Summary
Proteiner som binder till fintrådiga aktin (F-aktin) genom distinkta aktin bindande moduler. I denna video visar vi förfarandet med aktin samarbete sedimentering, vilket är ett in vitro-test rutinmässigt används för att analysera proteiner eller specifika områden som binder F-aktin.
Abstract
Den aktin cytoskelettet i cellen är ett nätverk av aktin filament som tillåter förflyttning av celler och cellulära processer, och som genererar spänningar och hjälper upprätthåller cellulära form. Även aktin cytoskelettet är en styv konstruktion, det är en dynamisk struktur som ständigt remodeling. Ett antal proteiner kan binda till aktin cytoskelettet. Bindningen av ett visst protein till F-aktin är ofta önskat att stödja cellbiologiska observationer eller att ytterligare förstå dynamiska processer på grund av ombyggnad av aktin cytoskelettet. Actin co-sedimentering analysen är ett in vitro-test rutinmässigt används för att analysera bindning av specifika proteiner eller domäner protein med F-aktin. De grundläggande principerna för analysen innebär en inkubationstid av proteinet av intresse (full längd eller domän) med F-aktin, ultracentrifugering steg till pellets F-aktin och analys av proteinet tillsammans sedimenterande med F-aktin. Aktin samarbete sedimentering analyser kan utformas därför för att mäta aktin bindande tillhörighet och i analyser konkurrens.
Protocol
1. Beredning av aktin
Källan till aktin som används i denna analys var icke-muskel humana trombocyter (β-aktin) som erhållits från cytoskelettet Inc. Stock alikvoter vid 10 mg / ml förvaras i -70 º C frys. För analysen är aktin utspädd till 0,4 mg / ml i en buffert innehållande 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP och 0,5 mM DTT, centrifugeras vid 20 tusen g under 10 minuter vid 4 ° C. Supernatanten, som är monomera aktin är redo att polymeriserat. Actin polymerisation induceras genom tillsats 50 mM KCl, 1 mm ATP och 2 mm MgCl 2. Den polymerisation sker vid rumstemperatur under 1 timme.
2. Beredning av protein
I denna analys använder vi C-ändstationen av Talin, som har renats i en GST-märkta proteinet. Det protein som ska användas i analysen utsätts för en snabb centrifugering att i förväg klara av aggregat före inkubering med F-aktin.
Proteinet är spunnet på 100 tusen g på en Beckman ultracentrifugen i 20 minuter vid 22 º C.
3. Aktin-protein Inkubering
Mängden aktin och protein i en analys kommer att variera. I detta exempel använder vi aktin i överskott. Normalt är en molförhållandet beräknas, t ex. en 4:01 molförhållandet mellan aktin till protein.
I den följande analysen är den sista reaktionen volym 150 l. Den buffert som protein och F-aktin inkuberas beror på proteinet som ska testas och på de villkor som krävs. I detta exempel använder vi en buffert som innehåller 10 mM Tris pH 7,0, 1 mm ATP, 0,2 mM DTT, 1 mm EGTA, 0,1 mM CaCl 2 och 2 mm MgCl 2. Det protein och F-aktin inkuberas i bufferten i 1 timme i rumstemperatur.
4. Sedimentation av F-aktin
Efter inkubation är de proverna centrifugeras vid 100 tusen g vid 22 º C. Vi använder en Beckman ultracentrifugen i videon. Rotorn är försiktigt bort för att inte störa pellets.
5. Analys av protein tillsammans sedimentering med F-aktin
Den supernatanterna avlägsnas omsorgsfullt genom att pipettera till ett Eppendorf-rör och 5 x Laemmli SDS-PAGE prov buffert tillsätts. En lämplig volym av 1 X Laemmli SDS-PAGE prov buffert läggs till pellets kvar, pipetteras upp och ner, och överföras till nya Eppendorf-rör. Den relativa mängden protein i pellets och supernatanterna analyseras efter deras separation av SDS-PAGE och Coomassie Blå färgning av gel eller Western blotting.
För att bestämma specificiteten av protein interaktion med aktin, aktin koncentrationsberoende samarbete sediment kan utföras. För denna typ av experiment, ett fast belopp av det protein och en serie av ökande mängder aktin inkuberas och analys görs enligt ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aktin samarbete sedimentering är ett enkelt in vitro-analys för att analysera specfic proteiner binder till F-aktin. I denna video visar vi ett exempel på hur en enkel aktin samarbete sedimentering kan ske. Vi visar hur man förbereder F-aktin, förbereda det protein som ska testas och det förfarande av aktin co-sedimentering. Ett antal punkter bör beaktas vid utförandet av aktin samarbete sedimentering analyser. Till exempel kan bufferten komponenter för odling varierar beroende på det protein som ska testas och pH, temperatur och salthalt kan påverka bindningen till F-aktin. Vi har visat en enkel bindning till F-aktin, men denna typ av analys kan tas fram på och används för att fastställa bindande specificiteten hos ett protein eller protein domän till F-aktin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Tack till Dr Praveen Kumar i Wittman labbet vid UCSF för filmen av aktin i HaCAT celler.
References
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
