Summary
البروتينات ربط أكتين الخيطية (F - أكتين) من خلال وحدات أكتين متميزة ملزمة. في هذا الفيديو نبدي الداخلي أكتين شارك في الترسيب ، وهو المختبر في فحص روتيني لتحليل البروتينات أو المجالات المحددة التي تربط F - أكتين.
Abstract
الهيكل الخلوي أكتين داخل الخلية هو عبارة عن شبكة من خيوط الأكتين الذي يسمح للحركة الخلايا والعمليات الخلوية ، والتي تولد التوتر ويساعد في شكل يحافظ الخلوية. على الرغم من أن الهيكل الخلوي أكتين هو بنية جامدة ، بل هو بنية ديناميكية التي يتم إعادة عرض باستمرار. ويمكن لعدد من البروتينات ربط الهيكل الخلوي أكتين. هو المطلوب في كثير من الأحيان ملزمة من بروتين خاص لأكتين - F لدعم الملاحظات الخلية أو البيولوجية لتعزيز فهم العمليات الحيوية نتيجة لإعادة تشكيل الهيكل الخلوي أكتين. شارك في فحص الترسيب أكتين هو المختبر في فحص روتيني لتحليل الملزمة للبروتينات معينة أو المجالات البروتين مع أكتين - F. المبادئ الأساسية للمقايسة تنطوي على حضانة للبروتين من الفائدة (الطول الكامل أو مجال) مع F - أكتين ، خطوة تنبيذ فائق لتكوير F - أكتين وتحليل البروتين المترسبة التعاون مع أكتين - F. ويمكن تصميم أكتين المشترك الترسيب المقايسات وفقا لقياس أكتين الانتماءات الملزمة والمقايسات في المنافسة.
Protocol
1. إعداد أكتين
وكان مصدر أكتين المستخدمة في هذا الاختبار غير العضلات الصفائح الدموية البشرية (β - أكتين) تم الحصول عليها من أسهم شركة aliquots الهيكل الخلوي في 10 يتم الاحتفاظ ملغ / مل في الثلاجة -70 درجة مئوية. للفحص ، هو المخفف للأكتين إلى 0.4 ملغ / مل في منطقة عازلة تحتوي على 5 ملم تريس الرقم الهيدروجيني 8 ، 0.2 ملم CaCl 2 ، 0.2 و 0.5 ملي ATP DTT ملم ، في طرد 20000 لمدة 10 دقيقة ز عند 4 درجة مئوية. وطاف ، وهو أكتين موحودي جاهزة للبلمرة. هي التي يسببها أكتين البلمرة من بوكل إضافة 50 مم ، و 1 و 2 ATP ملي ملي MgCl 2. وتحدث البلمرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
2. التحضير للبروتين
في هذا الاختبار ، ونحن باستخدام C - محطة من تالين ، الذي كان بمثابة تنقية البروتين GST الموسومة. يخضع هذا البروتين لاستخدامها في مقايسة إلى الطرد المركزي عالية السرعة لمسح ما قبل المجاميع قبل الحضانة مع أكتين - F.
هو نسج من البروتين في 100000 ز في نابذة فائقة السرعة لمدة 20 دقيقة بيكمان في 22 درجة مئوية.
3. أكتين البروتين الحضانة
فإن كمية الأكتين والبروتين في مقايسة تختلف. في هذا المثال نحن نستخدم أكتين في الزائدة. عادة ، يتم حساب نسبة المولي ، على سبيل المثال. نسبة 4:01 من المولي لأكتين البروتين.
في مقايسة التالية ، وحجم رد الفعل النهائي هو 150 ميكرولتر. سوف العازلة التي يتم تحضين البروتين و F - أكتين تعتمد على البروتين لفحصها ، وعلى الشروط المطلوبة. في هذا المثال ، نستخدم العازلة التي تحتوي على 10 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 1 ATP ملي و 0.2 ملي DTT ، 1 EGTA ملم ، 0.1 ملم CaCl 2 و 2 مم MgCl 2. يتم تحضين البروتين و F - أكتين في المنطقة العازلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. الترسيب من طراز F - أكتين
بعد الحضانة ، ونسج على عينات 100000 ز في 22 درجة مئوية. نستخدم نابذة فائقة السرعة بيكمان في الفيديو. تتم إزالة الدوار بعناية حتى لا تعكر صفو الكريات.
5. تحليل البروتين المشترك الترسيب مع F - أكتين
تتم إزالة بعناية من قبل supernatants pipetting في أنبوب إيبندورف و 5 X Laemmli العازلة عينة SDS - PAGE يضاف. يضاف إلى حجم مناسب من 1 العازلة Laemmli X عينة SDS - PAGE إلى الكريات المتبقية ، pipetted صعودا وهبوطا ، ونقل إلى أنابيب إيبندورف جديدة. ويتم تحليل الكميات النسبية للبروتين في كريات supernatants وبعد الانفصال من جانب وSDS - PAGE Coomassie الأزرق تلطيخ من هلام أو النشاف الغربية.
ويمكن من أجل تحديد خصوصية التفاعل مع أكتين البروتين ، يمكن تنفيذ الأكتين التي تعتمد على تركيز التعاون الترسبات. يتم تحضين لهذا النوع من التجربة ، وهو مبلغ ثابت من البروتين ، وسلسلة من كميات متزايدة من الأكتين ، والذي أجري على النحو المبين أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أكتين المشترك الترسيب هو بسيط في فحص المختبر لتحليل البروتينات specfic ملزمة لأكتين - F. في هذا الفيديو ، ونظهر مثال واحد بسيط كيف أكتين المشترك الترسيب يمكن الاضطلاع بها. نعرض كيفية تحضير F - أكتين ، وإعداد هذا البروتين لفحصها وإجراء أكتين المشترك الترسيب. وينبغي النظر في عدد من النقاط عند تنفيذ أكتين المشترك الترسيب المقايسات. على سبيل المثال ، يمكن للمكونات عازلة للحضانة تختلف تبعا للبروتين لفحصها ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة وتركيز الملح قد يؤثر على ملزمة لأكتين - F. لقد أثبتنا ملزم بسيطة لF - أكتين ، ولكن هذا النوع من الفحص يمكن بلورتها وتستخدم لتحديد نوعية ملزم من مجال البروتين أو البروتين لأكتين - F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
أشكر لك الدكتور برافين كومار في المختبر ويتمان في سان فرانسيسكو للفيلم من الأكتين في الخلايا HaCAT.
References
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
