Summary
חלבונים הנקשרים אקטין פילמנטיות (F-אקטין) באמצעות מודולים שונים אקטין מחייב. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את ההליך של אקטין שיתוף שקיעה, אשר מהווה ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח חלבונים או תחומים ספציפיים הנקשרים F-אקטין.
Abstract
Cytoskeleton אקטין בתוך התא היא רשת של סיבי אקטין המאפשר תנועה של תאים תהליכים תאיים, וזה יוצר מתח ומסייעת שומרת צורה הסלולר. למרות cytoskeleton אקטין הוא מבנה נוקשה, היא מבנה דינמי כי היא כל הזמן שיפוץ. מספר חלבונים יכולים להיקשר cytoskeleton אקטין. הכריכה של חלבון מסוים ל-F-אקטין הוא הרצוי לעתים קרובות כדי לתמוך תצפיות תא ביולוגי או יותר להבין תהליכים דינמיים עקב שיפוץ cytoskeleton אקטין. Assay שיתוף שקיעה אקטין הוא ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח את הכריכה של חלבונים ספציפיים או תחומים עם החלבון אקטין-F. העקרונות הבסיסיים של assay לערב דגירה של החלבון של עניין (אורך תחום מלא או של) עם ה-F-אקטין, צעד ultracentrifugation ל-F אקטין גלולה וניתוח של החלבון שיתוף sedimenting עם אקטין-F. אקטין שיתוף שקיעה מבחני יכול להיות מתוכנן בהתאם למדידת זיקות אקטין מחייב מבחני התחרות.
Protocol
1. הכנת אקטין
מקור אקטין בשימוש assay זה היה בלתי אנושי שריר טסיות (β-אקטין) המתקבל cytoskeleton aliquots בע"מ במלאי ב 10 מ"ג / מ"ל נשמרים במקפיא -70 מעלות צלזיוס. עבור assay, אקטין הוא מדולל ל 0.4 מ"ג / מ"ל במאגר המכיל 5 מ"מ טריס pH 8, 0.2 מ"מ CaCl 2, 0.2 ו - 0.5 mM ATP DTT מ"מ, centrifuged ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 º C. Supernatant, אשר אקטין monomeric הוא מוכן להיות polymerized. פילמור אקטין הוא המושרה על ידי 50 בנוסף KCl mM, 1 mM ATP ו - 2 מ"מ MgCl 2. פילמור מתרחש בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
2. הכנה של חלבון
ב assay זה, אנו משתמשים C-הסופית של תלין, אשר כבר מטוהרים כמו חלבון GST-תייג. חלבון לשמש assay נתונה צנטריפוגה מהיר מראש ברור של אגרגטים לפני הדגירה עם אקטין-F.
חלבון הוא הסתובב בבית גרם 100,000 ב ultracentrifuge Beckman במשך 20 דקות ב 22 º C.
3. החלבון אקטין דגירה
כמות החלבון אקטין assay ישתנו. בדוגמה זו אנו משתמשים אקטין עודף. בדרך כלל, יחס טוחנת מחושבת, למשל. יחס של 4:01 טוחנת אקטין לחלבון.
ב assay הבאה, היקף התגובה הסופית היא 150 μl. חיץ שבו חלבון ו-F-אקטין מודגרת יהיה תלוי החלבון להיבדק על התנאים הנדרשים. בדוגמה זו, אנו משתמשים למאגר המכיל 10 mM טריס pH 7.0, 1 mM ATP, 0.2 מ"מ DTT, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl 2 ו - 2 מ"מ MgCl 2. חלבון ו-F-אקטין מודגרת במאגר שעה 1 בטמפרטורת החדר.
4. שקיעה של ה-F-אקטין
לאחר דגירה, הדגימות הם הסתחררו ב 100.000 גרם ב 22 º C. אנו משתמשים ultracentrifuge Beckman בסרטון. הרוטור הוא הסיר בזהירות כדי לא להפריע את כדורי.
5. ניתוח של חלבון שיתוף שקיעה עם ה-F-אקטין
Supernatants יוסרו בקפידה על ידי pipetting לתוך צינור Eppendorf ו 5 X Laemmli SDS-PAGE חיץ המדגם הוא הוסיף. נפח מתאים של 1 חיץ X SDS-PAGE מדגם Laemmli הוא הוסיף את כדורי הנותרים, pipetted למעלה ולמטה, והועבר צינורות חדשים Eppendorf. הסכומים היחסית של החלבון את כדורי ואת supernatants מנותחים לאחר הפרידה שלהם על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים כחול של ג'ל או המערבי סופג.
על מנת לקבוע את הספציפיות של אינטראקציה עם החלבון אקטין, אקטין ריכוז תלויי שיתוף sedimentations יכול להתבצע. עבור סוג זה של הניסוי, סכום קבוע של החלבון וכן סדרה של כמויות גדלות והולכות של אקטין מודגרת, והניתוח מתבצע כמתואר לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אקטין שיתוף שקיעה היא פשוטה assay במבחנה לנתח חלבונים specfic מחייב אקטין-F. בסרטון הזה, אנחנו מראים דוגמה אחת לאופן שבו אקטין פשוט שיתוף שקיעה יכול להתבצע. אנחנו מראים איך להכין את ה-F-אקטין, להכין את חלבון להיבדק לבין הליך של אקטין שיתוף שקיעה. מספר נקודות צריך להיחשב בעת ביצוע אקטין שיתוף שקיעה מבחני. למשל, מרכיבי חיץ עבור הדגירה יכול להשתנות בהתאם החלבון להיבדק, pH טמפרטורה ריכוז מלח עלול להשפיע על כבילת אקטין-F. אנחנו הוכיחו מחייב פשוטה F-אקטין, אבל זה סוג של assay ניתן פירט על ומשמש כדי לקבוע סגוליות המחייב של תחום חלבון או חלבון ל-F אקטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
תודה ד"ר פדרו קומאר במעבדה ויטמן באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו לסרט של אקטין בתאים HaCAT.
References
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
