Summary
Cette vidéo montre le processus de la cellule entière enregistrements pince de tension dans la tranche la rétine de la salamandre aquatique tigre. Nous démontrons la préparation de la tranche ainsi que la façon d'effectuer des enregistrements de patch-clamp pendant la stimulation visuelle de la rétine.
Abstract
Nous utilisons la technique de cellules entières patch clamp pour étudier les circuits synaptiques qui sous-tend le traitement des informations visuelles de la rétine. Dans cette vidéo, nous allons vous guider à travers le processus d'exécution de cellules entières d'enregistrements de la lumière des courants évoqués des cellules individuelles dans la préparation de tranches de la rétine. Nous utilisons la salamandre tigrée aquatiques comme un modèle animal. Nous commençons par décrire la dissection de l'oeil et de montrer comment les tranches sont montés pour des enregistrements électrophysiologiques. Une fois que la tranche est placée dans la chambre d'enregistrement, nous montrent comment effectuer la cellule entière enregistrements voltage. Nous avons ensuite projet de stimuli visuels sur les photorécepteurs de la tranche à susciter la lumière évoque les réponses actuelles. Pendant l'enregistrement, nous perfuser la tranche avec des agents pharmacologiques, par lequel un système de perfusion à 8 canaux nous permet de basculer rapidement entre les différents agents. La préparation de tranches rétiniennes est largement utilisé pour les enregistrements de patch-clamp dans la rétine, en particulier d'étudier ou de cellules amacrines bipolaire, qui ne sont pas accessibles dans une préparation toute monture.
Protocol
Solutions
- Solution intracellulaire des cellules ganglionnaires (en mm): 100 K-gluconate, 8 KCl, MgCl 1 2, 1 EGTA, HEPES 10, 4 ATP, GTP 0,5, 90 uM Sulforhodamine B (pour la coloration), ajusté à pH = 7,4 avec KOH
- Solution intracellulaire des cellules bipolaires (en mm): 90 K-gluconate, 8 KCl, MgCl 2 1, 10 BAPTA, HEPES 10, 4 ATP, GTP 0,5, 90 uM Sulforhodamine B (pour la coloration), ajusté à pH = 7,4 avec KOH
- Ringer extracellulaire de solution (en mM): 112 NaCl, glucose à 5, 5 HEPES, 2 KCl, CaCl 2 2, 1 MgCl2, ajusté à pH = 7,75 avec NaOH. Oxygénation de la solution n'est pas nécessaire.
Préparer chambres d'enregistrement
Notre chambre d'enregistrement se compose d'une lame de microscope avec une colle bien à ce qui bloque en silicone petits découpées dans une autre colle bien placés pour assurer la stabilité des tranches de tissu.
Préparation des tranches de la rétine
Pour éviter le blanchiment des photorécepteurs, la dissection est menée à la lumière de lumière IR ou rouge faible. Si l'on s'intéresse à l'enregistrement des réponses de la voie de la tige, que la lumière infrarouge doit être utilisé (IR loupe binoculaire et aucune lumière ambiante. Supplémentaire des lunettes IR devrait être utilisé pour des procédures ne se fait pas sous le microscope). Si on s'intéresse principalement à l'enregistrement des réponses de lumière conique, faible lumière ambiante rouge ou un feu rouge clignotant peut être utilisé. Le microscope, cependant, devrait encore avoir oculaires IR.
Si l'entrée photorécepteur n'est pas pertinent pour l'expérience, les procédures peuvent être effectuées à la lumière ambiante normale en utilisant un microscope ordinaire.
- Préparer deux lames de microscope avec une colle silicone ainsi: créer deux bandes parallèles de la graisse de silicone (environ 0,5 cm de distance) sur chaque lame et placer un morceau de papier rectangulaire de filtre sur un côté de la diapositive, en traversant les deux bandes de graisse (pousser le filtre papier avec le cadre d'une lame de rasoir, de sorte qu'il est bien attaché à la lame)
- Sacrifice une salamandre selon des protocoles établis: l'animal est placé dans un bain de glace pendant 30 minutes, puis décapité et double-décérébrés.
- Supprimer les yeux de la tête salamandre et le placer sous le microscope de dissection sur un morceau de papier de soie humide avec une solution glacée de Ringer
- Retirez le tissu conjonctif de l'oeil
- Utilisez une lame de rasoir pour faire une petite incision dans la cornée
- Tenez coupé la cornée avec une pince lors de son retrait avec des ciseaux le long de sa pièce jointe à l'oeil
- Retirez la lentille avec une pince
- Tenir l'iris avec une pince et couper le long de l'ora serrata pour enlever l'iris
- Couper l'œilleton en deux morceaux rectangulaires
- Ramassez l'une des pièces latérales et placez-le jusqu'à la sclère sur le papier filtre (veillez à s'aplatir la pièce tout en la poussant vers le bas avec beaucoup d'attention)
- Soulevez doucement la sclère sur la rétine, qui désormais doit être jointe au document de filer
- Ajouter rapidement solution glacée de Ringer au bien
- Répétez la même chose pour le deuxième morceau
- Utilisez une lame de rasoir placée dans une trancheuse pour couper sur mesure de 200 300 um tranches de large.
- Utilisez une paire de pinces pour ramasser les tranches sur le côté du papier filtre, les retourner afin couches de la rétine deviennent visibles, et les placer sur les bandes de graisse à vide
- Choisissez une tranche qui ressemble en bon état et présente des bandes horizontales indiquant les couches de la rétine (les couches sont parfois difficiles à voir sous le microscope de dissection que le grossissement n'est pas assez élevé, cependant, si l'on peut reconnaître une certaine superposition de la tranche est généralement assez bon. La décision finale quant à l'utilisation de la tranche, cependant, est faite une fois qu'il est considéré sous le microscope vertical). C'est passer à la diapositive chambre d'enregistrement en construisant un pont Ringer entre les deux lames
- Assurez-vous que le papier filtre est poussé contre les blocs de caoutchouc dans la chambre d'enregistrement de sorte que la tranche n'est pas incliné (cellules ganglionnaires et des photorécepteurs doit être mise au point dans le même temps)
Placer le tissu dans la plate-forme d'enregistrement
- La diapositive d'enregistrement est placé sous le microscope et perfusées avec des solutions de Ringer à travers une perfusion par gravité systé
- La préparation est visualisé avec un microscope debout avec un objectif à immersion d'eau 10x et 40x.
- Encore une fois, nous utilisons uniquement la lumière infrarouge pour empêcher le blanchiment des photorécepteurs. Une caméra infrarouge est attaché au port côté du microscope, qui est relié à un écran de télévision.
Stimulation visuelle
Les stimuli visuels sont programmés en Matlab utilisant la Psychtoolbox et sont projetées sur la rétine grâce à l'orifice supérieur du microscope en utilisant une image de microscopie injecteur (MBF biosciences). Un Bits + Processeur + (Digital Video Cambridge Research Systems) est utilisé pour obtenir une échelle de luminance 14bit et synchronize présentation du stimulus avec acquisition de données. Les stimuli visuels utilisés dans cette vidéo des bars lumineux ou sombres (largeur = 460μm) de contraste de 100%, qui ont été présentés pendant deux secondes sur un fond uniforme régulier (luminance = 8 * 10 4 photons / um / s, taille: 1,84 x 1.38mm).
Électrophysiologie
- Patch électrodes sont tirés de verre borosilicate (OD:.. 1.5mm, ID 84mm) avec un extracteur micropipette. Pour les cellules ganglionnaires, les résistances sont entre 2 et 4 MOhms. Pour les cellules bipolaires, plus les résistances entre 4 et 8 MOhms sont utilisés.
- Enregistrements voltage sont effectuées en utilisant un 700A Multiclamp (Molecular Devices), un amplificateur et un laboratoire logiciel interne programmé dans LabVIEW.
- Les médicaments sont perfusés à travers un système de perfusion à 8 canaux. L'électrode microperfusion est placée près de la tranche (le tissu doit visiblement se déplacer quand vous tournez la perfusion et l'éteindre, mais il faut faire attention à ce que la pression n'est pas trop fort pour que la tranche pourrait se détacher du papier filtre). Au cours des expériences de la microperfusion doit être constamment allumé (solution de contrôle si aucune perfusant médicaments sont nécessaires) afin que l'enregistrement ne soit pas perturbé par la perfusion de commutation sur et en dehors.
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Discussion
Avantages:
- Tous les types de cellules sont accessibles
- Identification aisée des différents types cellulaires, en particulier si un colorant fluorescent est ajouté à la solution d'électrode
- Les agents pharmacologiques peuvent facilement atteindre les cellules cibles
- La technique de patch-clamp permet d'étudier le rôle des canaux ioniques différentes dans les calculs de la rétine. La même information ne peut être obtenu grâce à des enregistrements ou des enregistrements extracellulaires pic avec des électrodes pointues.
- Cette technique peut être appliquée à d'autres modèles animaux
Inconvénients:
- Processus pourrait être coupée dans le processus de tranchage. Par conséquent, les études qui se concentrent sur le domaine spatial réceptifs pourrait être difficile.
- Comme dans la plupart rétine préparations in vitro utilisé pour l'électrophysiologie, l'épithélium pigmentaire est retiré, ce qui peut conduire au blanchiment des photorécepteurs. Les études qui nécessitent une stimulation avec de fortes intensités lumineuses ou besoin d'étudier la rétine dans l'adaptation de nombreux États pourraient rencontrer des difficultés avec cette technique.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
