Summary
Белки связываются с нитчатые актина (Ф-актин), через различные актина обязательные модули. В этом видео мы продемонстрируем процедуры актина совместного осаждения, которая в пробирке анализ обычно используется для анализа белков или конкретных областях, которые связывают F-актина.
Abstract
Актина цитоскелета в клетке представляет собой сеть из нитей актина, который позволяет движение клеток и клеточных процессов, и это создает напряжение и помогает поддерживает сотовые форму. Хотя цитоскелета актина является жесткой структурой, это динамическая структура, которая постоянно ремоделирования. Количество белков могут быть привязаны к актина цитоскелета. Связывания конкретного белка в F-актин часто желаемое для поддержки ячейки биологических наблюдений или для более глубокого понимания динамических процессов за счет реконструкции актина цитоскелета. Актина совместного осаждения анализа является анализ в лабораторных обычно используется для анализа связывания специфических белков или белковых доменов с F-актина. Основные принципы анализа привлекать инкубации белок (полной длины или области) с F-актин, ультрацентрифугирования шаг к гранулы F-актин и анализа белков совместно осаждающихся с F-актина. Актина совместного осаждения анализов могут быть разработаны соответственно для измерения аффинности связывания актина и в анализах конкуренции.
Protocol
1. Подготовка актина
Источником актина, используемые в этом анализе был без мышц тромбоцитов человека (β-актин), полученных из цитоскелета Инк аликвоты акции по 10 мг / мл хранятся в морозильной камере -70 º C. Для анализа, актин разбавляют до 0,4 мг / мл в буфере, содержащем 5 мМ Трис рН 8, 0,2 мМ CaCl 2, 0,2 мМ АТФ и 0,5 мМ DTT, центрифугировали при 20000 г в течение 10 мин при 4 ° С. Супернатант, который мономерного актина готов к полимеризуется. Актина полимеризации индуцирована добавлением 50 мМ KCl, 1 мМ АТФ и 2 мМ MgCl 2. Полимеризации происходит при комнатной температуре в течение 1 часа.
2. Подготовка белка
В данном анализе мы используем С-конце Талин, который был очищен, как и стоимость, помеченные белка. Белка, который будет использоваться в анализе подвергается высокоскоростному центрифугирования предварительного ясно агрегатов до инкубации с F-актина.
Белка вращается на 100 000 г в ультрацентрифуге Beckman в течение 20 мин при 22 ° C.
3. Актин-белка Инкубационный
Количества актина и белка в анализе будет меняться. В этом примере мы используем актина в избытке. Как правило, молярное соотношение вычисляется, например. 4:01 молярное отношение актина к белку.
В следующий анализ, окончательный объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Буфер, в котором белка и F-актин инкубируют будет зависеть от белка для тестирования и на условиях, требуется. В этом примере мы используем буфера, содержащего 10 мМ Трис рН 7,0, 1 мМ АТФ, 0,2 мМ DTT, 1 мМ EGTA, 0,1 мМ CaCl 2 и 2 мМ MgCl 2. Белка и F-актин инкубировали в буфере в течение 1 часа при комнатной температуре.
4. Седиментация F-актин
После инкубации образцы центрифугировали при 100 000 г при 22 ° C. Мы используем ультрацентрифуге Beckman в видео. Ротор осторожно удаляют, чтобы не мешать гранул.
5. Анализ белка совместного осаждения с F-актин
Супернатанты осторожно удаляются с помощью пипетки в пробирку Эппендорфа и 5 X Laemmli SDS-PAGE образца буфера добавляется. Соответствующий объем 1 X Laemmli SDS-PAGE образца буфера добавляется в гранулы оставшихся пипеткой вверх и вниз, и передается новым Эппендорф труб. Относительные количества белка в гранулы и супернатантах проанализированы после их разделения SDS-PAGE и Кумасси синий окрашивания геля или Западной блоттинга.
Для того чтобы определить специфику взаимодействия белка с актин, актина зависит от концентрации совместно отложений может быть выполнена. Для такого рода эксперимент, фиксированная сумма в размере белка и серии увеличением количества актина инкубируют и анализ проводили, как описано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Актина совместного отстаивания просто в пробирке анализа для анализа белков specfic связывания с F-актина. В этом видео мы покажем один пример того, как простой актина совместного осаждения может быть осуществлена. Мы покажем, как готовить F-актин, подготовить белка для проверки и процедуры актина совместного отстаивания. Кол-во пунктов следует учитывать при проведении актина совместного осаждения анализов. Например, буфер компоненты для инкубации может варьировать в зависимости от белка к тестированию и рН, температуры и концентрации соли может повлиять на привязку к F-актина. Мы продемонстрировали простой привязки к F-актин, однако этот тип анализа может быть разработан на и используется для определения специфичность связывания белка или белка домен F-актина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Спасибо доктору Praveen Kumar в Wittman лаборатории в UCSF для фильма актина в НаСаТ клеток.
References
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
