Summary
对于新的干细胞疗法的评价，它是重要的非侵入性的追踪体内注射细胞。该视频将告诉你如何标注随后在体内磁共振成像体内的氧化铁造影剂的人类间质细胞和胚胎干细胞。
Abstract
近年来，干细胞研究导致了一个更好地理解，发育生物学，各种疾病和再生医学上的潜在影响。一种非侵入性的方法来监视移植的干细胞在体内反复将大大提高我们的理解能力的机制，控制干细胞死亡，并确定营养因子及信号转导通路，提高干细胞植入。磁共振成像已被证明是一个有效的工具与附近的显微解剖分辨率的干细胞在体内的描述。为了检测与议员的干细胞，细胞与细胞特异性MR造影剂标记。为此，氧化铁纳米粒子，如超顺磁性氧化铁粒子（SPIO），适用的，因为他们的细胞检测，其优良的生物相容性的高灵敏度。超顺磁性氧化铁粒子组成的氧化铁核心和葡聚糖，carboxydextran或淀粉外衣，通过创建本地的外地的不均匀性，导致减少对T2加权MR图像信号的功能。本演示将展示技术与临床应用磁共振造影剂的干细胞，随后与磁共振成像的标记细胞在体内跟踪的非侵入性标签。
Protocol
标识与Ferucarbotran HMSC
这是标签与Ferucarbotran，氧化铁磁共振成像造影剂人类间质干细胞的技术：
- 首先，板18-24小时前标签程序在T75烧瓶在80％汇合的细胞。如果您使用一个不同的培养皿中，这是相等于约10000细胞每平方厘米 2 。
- 第二天，开始准备的标签介质，加入30μLResovist无血清媒体8毫升。将标签之一T75烧瓶中，在80％汇合对应一个铁100微克/毫升媒体的浓度。
- 起飞培养基，用PBS或无血清培养基洗细胞一次。这样做是为了清除残留的血清蛋白质和其他成分的媒体，可以结合造影剂和影响标记效率。
- 添加标签媒体烧瓶中，并把在孵化器的烧瓶回。
- 2小时后，加入使终浓度达到20％FCS的FCS2毫升。这样做是为了确保这些细胞没有收到刺激分化，而是在自己熟悉的环境中成长。
- 细胞培养超过18小时。这是最好的一蹴而就。
- 第二天，用PBS冲洗细胞，然后trypsinize他们像往常一样。
- 胰酶消化后，细胞悬液，需要洗3次，在媒体的残留，无造影剂摆脱。这是用PBS离心5分钟，在400 RCF细胞。
- 最后细胞沉淀重悬，并准备作进一步的实验。
- 现在，因为有些人可能已经在过去的洗涤步骤失去的细胞计数。此外，执行使用台盼蓝排斥实验点的可行性测试，并采取一些样品光谱分析测量标记效率。
人类胚胎干细胞的标记与 Ferumoxides
- 首先，板块10厘米菜的胚胎干细胞，像往常一样。这些菜是用明胶预涂，对他们的辐照饲养层细胞。您可以使用免费馈线文化，以及本议定书。
- 让我们的人类胚胎干细胞附着和生长约3-4天，使他们形成中等大小的菌落。在这段时间内，确保殖民地不长到大，更大的殖民地是更难以打破后的。
- 分化的细胞污染，使这些文化殖民地的清洁度而定，您可能已经摆脱夹层有区别的文化。
- 准备，由浓度100μg/ml和完整的人类胚胎干细胞媒体Ferumoxides标签媒体。对于这一点，我们的混合89μlFerumoxides全面增长媒体和10毫升。
- 洗净的菜，一次完整的媒体。
- 添加10毫升每盘媒体的标签，并培育了4个小时的细胞。
- 现在，标签是完整的。在接下来的步骤，它是要洗的细胞，并得到进一步利用单细胞悬液。对于这一点，首先用PBS冲洗菜。
- 然后，替换5毫升0.25％胰蛋白酶的PBS，并在孵化器中孵化5分钟，或直至细胞分离。它有助于挖掘的菜经常。
- 细胞分离。请记住，如果菜有较大的殖民地可能会有一些团块离开。
- 为了摆脱这些团块，可以混合一次使用血清学吸管整个悬浮液，然后让它坐在另2分钟。
- 我们不使用的Eppendorf移液器，透过薄薄的尖端细胞反复吸吮可以打破细胞膜。
- 如果剩余的团块，可以通过一个40微米的细胞过滤器运行的细胞悬液。
- 如果一切工作正常，单细胞悬液，现在存在着大量泥石混合，明胶涂层的ESC矩阵和死细胞。为了摆脱这个，洗细胞两次5分钟旋转400 RCF重悬在全媒体。
- 现在，人事编制小组委员会需要从辐照饲养层细胞中分离。这是可以做到有效的明胶涂层盘上镀细胞悬液。
- 如果菜是不是操纵，所有细胞将泥沙下来，但进料器将附加速度比ESC。
- 所以，如果45分钟后上清液，它应该包含主要是ESC键，而进料器主要应附菜。
- 这样，一个磁标记的人类胚胎干细胞，可用于进一步的实验中使用的单细胞悬液。
- 由于在以前的协议，在这一点上，你需要计数细胞标记效率的可行性评估和测量，并采取样品。
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Discussion
一个干细胞的非侵入性的描述是监测几乎所有的干细胞为基础的治疗是至关重要的。一个更好的理解，在标记的干细胞的体内动力学MR图像的可视化，可能导致理性的方式和更有效地利用干细胞疗法。由于我们使用了临床应用的造影剂和成像技术，我们提出的协议应随时翻译患者应用。潜在的临床应用我们的方法包括比较调查的各种亚型干细胞或基因改造的干细胞植入过程，以及评估结果的干细胞植入的治疗效果。结果应立即干为基础的疗法的临床前评估的有用，在相关的临床试验设计，及后，这些干细胞疗法在临床实践中的评估。值得注意的是，我们的成像技术也适用于其他的干细胞群，如造血干细胞或神经干细胞，。
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Acknowledgments
这个项目是一个莱昂J.塔尔从加州再生医学研究所的种子批。托比亚斯亨宁是由德国研究协会（DFG，何4578/1-2）津贴一个研究。我们要感谢他对人类胚胎干细胞培养的意见的华尼托Meneses。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
