Summary
Proteinler, farklı aktin bağlayıcı modüller aracılığıyla ipliksi aktin (F-aktin) bağlanır. Bu video in vitro testinin rutin olarak, F-aktin bağlayan proteinler ya da belirli etki analiz etmek için kullanılan bir co-sedimantasyon, aktin prosedürü göstermektedir.
Abstract
Hücre içinde aktin hücre iskeleti, hücre ve hücresel süreçlerin hareketi sağlayan aktin filamentler bir ağ ve bu gerilim üretir ve hücresel şeklini korur yardımcı olur. Aktin hücre iskeletinin sert bir yapısı olmasına rağmen, sürekli remodeling dinamik bir yapıdır. Proteinlerin çok sayıda aktin hücre iskeletinin bağlayabilirsiniz. F-aktin belirli bir protein bağlayıcı genellikle hücre biyolojik gözlemler ya da daha fazla aktin hücre iskeletinin yeniden şekillenme nedeniyle dinamik süreçleri anlamak için arzu edilir. Aktin co-sedimantasyon tahlil spesifik proteinlerin veya F-aktin protein etki bağlama rutin analiz etmek için kullanılan in vitro tayininde. Testin temel ilkeleri, F-aktin ile ilgi protein bir inkübasyon (tam uzunlukta veya etki alanı), F-aktin ile birlikte sedimenting protein pelet F-aktin ve analiz Ultrasantrifügasyon adım içerir. Aktin co-sedimantasyon deneyleri aktin bağlayıcı yakınlık ve rekabet deneyleri ölçmek için buna göre dizayn edilebilir.
Protocol
1. Aktin hazırlanması
Bu testte kullanılan aktin kaynağı Sitoiskelet A.Ş. Menkul Kıymetler alikotları 10 mg / ml -70 º C derin dondurucuda muhafaza elde kas olmayan insan trombositler (β-aktin) oldu. Testi için, aktin 4 º C'de 10 dakika 20.000 g de santrifüj 5 mM Tris pH: 8, 0.2 mM CaCl 2, 0.2 mM ATP ve 0,5 mM DTT, içeren bir tampon 0.4 mg / ml 'ye seyreltilerek Monomerik aktin süpernatant polimerize olmaya hazırdır. Aktin polimerizasyonu Ayrıca 50 mM KCI, 1 mM ATP ve 2 mM MgCl 2 tarafından indüklenir. 1 saat oda sıcaklığında polimerizasyon oluşur.
2. Protein hazırlanması
Bu testte, Talin, GST etiketli bir protein olarak saflaştırılmış C-terminalindeki kullanıyor. F-aktin ile protein tayininde kullanılmak üzere agrega öncesi temizlemek için yüksek hızda santrifüj önce inkübasyon tabi tutulur.
Protein, 22 º C'de 20 dakika süreyle Beckman ultrasantrifüjdeki 100.000 g spun
3. Aktin-protein Kuluçka
Tayininde aktin ve protein miktarı değişecektir. Bu örnekte, aşırı aktin kullanarak. Normalde, bir molar oranı örneğin, hesaplanır. protein aktin 04:01 molar oranı.
Aşağıdaki tahlil, son reaksiyon hacmi 150 ul. Protein ve F-aktin inkübe olduğu tampon protein test edilecek ve gerekli koşullara bağlı olacaktır. Bu örnekte, 10 mM Tris, pH 7.0, 1 mM ATP, 0.2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl 2 ve 2 mM MgCl 2 içeren bir tampon kullanın. Protein ve F-aktin tampon oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilir.
4. F-aktin, Sedimantasyon
Inkübasyon sonrasında, örnekleri 22 º C'de 100.000 g spun Biz video Beckman ultrasantrifüjdeki kullanın. Rotor dikkatle pelet rahatsız değil kaldırılır.
5. F-aktin protein co-sedimentasyon analizi
Süpernatantlar dikkatle Eppendorf tüp ve 5 X Laemmli SDS-PAGE örnek tampon içine pipetleme kaldırılır eklenir. 1 X Laemmli SDS-PAGE numune tamponu uygun bir hacmi, kalan pelet kadar pipetlenir ve aşağı ve yeni Eppendorf tüplerine aktarılır. SDS-PAGE jel veya Western blotting Coomassie Mavi boyama ayırma pelet ve süpernatantlar protein göreceli miktarları analiz edilmektedir.
Aktin-tortularını konsantrasyon-bağımlı, aktin protein etkileşim özgüllüğünü belirlemek amacıyla yapılabilir. Için deney, sabit bir miktarda protein ve aktin artan miktarlarda bir dizi bu tür inkübe edilir ve yukarıda açıklandığı gibi analizler yapılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aktin co-sedimantasyon, F-aktin bağlayıcı specfic proteinleri analiz etmek için basit bir in vitro tahlil. Bu videoda, basit bir aktin co-sedimantasyon yapılabilir nasıl bir örnek göstermektedir. Biz F-aktin hazırlamak için nasıl test edilecek protein ve aktin prosedürü co-sedimantasyon hazırlamak. Aktin co-sedimantasyon deneyleri yaparken puan sayısı dikkate alınmalıdır. Örneğin, kuluçka için tampon parçaları, test edilmesi ve pH, sıcaklık ve tuz konsantrasyonu F-aktin bağlayıcı etkileyebilir protein bağlı olarak değişebilir. Biz F-aktin basit bir bağlama, ancak bu tür testin üzerine özenli ve F-aktin bir protein ya da protein etki bağlama özgüllüğünü belirlemek için kullanılabilir göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
HaCAT hücreleri aktin film için UCSF Wittman laboratuarında Dr. Praveen Kaya için teşekkür ederiz.
References
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
