Summary
لتقييم علاجات جديدة من الخلايا الجذعية من المهم جراحية غير المسار حقن الخلايا في الجسم الحي. هذا الفيديو سوف تظهر لك كيفية تسمية الخلايا الجذعية البشرية الجنينية والوسيطة مع وكلاء النقيض من أكسيد الحديد الموجودة في الجسم الحي عن التصوير بالرنين المغناطيسي لاحق في الجسم الحي.
Abstract
في السنوات الأخيرة ، أدت أبحاث الخلايا الجذعية إلى التوصل إلى فهم أفضل من البيولوجيا التطورية ، والأمراض المختلفة وتأثيرها المحتمل على الطب التجديدي. وهناك طريقة غير الغازية لرصد الخلايا الجذعية التي تم زرعها في الجسم الحي مرارا يعزز كثيرا من قدرتنا على فهم الآليات التي تحكم بالإعدام الخلايا الجذعية وتحديد العوامل الغذائية ومسارات الإشارات التي من شأنها تحسين الجذعية engraftment الخلية. وقد ثبت MR التصوير ليكون أداة فعالة للتصوير في الجسم الحي من خلايا جذعية مع قرب القرار التشريحية المجهرية. من أجل الكشف عن الخلايا الجذعية مع السيد ، ويجب أن تكون الخلايا المسماة الخلايا المحددة مع عوامل التباين MR. لهذا الغرض ، يتم تطبيق النانوية أكسيد الحديد ، مثل جزيئات superparamagnetic أكسيد الحديد (سبيو) ، وذلك بسبب حساسيتها العالية للكشف عن توافق مع الحياة والخلية الممتاز. تتكون الجسيمات الأساسية سبيو من أكسيد الحديد ومعطفا دكستران ، carboxydextran أو النشاء ، وظيفة من خلال خلق عدم تجانس الميدانية المحلية ، والتي تتسبب في إشارة انخفض صور الرنين المغناطيسي T2 المرجحة. وهذا العرض شرح التقنيات لوضع العلامات على الخلايا الجذعية مع تطبيق سريريا عوامل التباين MR لاحقة غير الغازية في تعقب خلايا الجسم الحي المسمى مع التصوير بالرنين المغناطيسي.
Protocol
وسم hMSC مع Ferucarbotran
هذا هو أسلوب لوصفها الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة مع Ferucarbotran ، وهو وكيل أكسيد الحديد القائمة على النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي :
- لتبدأ ، لوحة الخلايا 18-24 قبل ساعات من إجراء التوسيم T75 في قوارير في التقاء 80 ٪. إذا كنت تستخدم طبق ثقافة مختلفة ، وهذا يساوي حوالي 10000 خلية لكل سم 2.
- في اليوم التالي ، مع بدء التحضير لوضع العلامات وسائل الاعلام من خلال إضافة 30 ميكرولتر من Resovist إلى 8 مل من الإعلام الحر في المصل. هذا سوف تسمية واحدة في قارورة T75 80 ٪ confluency ، المقابلة لتركيز وسائل الإعلام الحديد 100 / مل ميكروغرام.
- تقلع وسائل الإعلام والثقافة ، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام المصل الحرة. يتم ذلك للتخلص من بروتينات مصل المتبقية ومكونات أخرى من وسائل الاعلام التي يمكن أن تربط بين وكيل وعلى النقيض من وضع العلامات تؤثر على الكفاءة.
- إضافة إلى وسائل الإعلام وسم القارورة ، ووضع الظهر القارورة في الحاضنة.
- بعد 2 ساعة ، إضافة 2ml من السفح بحيث يتم التوصل إلى التركيز النهائي للFCS 20 ٪. يتم ذلك للتأكد من أن الخلايا لا تتلقى التحفيز للتمييز ، ولكن بدلا من ذلك ينمو في بيئتهم المألوفة.
- احتضان خلايا اكثر من 18 ساعة. هذا هو أفضل ما ليلة وضحاها.
- في اليوم التالي ، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني ، ثم يعرض للتريبسين لهم كالمعتاد.
- trypsinized مرة واحدة ، وتعليق خلية يحتاج إلى أن تغسل 3 مرات للتخلص من البقايا ، عامل تباين في وسائل الإعلام الحرة. يتم ذلك مع PBS الطرد المركزي الخلايا في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
- يمكن معلق المباراة النهائية بيليه الخلية ومستعد لمزيد من التجارب.
- عدد الخلايا الآن ، كما قد تكون فقدت خلال بعض الخطوات السابقة الغسيل. كذلك ، نفذ اختبار جدوى في هذه المرحلة باستخدام مقايسة الاستبعاد التريبان الأزرق وتأخذ بعض العينات للتحليل الطيفي لقياس كفاءة التوسيم.
توسيم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع Ferumoxides
- لتبدأ ، لوحة للhESC في أطباق 10cm ، كالعادة. هذه الأطباق قبل المغلفة مع الجيلاتين ولقد الخلايا المغذية المشع عليها. يمكنك استخدام هذا البروتوكول للثقافات الفرعية حرة كذلك.
- السماح للhESC نعلق وتنمو لمدة 3-4 أيام تقريبا بحيث تشكل مستعمرات المتوسطة الحجم. خلال هذا الوقت ، تأكد من أن المستعمرات التي لا تنمو والكبيرة ، وأكبر المستعمرات هي اكثر صعوبة لكسر في وقت لاحق.
- خلايا متمايزة يمكن أن تلوث هذه الثقافات ، تبعا لذلك على نظافة المستعمرات ، قد تضطر إلى التخلص من الثقافات المتباينة من خلال التشريح.
- تعد وسائل الإعلام العلامات التي تتكون من Ferumoxides في تركيز وسائل الإعلام hESC 100μg/ml والكامل. لهذا ، نحن مزيج 89μl Ferumoxides و 10 مل من وسائط النمو الكامل.
- غسل الأطباق مرة واحدة مع وسائل الإعلام كاملة.
- إضافة 10 مل من العلامات وسائل الاعلام في صحن واحتضان الخلايا لمدة 4 ساعات.
- الآن ، ووضع العلامات كاملة. في الخطوة التالية ، فمن الضروري غسل الخلايا والحصول على تعليق خلية واحدة لاستخدامها مرة أخرى. لهذا ، أولا شطف الطبق مع برنامج تلفزيوني.
- ثم ، استبدال برنامج تلفزيوني مع 5ml من التربسين 0.25 ٪ واحتضان في الحاضنة لمدة 5 دقائق ، أو حتى فصل الخلايا. فهو يساعد على الاستفادة من طبق بشكل متكرر.
- وقد فصل الخلايا الآن. نضع في اعتبارنا انه اذا طبق الواردة أكبر المستعمرات قد يكون هناك بعض كتل اليسار.
- للتخلص من هذه كتل ، يمكن للمرء أن خلط تعليق كلها مرة واحدة باستخدام ماصة المصلية ، ثم السماح لها الجلوس لمدة 2 دقيقة.
- نحن لا تستخدم ماصة إيبندورف ، مص المتكررة وذلك اعتبارا من الخلايا من خلال التلميح رقيقة يمكن كسر أغشية الخلايا.
- إذا كتل المتبقية موجودة ، يمكن للمرء أن تشغيل نظام التعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40μm.
- إذا كان كل شيء يعمل بشكل صحيح ، تعليق خلية واحدة موجودة الان ان يختلط مع الكثير من الحطام ، ومصدره طلاء الجيلاتين ، وESC - مصفوفة الخلايا والأموات. للتخلص من هذا ، وغسل الخلايا مرتين من قبل الغزل عليهم في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق وresuspend لهم في وسائل الإعلام الكاملة.
- الآن ، ESC يحتاج إلى أن تكون معزولة عن الخلايا المغذية للإشعاع. يمكن القيام بذلك بكفاءة عن طريق طلاء تعليق الخلية على طبق الجيلاتين المغلفة.
- إذا لم يتم التلاعب بها الطبق ، وجميع الخلايا الرواسب إلى أسفل ، ولكن سوف نعلق مغذيات أسرع من ESC.
- هكذا ، إذا أخذ طاف الملعب بعد 45 دقيقة ، وينبغي أن يتضمن ESC أساسا ، في حين ينبغي أن يكون أساسا مغذيات تعلق على طبق.
- بهذه الطريقة ، يتم الحصول على تعليق من خلية واحدة تسمى مغناطيسيا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي يمكن استخدامها لمزيد من التجارب.
- كما هو الحال في البروتوكول السابق ، عند هذه النقطة ، تحتاج إلى عدد الخلايا وأخذ عينات لتقييم الجدوى وقياس كفاءة التوسيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصوير غير الغازية من الخلايا الجذعية هي حاسمة لرصد الخلايا الجذعية عمليا أي أساس العلاج. فهم أفضل للحركية في الجسم الحي من خلايا جذعية المسمى ، كما تصور في صور الرنين المغناطيسي ، يمكن أن تقود الطريق إلى العقلانية واستخدام أكثر فعالية من العلاجات المبنية على الخلايا الجذعية. منذ نستخدم عوامل التباين ينطبق سريريا وتقنيات التصوير ، ويجب أن تكون بروتوكولات لدينا قدم للترجمة بسهولة إلى التطبيقات في المرضى. التطبيقات السريرية المحتملة لأساليب عملنا يشمل التحقيق في عملية المقارنة لمختلف أنماط فرعية engraftment الخلايا الجذعية أو الخلايا الجذعية المعدلة وراثيا ، وكذلك ، وتقييم آثار العلاج على نتائج engraftment الخلايا الجذعية. وينبغي أن تكون النتائج مفيدة على الفور في التقييمات قبل السريرية لوقف القائم على العلاجات ، في تصميم التجارب السريرية ذات الصلة ، وفيما بعد ، في تقييم تلك العلاج بالخلايا الجذعية مقرها في الممارسة السريرية. من المذكرة ، أسلوبنا التصوير ينطبق أيضا على غيرهم من السكان الخلايا الجذعية ، مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا الجذعية العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد أيد هذا المشروع من خلال منحة ليون J. SEED تال من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي. ومولت من قبل توبياس هينينغ بحوث راتب من جمعية البحوث الألمانية (DFG ، وسعادة 4578/1-2). نحن نريد أن نعترف بامتنان مينيسيس خوانيتو لنصائحه حول ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
