Summary
Eiwitten binden aan filamenteuze actine (F-actine) door middel van verschillende actine-bindend modules. In deze video laten we zien de procedure van de actine co-sedimentatie, die een in vitro test routinematig gebruikt om eiwitten of specifieke domeinen die binden F-actine te analyseren.
Abstract
Het actine cytoskelet in de cel is een netwerk van actine filamenten die de beweging van cellen en cellulaire processen toelaat, en dat genereert spanning en helpt behoudt cellulaire vorm. Hoewel het actine cytoskelet is een rigide structuur, het is een dynamische structuur die constant is remodeling. Een aantal van de eiwitten kunnen binden aan het actine cytoskelet. De binding van een bepaald eiwit tot F-actine is vaak gewenst is om celbiologische waarnemingen te ondersteunen of om verder te begrijpen dynamische processen als gevolg van verbouwing van het actine cytoskelet. De actine co-sedimentatie assay is een in vitro test routinematig gebruikt om de binding van specifieke eiwitten of eiwit-domeinen met een F-actine te analyseren. De uitgangspunten van de test gepaard gaan met een incubatie van het eiwit van belang (volledige lengte of het domein van) met F-actine, ultracentrifugatie stap naar pellet F-actine en analyse van het eiwit co-sedimenting met F-actine. Actine co-sedimentatie testen kunnen daarom worden ontworpen om actine bindingsaffiniteiten en in concurrentie testen te meten.
Protocol
1. De voorbereiding van actine
De bron van actine die in deze test was niet-spier menselijke bloedplaatjes (β-actine) verkregen van cytoskelet Inc Stock fracties bij 10 mg / ml worden bewaard in de -70 º C vriezer. Voor de test, is het actine verdund tot 0,4 mg / ml in een buffer die 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP en 0,5 mM DTT, gecentrifugeerd bij 20.000 g gedurende 10 minuten bij 4 º C. De bovenstaande vloeistof, die wordt monomere actine is klaar om te worden gepolymeriseerd. Actine polymerisatie wordt veroorzaakt door de toevoeging 50 mM KCl, 1 mM ATP en 2 mM MgCl 2. De polymerisatie gebeurt bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
2. Toebereiding van proteïne
In deze test gebruiken we de C-terminus van Tallinn, die is gezuiverd als een GST-gelabeld eiwit. Het eiwit te gebruiken in de test wordt onderworpen aan een hoge snelheid centrifugeren om pre-clear van aggregaten voorafgaand aan de incubatie met F-actine.
Het eiwit wordt gesponnen bij 100.000 g in een Beekman ultracentrifuge voor 20 minuten bij 22 º C.
3. Actine-eiwit Incubatie
De hoeveelheid actine en eiwit in een assay zal variëren. In dit voorbeeld gebruiken we actine in overmaat. Normaal gesproken wordt een molaire verhouding berekend, bijvoorbeeld. een 4:1 molaire verhouding van actine aan eiwit.
In de volgende test, het uiteindelijke reactie volume is 150 pl. De buffer, waarin het eiwit en F-actine worden geïncubeerd zal afhangen van het eiwit te testen en over het vereiste voorwaarden. In dit voorbeeld gebruiken we een buffer die 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 en 2 mM MgCl 2. Het eiwit-en F-actine worden geïncubeerd in de buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
4. Sedimentatie van F-actine
Na de incubatie, zijn de monsters gecentrifugeerd bij 100.000 g bij 22 º C. We maken gebruik van een Beekman ultracentrifuge in de video. De rotor is voorzichtig verwijderd, omdat niet aan de pellets verstoren.
5. Analyse van proteïne co-afzetting met F-actine
De supernatanten worden zorgvuldig verwijderd door pipetteren in een eppendorfbuisje en 5 X Laemmli SDS-PAGE sample buffer wordt toegevoegd. Een geschikt volume van een X Laemmli SDS-PAGE sample buffer wordt toegevoegd aan de pellets resterende gepipetteerd op en neer, en overgebracht naar nieuwe eppendorf buizen. De relatieve hoeveelheden van eiwit in de pellets en de supernatanten worden geanalyseerd na hun scheiding door SDS-PAGE en Coomassie Blue kleuring van de gel of Western blotting.
Met het oog op de specificiteit van eiwit interacties te bepalen met actine, de concentratie actine-afhankelijke co-afzettingen kunnen worden uitgevoerd. Voor dit soort van experiment, een vast bedrag van het eiwit en een reeks van toenemende hoeveelheden van actine worden geïncubeerd, en de analyse wordt uitgevoerd zoals hierboven beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Actine co-sedimentatie is een eenvoudig in vitro test op specfic eiwitten binden aan F-actine te analyseren. In deze video, tonen we een voorbeeld van hoe een eenvoudige actine co-sedimentatie kan worden uitgevoerd. Laten we zien hoe F-actine te bereiden, voor te bereiden het eiwit te testen en de procedure van actine co-sedimentatie. Een aantal punten moet worden overwogen wanneer het uitvoeren van actine co-sedimentatie assays. Zo kan de buffer componenten voor de incubatie variëren, afhankelijk van het eiwit te worden getest en pH, temperatuur en zoutconcentratie kunnen invloed hebben op de binding aan F-actine. We hebben aangetoond dat een eenvoudige binding aan F-actine, maar dit soort van test kan worden uitgewerkt en gebruikt om bindende specificiteit van een eiwit of eiwit-domein aan F-actine te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dank aan dr. Praveen Kumar in de Wittman lab aan de UCSF voor de film van actine in HaCAT cellen.
References
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
