Summary
새로운 줄기 세포 요법의 평가는 생체내에 주입된 세포를 추적 비 invasively하는 것이 중요합니다. 이 동영상은 생체내의 후속 MR 영상에 대한 생체내의 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트와 인간 mesenchymal와 배아 줄기 세포를 레이블하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
최근에는 줄기 세포 연구는 발달 생물학, 각종 질병 및 재생 의료에 미치는 잠재적인 영향을 더 잘 이해하게되었다. 생체내에서 반복 이식 줄기 세포를 모니터링하는 비침습 방법은 크게 메커니즘을 이해하는 능력을 향상시킬 것이라는 제어 줄기 세포 죽음과 줄기 세포 engraftment을 향상 영양 요인과 신호 경로를 확인합니다. MR 영상은 근처의 미세한 해부 해상도 줄기 세포의 생체내 묘사에 대한 효과적인 도구로 입증되었습니다. MR과 함께 줄기 세포를 감지하기 위해서는 세포가 세포 특정 MR 대비 요원으로 표시해야합니다. 이 목적 들어, superparamagnetic의 철 산화물 입자 (SPIO)으로 철 산화물 nanoparticles은, 때문에 세포 검출과 우수한 biocompatibility 위해 고감도의 적용됩니다. SPIO 입자는 철 산화물 코어와 T2 - 가중 MR 영상에서 감소 신호를 발생 지역 현장 inhomogeneities를 만들어 dextran, carboxydextran 또는 전분 코팅, 그리고 기능으로 구성되어 있습니다. 이 프레 젠 테이션은 MR 영상과 레이블 세포의 생체내 추적에 후속 비침습에 대한 임상 적용 MR 대비 에이전트와 함께 줄기 세포의 라벨에 대한 기술을 설명합니다.
Protocol
Ferucarbotran과 hMSC의 라벨링
이것은 Ferucarbotran, MR 영상을위한 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트 인간 mesenchymal 줄기 세포를 라벨에 대한 기술입니다
- 시작하려면, 플레이트 18~24시간 80 % 합류에 T75 flasks의 라벨 절차 이전에 세포. 다른 문화 접시를 사용하는 경우이 cm 2 당 10000에 대한 세포 같습니다.
- 그 다음날, 혈청 무료 미디어 8 ML에 Resovist 30 μl를 추가하여 라벨 미디어를 준비로 시작합니다. 이것은 100 μg 철 / ML 미디어의 농도에 해당, confluency 80% 하나 T75 플라스크 레이블을 것입니다.
- 문화 미디어를 벗고 PBS 또는 혈청 무료 미디어 번 세포를 씻으십시오. 이것은 잔류 혈청 단백질과 대비 에이전트와 영향력 라벨 효율을 바인딩할 수있는 미디어의 다른 성분을 제거하기위한 것입니다.
- 술병에 상표 미디어를 추가하고 인큐베이터에있는 술병을 돌려 넣어.
- 2 시간 후에, 20 % FCS의 최종 농도가 달성되도록 FCS의 2ml를 추가합니다. 이것은 세포가 차별 자극을받지 않도록 할, 대신 자신의 친숙한 환경에서 성장합니다.
- 18시간을 통해 세포를 품어. 이것은 최고의 하룻밤 완료됩니다.
- 다음날, PBS로 세포를 씻어 후, 그들이 평소 trypsinize.
- 일단 trypsinized, 세포 현탁액은 미디어 잔류, 무료 대비 에이전트 없애 3 번 세탁해야합니다. 이것은 PBS 5 분 400 RCF에서 세포를 centrifuging하여 이루어집니다.
- 최종 세포 펠렛은 resuspended 더욱 실험을 준비하실 수 있습니다.
- 일부는 이전의 세척 단계 중 손실되었을 수도로서 세포를 계산합니다. 또한, Trypan 파랑 제외 분석을 사용하는이 시점에서 생존 테스트를 수행하고 라벨 효율을 측정하는 spectrometric 분석을위한 샘플을 채취.
Ferumoxides와 인간 배아 줄기 세포의 라벨링
- 시작하려면, 플레이트 10cm 요리에 hESC, 평소처럼. 이들 요리는 젤라틴으로 미리 코팅하고 그들에게 조사 피더 세포를합니다. 당신은뿐만 아니라 피더없는 문화에 대해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
- 그들은 중간 크기의 식민지를 형성 있도록 hESC는 첨부하여 약 3-4일에 대한 성장하자. 큰 식민지 나중에 이혼하는 것이 더 어려울 있으므로이 기간 동안, 식민지 큰 성장을하지 않도록.
- 차별화된 세포 너무 콜로니의 청결에 따라, 이러한 문화를 오염시킬 수있다, 당신은 절개로 차별 문화를 없애해야 할 수도 있습니다.
- 100μg/ml 및 전체 hESC 미디어의 농도에 Ferumoxides 구성되어 라벨 미디어를 준비합니다. 이를 위해, 우리는 89μl Ferumoxides 및 전체 성장 미디어 10 ML을 섞는다.
- 전체 미디어와 한 접시를 씻으십시오.
- 요리마다 미디어를 라벨링 10 ML을 추가하고 4 시간 동안 세포를 품어.
- 이제 라벨이 완료됩니다. 다음 단계에서, 그것은 세포를 씻어 더욱 사용하기 위해 단일 세포 현탁액을하는 것이 필요합니다. 이를 위해 먼저 PBS로 접시를 씻어.
- 그런 다음, 0.25 %의 트립신의 5ml으로 PBS를 교체 5 분 동안 인큐베이터에서 부화하거나, 세포가 분리까지. 그것은 자주 접시를 도청하는 데 도움이됩니다.
- 세포는 이제 분리했습니다. 요리가 큰 식민지가 포함된 경우 남은 대단히 짧은 시간이있을 것을 명심하십시오.
- 이 대단히 짧은 시간을 없애, 하나 serological 피펫을 사용하여 한 번 전체 중지를 섞을 수 있습니다 다음, 그것이 다른 2 분 앉아 보자.
- 우리는 세포 세포막을 깰 수있는 얇은 팁을 통해 세포의 반복으로 빨아을 Eppendorf 피펫을 사용하지 마십시오.
- 잔여 대단히 짧은 시간이 존재할 경우, 하나는 40μm 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 실행할 수 있습니다.
- 모든 올바르게 작동하는 경우, 단일 세포 현탁액 이제 ESC 매트릭스와 죽은 세포 젤라틴 코팅에서 발생하는, 파편의 많은 혼합되어 존재한다. 이 없애 5 분 400 RCF에서 그들을 회전하여 두 세포를 씻어 및 전체 미디어에서 그들을 resuspend.
- 자, ESC는 조사 피더 세포로부터 격리해야합니다. 이것은 젤라틴 - 코팅 접시에 세포 현탁액을 도금하여 효율적으로 수행할 수 있습니다.
- 접시가 조작하지 않으면, 모든 전지는 퇴적물 아래되지만 피더는 ESC보다 빠르게 연결할 수 있습니다.
- 모이통가 주로 요리에 연결되어 있어야하는 동안, 그래서 뜨는 45 분 후에 이륙있다면, 그것은 주로 ESC를 포함해야합니다.
- 이 방법은 추가 실험을 위해 사용할 수있는 자기 (磁 气)로 분류 인간의 배아 줄기 세포의 단일 세포 현탁액이 얻어진다.
- 이전 프로토콜과 마찬가지로,이 시점에서, 당신은 세포를 계산하고 라벨 효율성 생존 능력의 평가와 측정을위한 샘플을 채취해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
줄기 세포의 비침습 묘사는 거의 모든 줄기 세포 기반 치료를 모니터링 중요합니다. 표시 줄기 세포의 생체내의 속도론에의 더 나은 이해로 MR 이미지에 대한 시각, 합리적인 방법과 줄기 세포 기반 요법보다 효과적인 사용을 초래할 수 있습니다. 우리가 임상 적용 대조 대리인 및 이미징 기술을 사용 이후, 우리의 제공 프로토콜은 환자의 어플 리케이션에 쉽게 번역되어야합니다. 우리의 방법의 잠재적인 임상 응용 프로그램 비교 다양한 줄기 세포 subtypes 또는 유전자 조작 줄기 세포의 engraftment 프로세스의 조사뿐만 아니라, 줄기 세포 engraftment의 결과에 대한 치료 효과의 평가를 포함합니다. 결과는 임상 연습에서이 줄기 세포 기반 요법의 평가에, 나중에 관련 임상 시험의 설계에 줄기 기반 요법의 잠복기 평가에 즉시 도움이 될, 그리고해야합니다. 참고, 우리의 이미징 기술은 또한 조혈 줄기 세포 또는 줄기 세포의 연결과 같은 다른 줄기 세포 집단에 적용됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 프로젝트는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소에서 레온 J. Thal 시드 부여에 의해 지원되었다. 토바 이어스 헤닝는 독일 연구 협회 (DFG, HE 4578/1-2)에서 급비 연구에 의해 투자되었다. 우리는 기꺼이 그 인간의 배아 줄기 세포의 문화에 대한 그의 조언 후아의 Meneses을 인정 싶어요.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
