Summary
هذا الفيديو يبين عملية خلية كاملة التسجيلات المشبك الجهد في شريحة الشبكية من السمندل النمر المائية. نبدي استعدادا لشريحة وكذلك كيفية تنفيذ تسجيلات المشبك التصحيح خلال التحفيز البصري لشبكية العين.
Abstract
نستخدم المشبك التصحيح خلية كاملة لدراسة تقنية الدارات متشابك التي ترتكز عليها معالجة المعلومات البصرية في الشبكية. في هذا الفيديو ، فإننا سوف دليل لكم من خلال عملية تنفيذ كامل الخلية تسجيلات ضوء التيارات أثار الخلايا الفردية في إعداد شريحة الشبكية. نستخدم نمر المائية السمندل كنموذج للحيوانات. نبدأ بوصف تشريح العين وكيفية عرض الشرائح هي التي شنت للتسجيلات الكهربية. مرة واحدة يتم وضع شريحة في غرفة تسجيل ، ونحن لشرح كيفية تنفيذ كامل الخلية التسجيلات المشبك الجهد. نحن المشروع ثم محفزات بصرية وعلى المستقبلات الضوئية في لانتزاع شريحة ضوئية أثار ردود الحالي. خلال تسجيل يروي لنا شريحة مع وكلاء الدوائية ، حيث نظام الارواء 8 قنوات تسمح لنا التبديل بسرعة بين وكلاء مختلفة. ويستخدم على نطاق واسع في إعداد شريحة الشبكية للتسجيلات المشبك التصحيح في شبكية العين ، لا سيما لدراسة الخلايا أو عديم الاستطالات القطبين ، والتي لا يمكن الوصول إليها في إعداد كامل جبل.
Protocol
الحلول
- الحل بين الخلايا لخلايا العقدة (مم) : 100 K - غلوكونات ، 8 بوكل ، 1 MgCl 2 ، 1 EGTA ، 10 HEPES ، 4 ATP ، GTP 0.5 و 90 ميكرومتر Sulforhodamine باء (لتلوين) ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة = 7.4 مع KOH
- الحل بين الخلايا لخلايا القطبين (مم) : 90 K - غلوكونات ، 8 بوكل ، 1 MgCl 2 ، 10 BAPTA ، 10 HEPES ، 4 ATP ، GTP 0.5 و 90 ميكرومتر Sulforhodamine باء (لتلوين) ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة = 7.4 مع KOH
- محلول رينغر خارج الخلية (مم) : 112 كلوريد الصوديوم ، الجلوكوز 5 ، 5 HEPES ، 2 بوكل ، 2 CaCl 2 ، 1 2 MgCl ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة = 7.75 مع هيدروكسيد الصوديوم. الأوكسجين من الحل وليس من الضروري.
إعداد غرف تسجيل
لدينا غرفة تسجيل تتكون من شريحة المجهر بمادة لاصقة جيدا في السيليكون الذي يمنع قطع صغيرة أخرى لاصقة وضعت بشكل جيد لتوفير الاستقرار لشرائح الأنسجة.
إعداد شرائح الشبكية
لتجنب التبييض من المستقبلات الضوئية ، ويتم تشريح في ضوء الأشعة تحت الحمراء أو خافت الضوء الأحمر. إذا كان أحد يرغب في تسجيل الاستجابات من المسار قضيب ، يجب استخدام الضوء الوحيد IR (الأشعة تحت الحمراء المجهر وتشريح أي ضوء الغرفة ، وينبغي استخدام نظارات الأشعة تحت الحمراء الإضافية لإجراءات لم تفعل تحت المجهر). يمكن إذا كان أحد يهتم أساسا في ضوء تسجيل الاستجابات المخروط ، الضوء الخافت الغرفة الحمراء أو ضوء الفلاش الحمراء يمكن استخدامها. المجهر ، ومع ذلك ، ينبغي أن يكون لا يزال oculars الأشعة تحت الحمراء.
إذا الإدخال مبصرة لا يمت بصلة لهذه التجربة ، يمكن القيام بإجراءات في ضوء الغرفة العادي باستخدام المجهر العادية.
- تحضير الشرائح المجهر two مع سيليكون لاصقة أيضا : إنشاء اثنين من نطاقات متوازية من الشحوم السيليكون (حوالي 0.5 سم بعيدا) على كل الشرائح ووضع قطعة مستطيلة من الورق تصفية على جانب واحد من الشرائح ، سواء معبر العصابات الشحوم (دفع التصفية مع جزء من ورقة شفرة حلاقة بحيث يتم المرفقة جيدا إلى الشريحة)
- تضحية السمندل المنشأة وفقا لبروتوكولات : يتم وضع الحيوانات في حمام الثلج لمدة 30 دقيقة ، ثم مقطوعة الرأس وضعف pithed.
- مبلل إزالة العين من الرأس السمندل ووضعه تحت مجهر تشريح على قطعة من المناديل الورقية مع الحل الجليد الباردة رينغر
- إزالة النسيج الضام من العين
- استخدام شفرة حلاقة لإجراء قطع صغير في القرنية
- عقد قطع القرنية مع ملقط حين إزالته بالمقص على طول حرصه على العين
- إزالة العدسة مع ملقط
- عقد القزحية مع ملقط وقطع على طول مشرشر أورا لإزالة قزحية
- قطع فنجان العين في اثنين قطع مستطيلة
- التقط واحدة من القطع الصلبة وضعه الجانب حتى على ورقة الترشيح (للتأكد من أصل قطعة تتسطح في حين تضغط عليه بعناية فائقة)
- رفع بلطف الصلبة قبالة شبكية العين ، والتي ينبغي الآن على الورقة المرفقة المدون
- إضافة الحل بسرعة الجليد الباردة رينغر إلى البئر
- تكرار نفس القطعة الثانية
- استخدام شفرة حلاقة وضعت في تقطيع اللحم والعرف لخفض 200 300μm شرائح واسعة.
- استخدام زوج من ملقط لالتقاط الشرائح على جانب ورقة الترشيح ، تسليمهم حتى طبقات الشبكية تصبح مرئية ، ووضعها على نطاقات الشحوم فراغ
- اختيار شريحة التي تبدو سليمة ويبين الفرق أفقي يشير إلى طبقات الشبكية (طبقات في بعض الأحيان من الصعب أن نرى تحت مجهر التشريح والتكبير ليست عالية بما فيه الكفاية ، ولكن إذا كان يمكن للمرء أن يتعرف على بعض طبقات شريحة عادة جيدة بما فيه الكفاية. القرار النهائي بشأن ما إذا كان استخدام شريحة ، ولكن ، مرة واحدة وينظر تحت المجهر تستقيم). نقله إلى غرفة تسجيل الشريحة من خلال بناء جسر بين الشرائح رينغر two
- تأكد من دفع ورقة الترشيح ضد كتل المطاط في غرفة تسجيل شريحة بحيث لا يميل (خلايا العقدة مبصرات وينبغي أن يكون في التركيز في نفس الوقت)
وضع الأنسجة في تلاعب تسجيل
- يتم وضع الشريحة تسجيل تحت المجهر وperfused مع حلول رينغر من خلال الجاذبية التنفسي نضح
- إعداد تصور هو مع المجهر تستقيم مع الهدف الماء الغمر 10x و40X.
- مرة أخرى ، ونحن فقط استخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء لمنع تبييض للمبصرات. ويرد كاميرا الأشعة تحت الحمراء إلى جانب منفذ المجهر ، وهذا مرتبط إلى شاشة التلفزيون.
التحفيز البصري
مبرمجة المحفزات البصرية في Matlab باستخدام Psychtoolbox ويتوقع على شبكية العين عن طريق ميناء رأس مجهر الفحص المجهري باستخدام محقن صورة (MBF العلوم الحيوية). A بتات + + يستخدم معالج الفيديو الرقمي (كامبريدج لأبحاث الأنظمة) للحصول على نطاق والإنارة و14bit synchronize عرض الحوافز مع الحصول على البيانات. والمحفزات البصرية المستخدمة في هذا الفيديو وأشرطة مشرق أو داكنة (العرض = 460μm) على النقيض من 100 ٪ ، والتي قدمت لمدة ثانيتين على خلفية موحدة ثابتة (الإنارة = 8 * 10 4 الفوتونات / ميكرون / ثانية ، الحجم : 1.84 س 1.38mm).
الكهربية
- يتم سحبها أقطاب التصحيح من الزجاج البورسليكات (OD :. 1.5mm ، ID 84mm) مع مجتذب micropipette. للخلايا العقدة ، المقاومة هي ما بين 2 و 4 MOhms. للخلايا بين القطبين ، وتستخدم المقاومة العالي ما بين 4 و 8 MOhms.
- تجرى التسجيلات المشبك الجهد باستخدام 700A Multiclamp (الأجهزة الجزيئية) ، ومكبر للصوت المختبر البرامج المبرمجة في LABVIEW الداخلية.
- وperfused المخدرات من خلال نظام الارواء 8 قنوات. يوضع القطب microperfusion قريبة من شريحة (النسيج يجب أن تتحرك بشكل واضح عند تشغيل نضح وخارجها ، ولكن يحتاج المرء أن يكون حذرا من ان الضغوط ليست قوية جدا بحيث يمكن أن تصبح شريحة منفصلة عن ورقة الترشيح). وينبغي أن يكون خلال التجارب microperfusion تحول باستمرار على (حل perfusing السيطرة إذا ليست هناك حاجة المخدرات) بحيث لا يتم تسجيل منزعجة من الحصول على تبديل نضح وخارجها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفوائد :
- جميع أنواع الخلايا متاحة
- من السهل تحديد من أنواع الخلايا ، وبخاصة إذا تم إضافة صبغة الفلورسنت إلى الحل الكهربائي
- ويمكن الوصول بسهولة وكلاء الدوائية الخلايا المستهدفة
- تقنية التصحيح المشبك يسمح للتحقيق في دور مختلف القنوات الأيونية في حسابات في شبكية العين. لا يمكن أن تكون على نفس المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال تسجيلات ارتفاع extracelluar أو تسجيلات مع أقطاب كهربائية حادة.
- ويمكن تطبيق هذه التقنية على النماذج الحيوانية الأخرى
العيوب :
- قد تحصل على خفض عمليات طرد في عملية التقطيع. لذا ، قد الدراسات التي تركز على حقل تقبلا المكانية يكون صعبا.
- كما هو الحال في معظم الشبكية في الأعمال التحضيرية لاستخدام المختبر الكهربية ، تتم إزالة ظهارة الصباغ ، والتي يمكن أن تؤدي إلى تبيض من مبصرات. قد الدراسات التي تتطلب التحفيز مع شدة الضوء عالية أو تحتاج إلى دراسة شبكية العين تحت العديد من الدول التكيف مع الصعوبات التي واجهت هذه التقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
