Summary
Para a avaliação de terapias com células-tronco é importante não invasiva track as células injetadas in vivo. Este vídeo irá mostrar-lhe como rotular as células-tronco mesenquimais e embrionárias com óxido de ferro agentes de contraste com base in vivo para posterior ressonância magnética in vivo.
Abstract
Nos últimos anos, investigação em células estaminais tem levado a uma melhor compreensão da biologia do desenvolvimento, várias doenças e seu impacto potencial na medicina regenerativa. Um método não-invasivo para monitorar as células-tronco transplantadas repetidamente in vivo, aumentaria consideravelmente a nossa capacidade de compreender os mecanismos que controlam a morte de células-tronco e identificar fatores tróficos e vias de sinalização que melhoram o enxerto de células-tronco. RM tem sido provado ser uma ferramenta eficaz para a representação em vivo das células-tronco com resolução anatômica perto microscópica. A fim de detectar células-tronco com MR, as células têm de ser rotulados com células agentes de contraste específicos MR. Para este fim, as nanopartículas de óxido de ferro, tais como partículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIO), são aplicados, por causa de sua alta sensibilidade para a detecção de células e sua excelente biocompatibilidade. SPIO partículas são compostas de um núcleo de óxido de ferro e um casaco de dextran, carboxydextran ou amido, e função, criando inomogeneidades de campo local, que causam uma diminuição do sinal em imagens ponderadas em T2 MR. Esta apresentação vai demonstrar técnicas para a rotulagem de células-tronco com agentes de contraste clinicamente aplicáveis MR para posterior não-invasiva no rastreamento vivo das células marcadas com ressonância magnética.
Protocol
Rotulagem de hMSC com Ferucarbotran
Esta é a técnica para a rotulagem de células-tronco mesenquimais com Ferucarbotran, um óxido de ferro agente de contraste para ressonância magnética com base:
- Para começar, a chapa do células 18-24 horas antes do procedimento de rotulagem em frascos de T75 em uma confluência de 80%. Se você usar uma placa de cultura diferente, isso é equivalente a cerca de 10 mil células por cm 2.
- No dia seguinte, começar a preparar os meios de comunicação de rotulagem, pela adição de 30 mL de Resovist a 8 ml de soro de mídia livre. Isto rótulo de um frasco T75, 80% confluência, correspondendo a uma concentração de 100 mg Fe / ml mídia.
- Tire os meios de cultura e lavar as células uma vez com PBS ou soro livre de mídia. Isto é feito para se livrar de proteínas do soro residual e outros constituintes dos meios de comunicação que pudesse vincular o agente de contraste e eficiência rotulagem influência.
- Adicionar a mídia de rotulagem para o frasco e colocar o balão de volta na incubadora.
- Após 2 horas, adicionar 2 ml de FCS para que uma concentração final de FCS de 20% seja alcançado. Isto é feito para garantir que as células não recebem estímulo para diferenciar, mas sim crescer em seu ambiente familiar.
- Incubar as células com mais de 18 horas. Este é o melhor feito durante a noite.
- No dia seguinte, lavar as células com PBS, então trypsinize-los como de costume.
- Uma vez tripsinizados, a suspensão de célula precisa ser lavado 3 vezes para se livrar de agente de contraste residual, livre na mídia. Isto é feito com PBS centrifugação as células a 400 rcf durante 5 minutos.
- A final pellet celular pode ser colocado em suspensão e está pronto para novas experiências.
- Contar as células agora, como alguns poderiam ter sido perdidas durante as etapas anteriores de lavagem. Além disso, realizar o teste de viabilidade neste momento utilizando o ensaio de exclusão Trypan blue e tomar algumas amostras para análise de espectrometria para medir a eficiência rotulagem.
Rotulagem de células estaminais embrionárias humanas com Ferumoxides
- Para começar a placa, o CTEh em pratos de 10cm, como de costume. Estes pratos são pré-revestidas com gelatina e têm células alimentadoras irradiada sobre eles. Você pode usar este protocolo para alimentação livre de culturas também.
- Deixe o CTEh anexar e crescer para cerca de 3-4 dias, para que elas formam colônias de tamanho médio. Durante este tempo, garantir que as colônias não crescem a grande, como colônias maiores são mais difíceis de quebrar mais tarde.
- Células diferenciadas podem contaminar essas culturas, por isso, dependendo da limpeza das colônias, você pode ter que se livrar de culturas diferenciadas por dissecção.
- Prepare a mídia rotulagem que consiste em Ferumoxides a uma concentração de meios de comunicação CTEh 100μg/ml e cheio. Para isso, misture 89μl Ferumoxides e 10 ml de meio de crescimento integral.
- Lavar o prato uma vez com a mídia completo.
- Adicionar 10 ml de rotulagem de mídia por prato e incubar as células durante 4 horas.
- Agora, a rotulagem é completa. Na próxima etapa, é necessário lavar as células e obter uma suspensão única célula para uso posterior. Para isso, primeiro lave o prato com PBS.
- Então, substituir o PBS com 5 ml de tripsina 0,25% e incubar na incubadora por 5 minutos, ou até que as células detach. Ela ajuda a tocar o prato com freqüência.
- As células já destacados. Tenha em mente que, se o prato continha grandes colônias pode haver alguns aglomerados esquerda.
- Para se livrar desses aglomerados, pode-se misturar toda a suspensão uma vez, usando uma pipeta sorológica, em seguida, deixe descansar por mais 2 minutos.
- Nós não usamos uma pipeta Eppendorf, sugando como repetidas das células através da ponta fina pode quebrar as membranas celulares.
- Se clumps residual estão presentes, pode-se executar a suspensão de células através de um filtro de células 40μm.
- Se tudo funcionou corretamente, uma suspensão única célula já existe que é misturado com um monte de detritos, provenientes do revestimento de gelatina, o CES-matriz e células mortas. Para se livrar disso, lave as células duas vezes girando-os para baixo a 400 rcf durante 5 minutos e ressuspender-los nos meios de comunicação completa.
- Agora, o CES precisa ser isolado a partir de células de alimentação irradiados. Isto pode ser feito de forma eficiente por plaqueamento da suspensão de células em um prato de gelatina-revestido.
- Se o prato não é manipulado, todas as células do sedimento vai para baixo, mas os alimentadores irá anexar mais rápido que o ESC.
- Assim, se o sobrenadante é retirado após 45 minutos, ele deve conter principalmente ESC, enquanto os alimentadores devem ser, sobretudo, ligado ao prato.
- Desta forma, uma única célula de suspensão magnética rotulados células estaminais embrionárias humanas que podem ser usados para novas experiências é obtido.
- Como no protocolo anterior, neste ponto, é preciso contar as células e colher amostras para avaliação da viabilidade e medição de eficiência rotulagem.
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Discussion
A representação não-invasivo de células-tronco é fundamental para o monitoramento praticamente qualquer terapia com células-tronco baseado. Uma melhor compreensão da na cinética in vivo de células-tronco rotulados, como visualizado nas imagens de RM, podem liderar o caminho para uma racional e uma utilização mais eficaz da haste terapias baseadas em células. Desde que nós usamos agentes de contraste clinicamente aplicáveis e técnicas de imagem, os nossos protocolos apresentados devem ser facilmente traduzíveis para aplicações em pacientes. Potenciais aplicações clínicas dos nossos métodos incluem investigações comparativas do processo de enxerto de subtipos de células-tronco diferentes, ou células-tronco geneticamente modificadas, bem como, a avaliação dos efeitos da terapia sobre o resultado do enxerto de células-tronco. Os resultados devem ser imediatamente útil nas avaliações pré-clínicas de terapias baseadas em tronco, na concepção de ensaios clínicos relacionados e, posteriormente, na avaliação daqueles com células-tronco terapias baseadas na prática clínica. De nota, a nossa técnica de imagem também é aplicável a outras populações-tronco de células, como células-tronco hematopoiéticas ou células-tronco neuronais.
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Acknowledgments
Este projeto foi suportado por uma concessão SEED Leon J. Thal do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia. Tobias Henning foi financiado por uma bolsa de Pesquisa do alemão Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Queremos agradecem Meneses Juanito para o seu conselho sobre a cultura de células estaminais embrionárias humanas.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
