Summary
Proteínas se ligam à actina filamentosa (F-actina) através de módulos de actina de ligação distinto. Neste vídeo podemos demonstrar o procedimento de actina co-sedimentação, que é um ensaio in vitro rotineiramente usado para analisar proteínas ou domínios específicos que se ligam F-actina.
Abstract
O citoesqueleto de actina no interior da célula é uma rede de filamentos de actina que permite o movimento de células e processos celulares, e que gera tensão e ajuda a manter a forma celular. Embora o citoesqueleto de actina é uma estrutura rígida, é uma estrutura dinâmica que está em constante remodelação. Uma série de proteínas pode se ligar ao citoesqueleto de actina. A ligação de uma proteína particular para F-actina é muitas vezes desejada para suporte de células observações biológicas ou para entender melhor os processos dinâmicos, devido à remodelação do citoesqueleto de actina. O ensaio de actina co-sedimentação é um ensaio in vitro rotineiramente usados para analisar a ligação de proteínas específicas ou domínios de proteína com F-actina. Os princípios básicos do ensaio envolve um período de incubação da proteína de interesse (comprimento total ou de domínio de) com F-actina, passo ultracentrifugação para pellet F-actina e análise da proteína co-sedimentação com F-actina. Actina co-sedimentação ensaios podem ser desenvolvidos de acordo com medida afinidades de ligação de actina e ensaios na competição.
Protocol
1. Preparação de actina
A fonte de actina utilizado neste ensaio foi não-muscular plaquetas humanas (β-actina) obtido a partir de alíquotas Citoesqueleto Inc. Ações em 10 mg / ml são mantidas no congelador -70 º C. Para o ensaio, a actina é diluído a 0,4 mg / ml em tampão contendo 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP e 0,5 mM DTT, centrifugado a 20.000 g por 10 minutos a 4 º C. O sobrenadante, que é actina monomérica está pronto para ser polimerizada. Polimerização de actina é induzida pela adição de 50 mM KCl, 1 mM de ATP e 2 mM MgCl 2. A polimerização ocorre em temperatura ambiente por 1 hora.
2. Preparação de proteínas
Neste ensaio, estamos usando o C-terminal de talina, que foi purificada como uma proteína GST-marcados. A proteína a ser utilizada no ensaio é submetido a uma centrifugação de alta velocidade para pré-claro dos agregados antes da incubação com F-actina.
A proteína é girada a 100.000 g em uma ultracentrífuga Beckman por 20 minutos a 22 º C.
3. Actina-proteína Incubação
A quantidade de actina e proteína em um ensaio irá variar. Neste exemplo estamos usando actina em excesso. Normalmente, uma relação molar é calculado, por exemplo. uma proporção de 4:1 molar de actina à proteína.
No ensaio seguinte, o volume final de reação é de 150 mL. O buffer em que a proteína e F-actina são incubados dependerá da proteína a ser testado e sobre as condições exigidas. Neste exemplo, usamos uma solução tampão contendo 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM de ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 e 2 mM MgCl 2. A proteína e F-actina são incubados no buffer por 1 hora à temperatura ambiente.
4. Sedimentação de F-actina
Após a incubação, as amostras são giradas em 100.000 g a 22 º C. Nós usamos uma ultracentrífuga Beckman no vídeo. O rotor é cuidadosamente removida para não atrapalhar as pelotas.
5. Análise de proteínas co-sedimentação com F-actina
Os sobrenadantes são cuidadosamente removidas por pipetagem em um tubo eppendorf e 5 X tampão de amostra Laemmli SDS-PAGE é adicionado. Um volume adequado de um tampão de amostra Laemmli X SDS-PAGE é adicionado à pellets restantes, pipetados cima e para baixo, e transferidos para novos tubos eppendorf. A quantidade relativa de proteína na pellets e sobrenadantes são analisados após a sua separação por SDS-PAGE e coloração Coomassie azul do gel ou Western blotting.
A fim de determinar a especificidade de interação da proteína com a actina, actina dependente da concentração co-sedimentações pode ser realizada. Para este tipo de experimento, uma quantidade fixa de proteína e uma série de quantidades crescentes de actina são incubados, ea análise é realizada como descrito acima.
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Discussion
Actina co-sedimentação é um simples ensaio in vitro para analisar proteínas specfic ligação a F-actina. Neste vídeo, demonstramos um exemplo de como um simples actina co-sedimentação pode ser realizada. Vamos mostrar como preparar F-actina, prepare a proteína a ser testada e do procedimento de actina co-sedimentação. Um número de pontos devem ser considerados na realização de actina co-sedimentação ensaios. Por exemplo, os componentes do tampão para a incubação pode variar de acordo com a proteína a ser testada e pH, temperatura e concentração de sal pode afetar a ligação a F-actina. Nós demonstramos uma ligação simples de F-actina, no entanto este tipo de ensaio pode ser elaboradas e utilizadas para determinar a especificidade de ligação de um domínio de proteína ou proteína de F-actina.
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Acknowledgments
Obrigado a Dr. Praveen Kumar no laboratório Wittman em UCSF para o filme de actina em células HaCAT.
References
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