Summary
录像显示，水产品虎蝾螈视网膜片全细胞电压钳记录的过程。我们示范片的准备，以及如何执行膜片钳记录在视网膜的视觉刺激。
Abstract
我们采用全细胞膜片钳技术，研究突触电路，基础在视网膜的视觉信息处理。在这段视频中，我们将引导您通过光诱发电流的单个细胞在视网膜切片准备执行的全细胞记录的过程中。我们使用的动物模型水产品虎蝾螈。我们首先描述了眼睛的解剖，并显示如何安装电生理记录片。一旦切片是在录音室中，我们将演示如何执行全细胞电压钳记录。然后，我们项目切片中的视觉刺激，引起光诱发的电流反应到的光感受器。在录制过程中，我们灌注与药理代理切片，即一个8声道的灌注系统，让我们之间快速切换不同的代理。在视网膜上，视网膜片制剂被广泛用于膜片钳记录，特别是研究无长突或双极细胞，这是在整个安装准备。
Protocol
解决方案
- 神经节细胞的胞内解决方案（毫米）：100 K，葡萄糖酸钙，8氯化钾，氯化镁，1 EGTA，2，4 ATP，0.5的GTP，90微米Sulforhodamine B（染色），10 HEPES调节pH值= 7.4与氢氧化钾
- 细胞内的解决方案，为双极细胞（毫米）：90 K -葡萄糖酸钙，1 8氯化钾， 氯化镁 2，10 BAPTA，10 HEPES，4个ATP的，0.5的GTP，90微米Sulforhodamine乙（染色），调整pH值= 7.4与氢氧化钾
- 林格外的解决方案（毫米）：112氯化钠，5葡萄糖，5 HEPES，2 2 1 2氯化钙，氯化钾，氯化镁2，调整pH值用NaOH = 7.75 。充氧的解决方案是没有必要的。
准备录音房
我们的录音室，包括一个与粘合剂在小硅块切割出的另一种粘合剂，以及提供稳定的组织切片放置显微镜幻灯片。
视网膜片的制备
为了避免漂白的光感受器，夹层进行了红外或暗红色光灯。如果一个人在录音杆通路的反应感兴趣，应该用只有红外光（红外解剖显微镜并没有室内光线应在显微镜下做的程序中使用额外的红外护目镜）。如果一个主要是在录音锥光反应，暗红色房间的灯或红色闪光灯的光线都可以使用。然而，显微镜，仍然有红外镜片。
如果感光输入实验无关，程序可以进行正常的室内光线下，使用常规显微镜。
- 准备两个显微镜玻片上，用粘合剂硅：创建两条平行带硅脂（相距约.5 CM）和每张幻灯片上放置一块长方形的滤纸上的幻灯片的一侧，跨油脂阶（推过滤器与刀片的一部分文件，以便它是连接到幻灯片）
- 牺牲一个蝾螈：根据既定协议的动物被放置在冰浴30分钟，然后断头和双pithed。
- 删除从蝾螈的头眼睛，并置于解剖显微镜下一块纸巾蘸冰冷的林格氏液
- 从眼睛中取出的结缔组织
- 用刀片在角膜上的一小截
- 按住沿及其附件，同时消除眼睛用剪刀切割钳角膜
- 用镊子取出镜头
- 握住钳沿锯齿缘削减删除虹膜虹膜
- 切成两个矩形件眼罩
- 拿起件之一，并将其放置在滤纸上巩膜侧（确保扁平化片的同时，也会非常仔细）
- 轻轻抬离视网膜巩膜，现在应附文件管理器文件
- 快速添加冰冷的林格氏液井
- 重复相同的第二件
- 使用放置在一个定制的切片，以削减200 -300μm宽片刀片。
- 使用一对镊子拿起侧的滤纸片，将它们使视网膜层变得可见，并放在真空润滑脂带
- 选择一个切片，看起来完好无损并显示表明视网膜层（层有时很难看到解剖显微镜下放大倍率不够高，但是如果人们能够认识到一些分层切片通常是不够好的水平带。最终决定是否使用片，然而，一旦直立显微镜下观察）。将它移动到录音室幻灯片建设的两个幻灯片之间的林格氏桥
- 确保滤纸反对在录音室的橡胶块推片，使不倾斜（神经节细胞和光感受器的同时应重点）
配售组织在录音装置
- 录制幻灯片被放在显微镜下，灌注林格氏解决方案通过重力灌注syste
- 该制剂是10倍和40倍的水浸泡的目的直立显微镜观察。
- 同样，我们只用红外光，以防止光感受器漂白。红外摄像机连接到显微镜的侧端口，这是连接到电视屏幕上。
视觉刺激
视觉刺激在使用的Psychtoolbox MATLAB编程，并通过显微镜的使用显微镜图像喷油器（MBF生物科学）的顶部端口，投射到视网膜。 A位+ +数字视频处理器（剑桥研究中心系统）是用来获取一个14bit的亮度规模和synchronize刺激呈现与数据采集。在这个视频中使用的视觉刺激的亮点或暗的酒吧（宽度为460μm），100％的对比，这是两秒钟一个稳定统一的背景（亮度= 8 × 10 4光子/微米/秒，尺寸：1.84 x 1.38毫米）。
电
- 补丁电极是由硼硅玻璃（外径：1.5毫米，身份证84毫米）与微量拉马拉。神经节细胞，是2至4兆欧电阻。对于双极细胞，高出4和8兆欧电阻的使用。
- 使用一个Multiclamp 700A（Molecular Devices公司），放大器和实验室内部软件LabVIEW编程电压钳记录。
- 毒品是通过一个8通道灌注系统灌注。 microperfusion电极放置在靠近片（当您打开和关闭灌注组织应明显移动，但需要小心的压力不是太强，使可能成为脱离滤纸片）。在实验过程中microperfusion应不断地被打开（如果没有药物灌注控制解决方案），因此录音没有得到通过开关开启和关闭的灌注不安。
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Discussion
优点：
- 所有类型的细胞都可以访问
- 类型的细胞容易识别，特别是如果一个荧光染料添加到电极解决方案
- 药理代理可以方便地到达靶细胞
- 膜片钳技术，允许在视网膜计算调查不同的离子通道的作用。不能得到相同的信息，通过胞穗录音或录音尖锐电极。
- 这种技术可以应用到其他的动物模型
缺点：
- 在切片过程中，进程可能会切断。因此，侧重于空间的感受野的研究，可能是困难的。
- 至于在最电使用的体外制剂视网膜色素上皮被删除，从而导致光感受器的漂白。研究需要与高光强度的刺激，或需要研究许多适应状态下的视网膜可能会遇到困难，这种技术。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
