Summary
För utvärdering av nya terapier stamceller är det viktigt att icke-invasivt spåra injicerade cellerna in vivo. Denna video visar hur du märka mänskliga mesenkymala och embryonala stamceller med järnoxid baserat kontrastmedel in vivo för senare MR in vivo.
Abstract
De senaste åren har stamcellsforskningen lett till en bättre förståelse av utvecklingsbiologi, olika sjukdomar och dess potentiella inverkan på regenerativ medicin. En icke-invasiv metod för att övervaka de transplanterade stamcellerna upprepade gånger in vivo skulle avsevärt förbättra vår förmåga att förstå de mekanismer som styr stamceller död och identifiera trofiska faktorer och signalvägar som förbättrar engraftment stamceller. MR har visat sig vara ett effektivt verktyg för in vivo skildring av stamceller med nästan mikroskopiska anatomisk upplösning. För att upptäcka stamceller med MR, cellerna måste märkas med cellspecifik MR kontrastmedel. För detta ändamål är nanopartiklar av järnoxid, som oxid superparamagnetiska järnpartiklar (SPIO), tillämpas, på grund av deras höga känslighet för cell-detektion och deras utmärkta biokompatibilitet. SPIO partiklar består av en järnoxid kärna och ett dextran, carboxydextran eller stärkelse päls, och fungerar genom att skapa lokala fältet inhomogeniteter, som orsakar en minskad signal på T2-viktad MR-bilder. Denna presentation kommer att demonstrera tekniker för märkning av stamceller med kliniskt gäller MR kontrastmedel för efterföljande icke-invasiva in vivo-spårning av den märkta celler med MR.
Protocol
Märkning av hMSC med Ferucarbotran
Detta är den teknik för märkning mänskliga mesenkymala stamceller med Ferucarbotran, en järnoxid baserat kontrastmedel för MR-avbildningar:
- Till att börja med platta celler 18-24 timmar innan märkningen förfarandet i T75 kolvar vid en sammanflödet av 80%. Om du använder en annan kultur maträtt, är detta lika med ca 10000 celler per cm 2.
- Nästa dag, börja med förbereda märkning medierna genom att tillsätta 30 ìl av Resovist till 8 ml serum fria medier. Detta kommer att etiketten en T75 kolv vid 80% confluency, motsvarande en koncentration av 100 mikrogram Fe / ml medier.
- Ta av odlingsmedia och tvätta cellerna en gång med PBS eller serum-fria medier. Detta görs för att få bort kvarvarande serum-proteiner och andra beståndsdelar i de medier som kunde binda kontrastmedlet och inflytande märkning effektivitet.
- Lägg märkningen media till kolven och sätta kolven tillbaka i inkubatorn.
- Efter 2 timmar, tillsätt 2 ml FCS så att en slutlig koncentration av 20% FCS uppnås. Detta görs för att säkerställa att cellerna inte får stimulans att differentiera, men i stället växer i sin invanda miljö.
- Inkubera cellerna över 18 timmar. Detta görs bäst över en natt.
- Nästa dag, spola cellerna med PBS, sedan trypsinize dem som vanligt.
- När trypsinized behöver cellsuspension som ska tvättas tre gånger för att bli av med rester, gratis kontrastmedel i media. Detta görs med PBS centrifugering av celler vid 400 RCF i 5 minuter.
- Den slutliga cellpelleten kan återsuspenderat och är klar för ytterligare experiment.
- Räkna celler som nu, som vissa kan ha gått förlorade under föregående tvätt steg. Dessutom utför livskraft testa på denna punkt med Trypan blå uteslutning analys och ta lite prover för spektrometrisk analys för att mäta märkning effektivitet.
Märkning av mänskliga embryonala stamceller med Ferumoxides
- Till att börja med plattan i hESC i 10cm rätter, som vanligt. Dessa rätter är redan belagda med gelatin och har bestrålat feeder celler på dem. Du kan använda detta protokoll för feeder-fri kulturer också.
- Låt hESC fästa och växa i ca 3-4 dagar så att de bildar medelstora kolonier. Under denna tid, se till att kolonierna inte växer till stora, som större kolonier är svårare att bryta upp senare.
- Differentierade celler kan förorena dessa kulturer, så beroende på renligheten i kolonierna, du kanske bli av med differentierade kulturer genom dissektion.
- Förbered märkning media som består av Ferumoxides vid en koncentration av 100μg/ml och full hESC medier. För detta blandar vi 89μl Ferumoxides och 10 ml av full tillväxt medier.
- Tvätta skålen gång med komplett media.
- Tillsätt 10 ml av märkning medier per fat och inkubera celler i 4 timmar.
- Nu är märkningen klar. I nästa steg är det nödvändigt att tvätta cellerna och få en enda cell suspension för vidare användning. För detta, skölj skålen med PBS.
- Sedan byter PBS med 5 ml 0,25% Trypsin och inkubera i inkubatorn i 5 minuter, eller tills cellerna lossnar. Det bidrar till att peka på skålen ofta.
- Cellerna har nu lossnat. Tänk på att om skålen innehöll större kolonierna det kan finnas några kvar klumpar.
- För att bli av med dessa klumpar kan man blanda hela suspension en gång med hjälp av en serologisk pipett, så låt det sitta i ytterligare 2 minuter.
- Vi använder inte ett Eppendorf-pipett, som upprepade suger av cellerna genom den tunna spetsen kan bryta cellmembranen.
- Om rester av klumpar är närvarande, kan man köra cellsuspension genom en 40μm cell sil.
- Om allt fungerat korrekt, det finns en enda cell fjädring nu att blandas med en massa skräp, som härstammar från gelatin beläggning, på ESC-matris och döda celler. För att bli av med detta, tvätta cellerna två gånger genom att snurra dem vid 400 RCF i 5 minuter och återsuspendera dem i full medier.
- Nu behöver ESK kan isoleras från det bestrålade feeder celler. Detta kan göras effektivt genom bordläggning cellsuspensionen på en gelatin-coated skålen.
- Om fatet inte är manipulerade, alla celler kommer sediment ner, men matare att fästa snabbare än ESK.
- Så om supernatanten tas av efter 45 minuter, bör det främst innehåller ESC, medan matare bör främst knytas till skålen.
- Detta sätt är en enda cell suspension av magnetiskt märkt mänskliga embryonala stamceller som kan användas för ytterligare experiment erhålls.
- Liksom i det tidigare protokollet på denna punkt, måste du räkna celler och ta prover för livskraft bedömning och mätning av märkning effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En icke-invasiv skildring av stamceller är avgörande för att övervaka praktiskt taget alla stamcellsbaserade terapi. En bättre förståelse av in vivo kinetiken av märkta stamceller, som visualiseras på MR-bilder kan leda vägen till en rationell och en effektivare användning av stamceller-baserade behandlingar. Eftersom vi använder kliniskt tillämpliga kontrastmedel och avbildningstekniker, bör våra presenteras protokoll vara lätt att överföra till program i patienter. Potentiella kliniska tillämpningar av våra metoder omfattar jämförande undersökningar av engraftment processen av olika subtyper stamceller eller genmanipulerade stamceller, liksom, bedömning av terapi inverkan på utfallet av stamceller engraftment. Resultat ska omedelbart hjälp i preklinisk bedömningar av Stem-baserade terapier, vid utformningen av relaterade kliniska prövningar, och senare, vid bedömningen av dessa stamceller cellbaserade terapier i klinisk praxis. Att notera är vår bildteknik också tillämplig på andra populationer stamceller, som hematopoetiska stamceller eller neuronala stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Projektet fick stöd av en Leon J. Thal SEED anslag från California Institute för regenerativ medicin. Tobias Henning har finansierats av ett Research stipendium från den tyska Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Vi vill tacksamt erkänna Juanito Meneses för hans råd om odling av mänskliga embryonala stamceller.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
