדוגניים, תוך שימוש במתודולוגיית צביעה סטנדרטית, עם חתכים קשתניים וקורונליים (sagittal מוצג כאן), כמתואר ב-Liu et al.10 למרות ש-Cx50*43L ממוקם על קרום הפלזמה, בגלל הכיוון של קטעי הרקמה שהוכנו, נראה שהוא מתמקם בתוך העדשה באזורים מסוימים. במחקר זה, האינטראקציה בין תחום הלולאה הבין-תאית של Cx50 ו-AQP0 הוערכה והוכתמה בהתאם10.

Figure 4
איור 4: דוגמה של מיקרו-הזרקה לתוך לומן עדשת העוף . (A) הזרקה מוקדמת ללומן של העדשה. (B) לאחר הזרקה ללומן העדשה. חץ = אתר הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מיקרו-הזרקה והערכה היסטולוגית. בשלב 18 של ההתפתחות העוברית, שהוא ~65-68 שעות של התפתחות עוברית, נעשתה מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוסים רקומביננטיים המכילים מוטציה כימרית Cx50*43L לתוך לומן ריק של עדשת אפרוח. בחנו את ההקפאה של עדשות אפרוחים שנותחו ביום העוברי ה-18, אשר סומנו כנוגדנים FLAG (ירוק) ו-AQP0 (אדום). IgG אנטי-עכברי מצומד פלואורסצאין שימש לזיהוי נוגדנים ראשוניים נגד anti-FLAG, בעוד IgG אנטי-ארנב מצומד רודמין שימש לזיהוי נוגדנים ראשוניים נגד anti-AQP0. הדמיה של immunostaining נעשה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. התמונות הממוזגות המתאימות, המסומנות כ"ממוזגות", ניתן לראות מימין. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל ניסיוני זה מציע הזדמנות לבטא את העניין של החלבונים בעדשה השלמה, מה שמוביל לחקר הרלוונטיות התפקודית של חלבונים אלה במבנה העדשה ובתפקודה. מודל המיקרו-הזרקה של אפרוח עוברי מבוסס בחלקו על עבודתו של Fekete et. al.6 ופותח עוד יותר על ידי Jiang et. al.8 ושימש כאמצעי להחדרת פלסמידים נגיפיים וחומרים כגון אגוניסטים, RNA מפריע קטן (siRNA) ופפטידים לעדשת אפרוחים 1,9,10,11,12,13. פלטפורמה זו אידיאלית לחקירת המנגנונים המפעילים התפתחות מחלות לצד בדיקת מטרות תרופתיות אפשריות למצבים פתולוגיים בעדשה כגון קטרקט מולד. ככל שהבנתנו את התנאים הפתולוגיים של העדשה משתפרת ומזוהות מוטציות גנטיות או נרכשות, מודל חסכוני זה של בעלי חיים מאפשר לחקור את המנגנונים הבסיסיים סביב התפתחות מצבים אלה או תוצאות של מוטציות, מה שיכול לעזור לענות על הצורך הרפואי הגדול של משטרי טיפול לא ניתוחיים ואמינים למצבי עדשה1. בנוסף, מערכת זו מציעה מערכת in vivo לאפיון חלבונים מסוג בר וחלבונים מוטנטים ביחס להרכבה וצבירה של חלבונים, כפי שתואר לאחרונה 1,11. מודל זה יכול להיות מיושם לשימוש נרחב מעבר לעדשה.

RCAS(A) הוא רטרו-וירוס עופות8 בעל יכולת שכפול. השימוש בה, בשילוב עם עדשת עוף עוברית (מודל חייתי מבוסס לחקר התפתחות העדשה ופיזיולוגיה 1,2,3,4), נחשב לאמצעי ייחודי ויעיל לביטוי חלבונים אקסוגניים בעוברי אפרוחים. בהינתן ציר הזמן והמבנה ההתפתחותי העוברי הייחודי של האפרוח, כאשר העדשה, בשלב ההתפתחות 18 (~ 65-68 שעות התפתחות עוברית), נפרדת מהאקטודרם ויוצרת שלפוחית אטומה עם לומן מרכזי, זה מאפשר למיקרו-הזרקה לתוך לומן העדשה הריק הזה להגביל את הביטוי לתאי עדשה מתרבים 7,8,18. למרות שמדובר בעיקר בחוזקה למטרתנו, מדובר גם במגבלה בולטת שכן בשל אופי ההזרקה הרטרו-ויראלית, רק תאים מתרבים משתנים באמצעות מתודולוגיה זו. הטרנספקציה (הזרקה) על ידי רטרו-וירוסים אינה ביטוי חולף וגנים אקסוגניים משולבים בגנום. גישה זו של העברת גנים יעילה מאוד ונתונים קודמים מראים שכמעט כל התאים המתרבים יכולים להידבק 8,10. יש לציין כי מחקרים קודמים שלנו הראו כי מיקרו-הזרקה לבדה אינה גורמת נזק נראה לעין לעדשה כפי שנקבע על ידי מורפולוגיית העדשה וחוסר היווצרות קטרקט בנקודת ההזרקה1.

בניגוד לגישה זו, ניתן להשתמש בגישות חוץ גופיות המשתמשות בתאי עדשה בתרבית, אך מוגבלות לשחזור השלבים המוקדמים של התפתחות סיבי העדשה 20,21,22,23,24. בנוסף, מערכות explant עדשות ex vivo שימשו גם כאמצעי לחקר התמיינות עדשות וקטרקטוגנזה25,26. מודל זה ותרביות קפסולות עדשהקשורות 27, למרות שהם חזקים, הם מודלים של תרבית פשטנית, שיש להם מגבלות ומורכבויות בהתאם ליישום המיועד שלהם24,26. לשימוש בגישות טרנסגניות בעדשת עכבר או עוף היו מגבלות שונות, כאשר עדשת מורין לא חולקת דמיון משמעותי לעדשה האנושית 1,2,3,4, ולעדשות עוף היו מגבלות ביעילות וביציבות28.

בעת ביצוע הפרוטוקול, יש לנקוט בזהירות רבה כדי להבטיח הגברה נאותה של מקטעי DNA, טיטול רטרו-וירוס, טרנספקציה, והכנה סטרילית של מלאי ויראלי מכיוון שזיהום חיידקי ושמרים במיקרו-הזרקה עלול לגרום לקטלניות לעוברי אפרוחים7. עבור המיקרו-הזרקה עצמה, השלבים הקריטיים הם לוקליזציה נכונה של עובר האפרוח והעדשה לצד מיקום המיקרופיפטה לתוך לומן העדשה ויש לשים לב היטב כדי לא למלא את קפסולת העדשה יתר על המידה במהלך ההזרקה. באופן כללי, תרגול צריך להיעשות עם סימון זהיר של אתרים אנטומיים ביצים נוספות צריך להיות מוכן עבור הניסוי כדי להסביר את הטעות. יש לציין אנומליות בתהליך המיקרו-הזרקה, כגון קרע מקרי של כלי הדם, ולהימנע משימוש בעוברים אלה. בנוסף, יש לזכור מגבלות של המערכת הרטרו-ויראלית RCAS, כגון יכולתה ליצור ביטוי חוץ רחמי של גן מחוץ לחלון או מיקום מוגדר, חוסר קלות ויסות של רמת הביטוי, ולבסוף, ישנן מגבלות על גודל העלון, במיוחד >2 kb15,29. לבסוף, יש להקפיד על בחירת נקודת הזמן להערכה. בניסוי זה בחרנו עד היום ה-18 העוברי, הקרוב לבקיעת ביציות, כדי לקבוע את ההשפעה הכוללת של ביטוי גנים אקסוגניים על עדשה שלמה. לאחר ההזרקה, קצב הבקיעה נמוך מאוד ורוב העוברים אינם יכולים לשרוד עקב הפרעה בקרום הוויטליין.

לסיכום, השימוש במודל מיקרו-הזרקה של עדשת עוף RCAS(A) מציג מערכת יעילה, מהירה וניתנת להתאמה אישית לביטוי חלבונים אקסוגניים כדי לאפשר תכנון וביטוי של חלבונים כדי לטפל בתפקודם בפיזיולוגיה ובהתפתחות של העדשה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH): RO1 EY012085 (ל- J.X.J) ו- F32DK134051 (ל- F.M.A), ומענק קרן וולש: AQ-1507 (ל- J.X.J). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. הדמויות נוצרו חלקית עם Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Filter Corning 431118 For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish FisherScientific 50-202-030 For using during microinjection
Centrifuge Fisherbrand 13-100-676 Spinning down solution
Constructs GENEWIZ - For generation of constructs
Dissecting microscope AmScope SM-4TZ-144A Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers Integrated DNA Technologies - Generation of primers:

Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-50WY Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen For cell culture
Egg Holder - - Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator GQF Manufacturing Company Inc. 1502 For incubation of fertilized eggs
Fast Green Fisher scientific F99-10 For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs Texas A&M University N/A Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone Laboratories For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-095-003 For anti-FLAG  1:500
Forceps FisherScientific 22-327379 For moving things around and isolation
Glass capillaries Sutter Instruments B100-75-10 Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine Invitrogen L3000001 For transfection
Manual vertical micropipette puller Sutter Instruments P-30 To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes FisherScientific 02-682-004 Dissolving solution
Microscope Keyence BZ-X710 For imaging staining
Parafilm FisherScientific 03-448-254 Placing solution
Penicillin/Streptomycin Invitrogen For cell culture
Pico-Injector Harvard Apparatus PLI-100 For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0 Self generated - Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody Rockland Immunichemicals 600-401-383 For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch 111-295-003 For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad Sutter Instruments BX10 For storage of glass micropipette

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
  2. Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
  3. Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
  4. McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
  5. Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
  6. Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
  7. Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
  8. Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
  9. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
  10. Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
  11. Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
  12. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
  13. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
  14. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  15. Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
  16. Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
  17. Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  19. Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
  20. Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
  21. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
  23. Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
  24. Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
  25. West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
  26. Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
  27. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
  28. Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
  29. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).

Tags

מיקרו-הזרקה רטרו-וירוס RCAS(A) רקומביננטי עוף עוברי התפתחות עדשה פיזיולוגיה מודל בעלי חיים ביטוי באתרו חלבונים מוטנטיים שלבי התפתחות מוקדמים שלפוחית עדשה תאי עדשה מתרבים מודלים טרנסגניים תרביות Ex Vivo רטרו-וירוס עופות העברת גנים ממוקדת תאי סיבי עדשה מתרבים
מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A) לעדשת עוף עוברית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acosta, F. M., Ma, B., Gu, S.,… More

Acosta, F. M., Ma, B., Gu, S., Jiang, J. X. Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens. J. Vis. Exp. (199), e65727, doi:10.3791/65727 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter