Summary
Для оценки методов лечения, новых стволовых клеток важно неинвазивно трек вводили клетки в живом организме. Это видео покажет вам, как ярлык человека мезенхимальных и эмбриональных стволовых клеток с железом на основе оксида контрастных средств в естественных условиях для последующего МРТ в естественных условиях.
Abstract
В последние годы исследования стволовых клеток привела к лучшему пониманию биологии развития, различные заболевания и его потенциальное влияние на регенеративную медицину. Неинвазивный метод мониторинга пересаженные стволовые клетки многократно в естественных условиях в значительной степени повысит нашу способность понять механизмы, которые контролируют стволовых клеточной смерти и определить трофических факторов и сигнальных путей, которые улучшают приживления стволовых клеток. МРТ было доказано, что эффективным инструментом в естественных условиях изображением стволовые клетки с почти микроскопические разрешение анатомического. Для того, чтобы обнаружить стволовые клетки с MR, клетки должны быть помечены ячейки конкретных контрастных агентов MR. Для этой цели, оксид железа наночастицы, такие как суперпарамагнитных оксида железа частиц (Спио), применяются, из-за их высокой чувствительностью для обнаружения клеток и их отличную биосовместимость. Спио частицы состоят из основного оксида железа и декстрана, carboxydextran или крахмала пальто, и функции путем создания локальных неоднородностей поля, которые вызывают снижение сигнала на Т2-взвешенных МРТ. Эта презентация будет демонстрировать методы маркировки стволовыми клетками с клинически применимый агентов MR контраст для последующего неинвазивной в естественных условиях отслеживание меченых клеток с МРТ.
Protocol
Маркировка hMSC с Ferucarbotran
Это техника для маркировки мезенхимальных стволовых клеток человека с Ferucarbotran, оксид железа основан контрастное вещество для МРТ:
- Во-первых, плиты клетки 18-24 часов до процедуры маркировки в T75 колбах при впадении 80%. Если вы используете различные блюда культуры, это составляет около 10000 клеток на см 2.
- На следующий день, начните с подготовки маркировки СМИ, добавляя 30 мкл Resovist до 8 мл сыворотки свободных средств массовой информации. Это будет одна этикетка T75 колбу на 80% слияния, соответствующей концентрации 100 мкг Fe / мл СМИ.
- Сними питательных сред и промыть клетки сразу с PBS или сыворотки среде. Это сделано, чтобы избавиться от остаточных белков сыворотки крови и других составляющих СМИ, что может связывать контрастного вещества и эффективность влияния маркировки.
- Добавить маркировке средств массовой информации в колбу и поместить колбу обратно в инкубатор.
- Через 2 часа, добавить 2 мл ФТС таким образом, чтобы конечная концентрация 20% FCS достигнута. Это делается для того, чтобы клетки не получают стимул к дифференцировать, но вместо того, чтобы расти в привычной для них среде.
- Инкубируйте клеток в течение 18 часов. Лучше всего это делать на ночь.
- На следующий день промыть клетки с PBS, то trypsinize их как обычно.
- После трипсином, клеточной суспензии нужно промыть 3 раза, чтобы избавиться от остаточных, свободного агента контраста в средствах массовой информации. Это делается с помощью PBS центрифугирования клетки при 400 RCF течение 5 минут.
- Окончательный осадок клеток может быть ресуспендировали и готово для дальнейших экспериментов.
- Граф клетки теперь, как некоторые, возможно, были потеряны во время предыдущих этапов промывки. Кроме того, выполняют жизнеспособности тестирования на данном этапе использование Трипановый синий анализа исключение и принять некоторые образцы для спектрометрического анализа для оценки эффективности маркировки.
Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток с Ferumoxides
- Во-первых, плиты чЭСК в 10 см блюда, как обычно. Эти блюда предварительно покрытых с желатином и облученных клеток подачи на них. Вы можете использовать этот протокол для подачи без культурах.
- Пусть чЭСК и размножаются в течение примерно 3-4 дней, таким образом, что они образуют средних колоний. В течение этого времени, убедитесь, что колонии не растут до больших, как большие колонии труднее разбить позже.
- Дифференцированные клетки могут загрязнять этих культур, поэтому в зависимости от чистоты колонии, возможно, придется избавиться от дифференцированных культурах путем рассечения.
- Подготовка маркировке средств массовой информации, который состоит из Ferumoxides в концентрации 100μg/ml и полное СМИ чЭСК. Для этого мы смешиваем 89μl Ferumoxides и 10 мл полной питательной среды.
- Вымойте блюдо когда-то с полной СМИ.
- Добавьте 10 мл маркировке средств массовой информации за блюдо и инкубировать клетки в течение 4 часов.
- Теперь, маркировка является полным. На следующем этапе, необходимо мыть клетки и получить суспензии отдельных клеток для дальнейшего использования. Для этого сначала промыть посуду с PBS.
- Затем замените PBS с 5 мл 0,25% трипсина и инкубировать в инкубаторе в течение 5 минут, или пока клетки отделяются. Это помогает выявить блюдо часто.
- Клетками сейчас отключены. Имейте в виду, что если блюдо, содержащихся больших колоний там могут быть некоторые сгустки слева.
- Чтобы избавиться от этих сгустков, можно смешивать все подвески один раз, используя серологические пипетки, то пусть сидят в течение еще 2 минут.
- Мы не используем Эппендорф пипетки, как повторные сосать из клетки через тонкий наконечник может нарушить клеточные мембраны.
- Если остаточная сгустки присутствуют, можно запустить клеточной суспензии через сито 40 мкм клетки.
- Если все работает правильно, суспензии отдельных клеток существует в настоящее время, которая смешивается с большим количеством мусора, происходящих из желатина покрытия, ESC-матрицы и мертвых клеток. Чтобы избавиться от этого, мыть клетки в два раза, крутя их вниз на 400 RCF в течение 5 минут и ресуспендируют их в полном объеме средства массовой информации.
- Теперь, ESC должна быть изолирована от облученных клеток подачи. Это можно сделать эффективно при посеве клеточной суспензии на желатин покрытием блюдо.
- Если блюдо не манипулировали, все ячейки будут осадка вниз, но фидеров будет придавать быстрее, чем ESC.
- Так что, если супернатант снимается через 45 минут, он должен содержать основном ESC, а питатели должна в основном быть присоединен к блюду.
- Таким образом, суспензии отдельных клеток, магнитно-меченых человеческих эмбриональных стволовых клеток, которые могут быть использованы для дальнейших экспериментов получается.
- Как и в предыдущем протоколе, на данный момент, вы должны считать клетки и взять пробы для оценки жизнеспособности и измерение эффективности маркировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Неинвазивные изображением стволовых клеток имеет решающее значение для мониторинга практически любой стволовых клеток терапия. Лучшего понимания кинетики естественных меченых стволовых клеток, как визуализация на МРТ, может привести способ рационального и более эффективного использования стволовых клеточной терапии. Так как мы используем клинически применимый контрастных веществ и методов визуализации, наши представлены протоколы должны быть легко переводимый на приложения у пациентов. Потенциальные клинического применения наших методы включают в себя сравнительные исследования приживления процесс различных подтипов стволовых клеток или генетически модифицированных стволовых клеток, а также, оценка эффектов терапии на исход стволовых приживления клеток. Результаты должны быть немедленно полезным в доклинической оценки стволовой терапии на основе, в разработке соответствующих клинических испытаний, а затем, в оценке этих стволовых клеточной терапии в клинической практике. Следует отметить, что наши изображения метод также применим и к другим стволовых клеток населения, таких как гемопоэтических стволовых клеток или стволовых клеток нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан Леон Дж. Тал грант SEED Калифорнийского института регенеративной медицины. Тобиас Хеннинг было профинансировано исследований стипендию от немецкого исследовательская ассоциация (DFG, Его 4578/1-2). Мы хотим выразить искреннюю признательность Хуанито Менесес за его советы по культуре эмбриональных стволовых клеток человека.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
