Summary
Aplysia californica neuronas desarrollan un gran crecimiento en los conos de la cultura que son excelentes para imágenes de alta resolución de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. Aquí, se presenta un protocolo para la disección y de las planchas de las neuronas de células Aplysia bolsa, así como para la creación de una cámara de imágenes de células vivas.
Abstract
Conos de crecimiento neuronales son estructuras altamente móviles en la punta de los axones que pueden detectar señales de orientación en el medio ambiente y la transducción de esta información en el movimiento direccional hacia la celda de destino adecuado. Para entender completamente cómo la información se transmite a la orientación de la superficie celular a la base de redes citoesqueleto dinámico, se necesita un sistema de modelo adecuado para imágenes de células vivas de la dinámica de proteínas de alta resolución temporal y espacial. Típico de los conos de crecimiento de vertebrados son demasiado pequeños para analizar cuantitativamente la F-actina y la dinámica de los microtúbulos. Las neuronas de la liebre de mar Aplysia californica son 5-10 veces más grande que las neuronas de los vertebrados, fácilmente se puede mantener a temperatura ambiente y son células muy robusta de micromanipulación y mediciones biofísicas. Sus conos de crecimiento tienen muy definido regiones citoplásmicas y un sistema de citoesqueleto bien descritos. Los cuerpos de las células neuronales se pueden microinyección con una variedad de sondas para el estudio de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. En el presente Protocolo que demostrar un procedimiento para la disección de los ganglios abdominales, la cultura de las neuronas de células bolsa y la creación de una cámara de imágenes de imágenes de células vivas de los conos de crecimiento.
Protocol
Soluciones
- L15-ASW medio de cultivo celular (1l)
- 1 bolsa de polvo L15
- Añadir 800 ml de H 2 O ultrapura
- NaCl 400 mM
- MgSO4 27 mM
- MgCl2 28 mM
- L-glutamina 4 mM
- Gentamicina 50 mg / ml
- HEPES 5 mM
- Ajustar el pH a 7.9
- Añadir gota a gota, CaCl2 9,3 mM (parada si se precipita)
- Añadir H 2 O ultrapura a 1 l
- Compruebe la osmolaridad (950-1000 mg / kg) con osmómetro (presión de vapor, Wescor # 5520)
- Filtro de 0,22 micras utilizando una unidad de filtración a presión positiva (Filtros: SVGV010RS Millipore)
- Almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes
- Poli-L-lisina (70-150 kD) 200 mg / ml de solución estéril de valores de H 2 O ultrapura se mantiene a -20 º C
- 0,5 M de MgCl2 solución
Día 1: La disección del ganglio abdominal de Aplysia
Preparación de la solución enzimática disociación
- Pesar 10.9 mg de Dispasa enzima (Worthington, Cat: LS02111) en un tubo Eppendorf
- Añadir 900 l de L15-ASW medio de cultivo, y 100 l de H 2 O estéril ultrapura
- Mezcle y ponga a temperatura ambiente (TA)
La disección del ganglio abdominal
- Llene una jeringa de 50 ml con 0,5 M de MgCl2 solución.
- Tener un animal en el tanque, manejar con cuidado para evitar la respuesta animal entintado defensa.
- Coloque la Aplysia a su lado en una tabla de disección (espuma de poliestireno bordo), parte rostral en el lado derecho, caudal a la izquierda.
- Insertar la aguja en los animales justo detrás de la cabeza e inyecte toda la solución de MgCl 2 en la cavidad corporal.
- Frote suavemente el animal para dispersar a la solución de MgCl 2 en toda la cavidad del cuerpo, espere unos minutos para que el animal anestesiado por completo.
- Pin de la cabeza y la cola del animal a la mesa de disección con dos agujas.
- El uso de fórceps para levantar la piel, cortar la piel y la capa muscular con unas tijeras de gran tamaño en la cabeza y la cola para hacer una gran abertura en el costado.
- Encontrar el ganglio abdominal en el ovario similares a un cepillo. El uso de fórceps para mantener los nervios que conectan alrededor de 1 cm en la parte delantera de los ganglios abdominales, cortar los nervios con tijeras de disección en la parte delantera de la posición de pinzas de sujeción y por detrás del ganglio abdominal.
- Ganglio lugar en la solución Dispasa e incubar durante 15-16 horas a 22 ° C utilizando un baño de agua con temperatura controlada.
Día 2: Revestimiento de las células de la bolsa Aplysia
La preparación de poli-lisina cubreobjetos
- En un banco de flujo, preparar tres platos de Petri de 35 mm como platos de trabajo para la disección de los ganglios, llenándolos de 4 ml L15-ASW medio cada uno. Transferir el ganglio abdominal de la solución dispasa a uno de los platos después de 15,5 horas de trabajo de la digestión.
- Con unas pinzas tomar ácido limpiado # 1.5 cubreobjetos (22x22 mm) almacenados en etanol, eliminar el alcohol y esterilizar cubreobjetos por llamas brevemente sobre mechero Bunsen. Deje enfriar brevemente antes de colocar el cubreobjetos en las placas de cultivo.
- Prepare una punta de placas curvas doblando una punta amarilla sobre el quemador Bunsen (llama brevemente para evitar la fusión de plástico!).
- Preparar una cantidad apropiada de 20 mg / ml de solución de poli-lisina mediante la dilución de 200 mg / ml de solución madre con agua estéril H 2 O ultrapura.
- Cubra cada portaobjetos con 500 l de 20 mg / ml de poli-lisina y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Lave cada cubreobjetos 3-5 veces con 500 l estéril H 2 O ultrapura cada uno.
- Eliminar el agua de cubreobjetos, llenar cada plato con 4 ml de medio de cultivo L15-ASW.
La disociación de las células de la bolsa
- Bajo un microscopio de disección, corte el ganglio abdominal en la mitad con tijeras de disección y pinzas previamente lavado con etanol al 95% (Figura 1 línea 1).
- En una mitad del ganglio, corte entre el grupo bolsa de células y las células hemiganglion (Figura 1 línea 2), y cortar resto de las extensiones de los nervios en el otro lado de la bolsa de las células (Figura 1 línea 3). Trabajo en una mitad del ganglio en un momento, dejar la otra mitad en el plato, mientras que las células del primer grupo están chapados.
- El uso de dos pinzas (o un fórceps y tijeras de disección), bolsa de lanzamiento de racimo de células, empujando a un lado de la vaina de tejido conectivo que rodea el cúmulo de células bolsa. Cortar el tejido conectivo con tijeras de disección, si es necesario. Tenga cuidado de no apretar y tocar el grupo de células bolsa demasiado durante este proceso.
- Cuando la mayoría del tejido conectivo se elimina, la transferencia de la bag grupo de células en un plato nuevo trabajo con la punta amarilla doblada preparado con anterioridad. Tenga cuidado de no dejar que el grupo de células bolsa de quedar atrapado dentro de la punta de color amarillo o pegado en la interfase aire / medio plazo.
- Triturar el grupo con la punta amarilla para eliminar las células individuales de bolsa. Para ello, pipetear el grupo dentro y fuera de la punta. Comience con bajas fuerzas de corte y aumentar la fuerza cuando sea necesario. Utilice siempre la fuerza mínima necesaria para remover las neuronas sin matar demasiadas células.
- Recoger 3-5 células bolsa sana y transferirlos a un plato con un cubreobjetos poli-lisina. Evitar la captación de las células muertas (que son de color negro / transparente en el centro) y restos de tejido conectivo.
- Repita el paso 6. y el lugar alrededor de 15-25 neuronas vivas en el centro de cada cubreobjetos. Si las células muertas o restos son trasladados, así, eliminar el material no deseado recogerlo o soplando fuera de las células sanas. Este proceso toma alrededor de 2.3 horas para ambos grupos.
- Una vez finalizado mantener las placas de cultivo en el banco de flujo de por lo menos 2 horas a temperatura ambiente para permitir que las células se adhieren (mantener banco de flujo del ventilador apagado para evitar que las vibraciones no deseadas).
- Colocar las cápsulas en una incubadora a 14 ° C durante la noche, o hasta su posterior utilización. Los conos de crecimiento se puede desarrollar en 4.10 horas.
Figura 1. Esquemática de Aplysia californica ganglio abdominal. Líneas de color indican dónde cortar para obtener clusters bolsa de la célula.
Día 3: Configuración de cámara para imágenes en vivo de las células de la bolsa Aplysia
Montaje de imágenes de cámara
- Antes de utilizar las células de la bolsa de experimentos con células en vivo de imágenes, inspeccionar las células en un microscopio de baja potencia. Si las células no se han desarrollado los conos de crecimiento sano, el suministro de un nuevo medio y dejar a temperatura ambiente durante 1-2 horas.
- Para suministrar las placas con medio fresco L15-ASW, eliminar la mitad (~ 2 ml) de medio de edad, con una línea de vacío, y añadir 2 ml de nuevo L15-ASW medio por placa de Petri. Es importante no eliminar por completo todo el medio del plato a la vez, ya que se eliminan las células del cubreobjetos.
- Para obtener imágenes de bolsa de la célula, nos reunimos dos cubreobjetos y dos separadores de plástico en una cámara de imágenes de sándwich. El cubreobjetos encima del pastel se corta más corta para permitir un fácil intercambio de medios y reactivos. Durante el montaje, cubreobjetos con células bolsa adherida debe ser sumergido en el L15-ASW medio en todo momento para evitar que las células se desprenda.
- Para preparar la cámara, cortar ~ 2 mm de lado derecho de un mm # 1 cubreobjetos 22x22 con diamante pluma (cortador de vidrio) y la regla.
- Con una jeringa de 1 ml, aplicar grasa de alto vacío a ambos lados de la cubreobjetos cortos, y colocar separadores de plástico a cada lado. Aplicar grasa de vacío en la parte superior de los dos separadores.
- Invertir el cubreobjetos y montaje espaciador, y ponerlo en un plato de Petri que contiene las células de la bolsa en un cubreobjetos. Alinear y presionar suavemente hacia abajo para pegar cubreobjetos arriba a abajo cubreobjetos con la punta opuesta de dos Q-tips.
- Con unas pinzas, suavemente levante el conjunto del sándwich de la placa de Petri sin el medio de escape. Alinear los dos cubreobjetos, si es necesario, y limpie el exceso con un medio Kimwipe. Coloque el sándwich en la parte inferior del soporte portaobjetos y coloque la tapa con cuidado utilizando clips.
- Limpiar el centro de la parte superior del sándwich con Q-tips se secó en el limpiador de cristales (Sparkle es utilizado como limpiador de cristales). Rápidamente secar el limpiador de cristales con un segundo y seco Q-tip para evitar las líneas consecutivas. Haga lo mismo con el cubre parte inferior. Cubreobjetos limpio, libre de líneas de racha son importantes para imágenes de alta calidad.
Bolsa de células en el microscopio
Desde Aplysia cultivos de células neuronales en la bolsa de baja densidad, lo mejor es que la configuración de su microscopio tiene funciones etapa de posicionamiento para facilitar el cambio entre las células. Las células de la bolsa puede ser fácilmente mantenido a temperatura ambiente durante varias horas en el escenario durante los experimentos de imagen. Cambio del medio periódicamente para evitar la evaporación.
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Discussion
Aplysia neuronas de células bolsa de proporcionar un suero libre de cultivos de células neuronales del sistema con muy pocas células no neuronales. Estas neuronas forman los conos de crecimiento muy grande adecuado para hacer frente a una serie de preguntas de biología celular importante. Bolsa de neuronas de células pueden ser instrumentalizadas fácilmente y con imágenes a temperatura ambiente durante varias horas. Utilizando microscopía de fluorescencia moteado (FSM), una cuantitativa puede analizar los distintos parámetros de F-actina y la polimerización de microtúbulos y la dinámica de desplazamiento. Estas herramientas de imágenes, junto con el recientemente lanzado Aplysia información del genoma, así como la mejora de las técnicas de expresión que estas neuronas de un sistema poderoso modelo para el estudio de mecanismos moleculares y celulares de la motilidad del cono de crecimiento neuronal y la orientación.
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Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Ryan Maneri (Producciones ostrero, LLC) para filmar nuestro procedimiento y Rodney McPhail (Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Purdue) para obtener ayuda con la edición de vídeo disección. La investigación en el laboratorio de Suter es apoyado por subvenciones del NIH (R01 NS049233) y el Centro Bindley Bioscience en la Universidad Purdue de DMS
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 glass coverslips 22x22 mm | Tool | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22x22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington Biochemical | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
