Summary
Denna video visar processen helcells-inspelningar spänning klämma i retinal bit av vattenlevande tiger salamandern. Vi visar förberedelserna för den del, liksom hur man utför inspelningar patch clamp under visuell stimulering av näthinnan.
Abstract
Vi använder helcells-tekniken patch clamp att studera de synaptiska kretsar som ligger bakom visuell information bearbetning i näthinnan. I den här videon kommer vi att guida dig genom processen att utföra helcells-inspelningar av ljuset framkallade strömmar av enskilda celler i näthinnan skiva beredning. Vi använder vattenlevande tiger salamandern som en djurmodell. Vi börjar med att beskriva dissekering av ögat och visa hur skivor är monterade för elektrofysiologiska inspelningar. När skiva är placerad i inspelningen kammare, visar vi hur du utför helcells-inspelningar spänning klämma. Vi projicerar då visuella stimuli på fotoreceptorer i segmentet att framkalla ljus framkallat Dagens svar. Under inspelningen vi BEGJUTA segmentet med farmakologiska medel, där en 8-kanals perfusion systemet tillåter oss att snabbt växla mellan olika aktörer. Näthinnans skiva preparatet används ofta för inspelningar patch clamp i näthinnan, i synnerhet för att studera amakrina eller bipolär celler, som inte är tillgängliga i hela montera beredning.
Protocol
Lösningar
- Intracellulär lösning för ganglion celler (i mm): 100 K-glukonat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0,5 GTP, 90 mikroM Sulforhodamine B (för färgning), justerat till pH = 7,4 med KOH
- Intracellulär lösning för bipolär celler (i mm): 90 K-glukonat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0,5 GTP, 90 mikroM Sulforhodamine B (för färgning), justerat till pH = 7,4 med KOH
- Extracellulär Ringers lösning (i mm): 112 NaCl, 5 glukos, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, justerat till pH = 7,75 med NaOH. Syresättning av lösningen är inte nödvändigt.
Förbered inspelning kammare
Vår inspelning kammare består av ett objektsglas med lim väl där små silikon block klippa ut en annan lim är väl lämpade att ge stabilitet åt vävnaden skivor.
Beredning av näthinnan skivor
För att undvika blekning av fotoreceptorer är dissektion utförs i IR eller svagt rött ljus ljus. Om man är intresserad av att spela in svar från staven väg, bör endast IR-ljus användas (IR dissekera mikroskop och inget utrymme ljus. Ytterligare IR-glasögon bör användas för förfaranden som inte utförs under mikroskop). Om man är främst intresserad av att spela in svaren kon ljus, svagt röda rummet ljus eller ett rött blixtljus kan användas. Mikroskopet bör dock fortfarande ha IR-okularen.
Om fotoreceptor ingången är irrelevant för experimentet, kan försök utföras i normal rumsbelysning med hjälp av ett vanligt mikroskop.
- Bered två objektglas med ett självhäftande silikon bra: skapa två parallella band av silikonfett (ca 0,5 cm från varandra) på varje bild och placera en rektangulär bit filterpapper på ena sidan av bilden, passerar både fett banden (tryck filtret papper med en del av ett rakblad så att det väl är ansluten till bilden)
- Offra en salamander i enlighet med fastställda protokoll: djuret placeras i ett isbad i 30 minuter, sedan halshuggen och dubbel-pithed.
- Ta bort ögon från salamander huvudet och placera den under dissekera mikroskop på en bit papper som fuktats med iskall Ringer-lösning
- Ta bort bindväv från ögat
- Använd rakblad att göra ett litet snitt i hornhinnan
- Håll skär hornhinnan med tång när du tar bort den med en sax längs sitt engagemang för ögat
- Ta ut linsen med pincett
- Håll iris med pincett och skär längs ora serrata att ta bort iris
- Skär ögonmussla i två rektangulära bitar
- Plocka upp en av bitarna och lägg den sklera uppåt på filterpapper (se till att plana ut pjäsen samtidigt som du trycker ner den mycket noggrant)
- Lyft försiktigt sklera från näthinnan, som nu ska bifogas Uppgiftslämnaren papper
- Snabbt lägga iskall Ringers lösning på väl
- Upprepa samma sak för den andra biten
- Använd ett rakblad som placerats i en specialtillverkad slicer att skära 200-300μm breda skivor.
- Använd en pincett för att plocka upp skivorna på sidan av filtret papper, vänd dem så att lagren av näthinnan blir synliga, och placera dem på band vakuum fett
- Välj en bit som ser oskadad och visar horisontella band som visar att lagren av näthinnan (skikten är ibland svåra att se under dissekering mikroskop som förstoringen inte är tillräckligt hög, men om man kan känna igen vissa skiktning segmentet är oftast tillräckligt bra. Det slutliga beslutet om huruvida de vill använda segmentet är dock göras en gång den visas under upprätt mikroskop). Flytta den till inspelningen kammaren bilden genom att bygga en Ringer bro mellan de två bilderna
- Se till att filterpappret trycks mot gummit block i inspelningen kammare så att segmentet inte lutas (ganglion celler och fotoreceptorer bör vara i fokus samtidigt)
Placering av vävnad i inspelningen riggen
- Inspelningen bilden placeras under mikroskop och perfusion med Ringer-lösningar via en gravitation perfusion systema
- Beredningen är visualiseras med en upprätt mikroskop med en 10x och 40x nedsänkning i vatten mål.
- Återigen använder vi enbart IR-ljus för att förhindra blekning av fotoreceptorer. En IR-kameran är ansluten till sidoingången av mikroskop, som är ansluten till en TV-skärm.
Visuell stimulans
Visuella stimuli är programmerade i Matlab med Psychtoolbox och projiceras på näthinnan genom toppen hamnen i mikroskop med hjälp av en injektor mikroskopi bild (MBF biovetenskap). En Bits + + Digital Video Processor (Cambridge Research Systems) används för att få en 14-bitars luminans skala och synchronize stimulans presentation med datainsamling. Den visuella stimuli som används i denna video är ljusa eller mörka staplar (bredd = 460μm) på 100% kontrast, som presenterades i två sekunder på en stadig enhetlig bakgrund (luminans = 8 * 10 4 fotoner / ìm / s, storlek: 1,84 x 1.38mm).
Elektrofysiologi
- Patch elektroderna dras av borsilikatglas (OD:.. 1,5 mm, ID 84mm) med en mikropipett avdragare. För ganglion celler motstånd är mellan 2 och 4 Mohm. För bipolära celler är högre motstånd mellan 4 och 8 Mohm används.
- Spänning Clamp inspelningar görs med en Multiclamp 700A (Molecular Devices), förstärkare och lab interna mjukvara programmeras i LabVIEW.
- Droger är perfusion via en 8-kanals perfusion system. Den microperfusion elektroden är placerad nära slice (vävnaden bör synligt rör sig när du vrider perfusion på och av, men man måste vara försiktig att trycket inte är för starka så att segmentet kan lossna från filtrerpapper). Under experiment microperfusion bör ständigt påslagen (perfusing kontroll lösningen om inga droger behövs) så att inspelningen inte blir störd av att växla perfusion på och av.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelar:
- Alla celltyper är tillgängliga
- Enkel identifiering av celltyper, särskilt om en fluorescerande färg läggs till elektroden lösningen
- Farmakologiska agenter kan lätt nå målceller
- Plåstret clamp tekniken tillåter att undersöka betydelsen av olika jonkanaler i retina beräkningar. Samma information kan inte erhållas genom extracellulära spik inspelningar eller inspelningar med skarpa elektroder.
- Denna teknik kan tillämpas på andra djurmodeller
Nackdelar:
- Processer kan bli avskuren i processen för skivning. Därför kan studier som fokuserar på den rumsliga receptiva fältet vara svårt.
- Som i de flesta retinal in vitro-preparat som används för elektrofysiologi är pigmentepitel bort, vilket kan leda till blekning av fotoreceptorer. Studier som kräver stimulering med hög ljusintensiteter eller behöver studera näthinnan under många anpassning stater kan stöta på svårigheter med denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
