이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 시냅스 회로 망막에 underlies 시각 정보 처리 연구를 전체 세포 패치 클램프 기법을 사용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 망막 슬라이스 준비에서 개별 세포의 빛을 evoked 흐름 전체 세포 레코딩을 수행하는 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 우리는 동물 모델로 수생 호랑이 도롱뇽을 사용합니다. 우리는 눈 해부를 설명함으로써 시작하고 조각이 electrophysiological 레코딩을위한 마운트하는 방법 보여줍니다. 슬라이스가 기록 챔버에 배치되면, 우리는 전체 셀 전압 클램프 레코딩을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 빛이 - evoked 현재 답변을 이끌어내는 수있는 통에 photoreceptors에 시각적 자극이 프로젝트를 만듭니다. 8 채널 재관류 시스템을 우리가 신속하게 다른 에이전트 사이를 전환할 수있게 의하여 기록하는 동안 우리는 약리 요원으로 슬라이스를 perfuse. 망막 슬라이스 준비 널리 특히 전체 마운트 준비에 액세스할 수 없습니다 amacrine 또는 바이폴라 세포를 연구, 망막의 패치 클램프 녹음에 사용됩니다.
프로토콜
솔루션
- 신경절 세포에 대한 세포 솔루션 (MM)를 100 K - 글루 콘 산, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0.5 GTP, 90 μm의 Sulforhodamine B는 (얼룩)을 함께 산도 = 7.4로 조정 코
- 양극성 세포 (MM)을위한 세포 솔루션 : 90 K - 글루 콘 산, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0.5 GTP, 90 μm의 Sulforhodamine B는 (얼룩)을 함께 산도 = 7.4로 조정 코
- 세포외 링어의 솔루션 (MM)을 : 112 NaCl, 5 포도당, 5 HEPES, NaOH와 산도 = 7.75로 조정이 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2. 솔루션의 산소가 필요하지 않습니다.
녹화 실 준비
우리의 기록 챔버 다른 접착제의 잘라 작은 실리콘 블록이 잘 조직 조각에 대한 안정성을 제공하기 위해 배치됩니다 잘되는 접착제와 현미경 슬라이드로 구성되어 있습니다.
망막 조각의 준비
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토론
장점 :
- 모든 세포 유형은 액세스할 수 있습니다
- 셀 유형을 쉽게 식별은 특히 형광 염료는 전극 솔루션에 추가하는 경우
- 약리 요원들은 쉽게 표적 세포에 도달할 수
- 패치 클램프 기술은 망막 계산 서로 다른 이온 채널의 역할을 조사 할 수 있습니다. 동일한 정보는 날카로운 전극과 extracelluar 스파이크 녹음하거나 녹음을 통해 얻을 수 없습니다.
- 이 기술은 다른 동물 모델에 적용할 수있는
단점 :
- 프로세스는 깔끔히의 과정에 차단받을 수 있습니다. 따라서 공간 수용 분야에 초점을 연구 어려울 수 있습니다.
- 전기 생리학에 사용되는 체외 준비 가장 망막 마찬가지로, 안료 상피는 photoreceptors의 표백으로 이어질 수있는, 제거됩니다. 높은 광 강도와 자극이 필요하거나 많은 적응 상태에서 망막을 연구해야 할 연구는이 기술을 어려움에 빠질수.......
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| Multiclamp 700A | 패치 클램프 증폭기 | Molecular Devices | ||
| SZX9 | 해부 현미경 | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | 정립 현미경 | Olympus Corporation | 40배 및 10배 수침 렌즈, 형광 필터 및 수은 램프가 장착됨 | |
| P-97 | 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | 현미경 이미지 인젝터 | MBF Bioscience | ||
| 8채널 관류 시스템 | 미세관류 | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | 디지털 비디오 프로세서 | Cambridge Research Systems | ||
| 적외선 접안렌즈 | 기타 | ITT 시각 정보 솔루션(ITT Visual Information Solutions) | ||
| 접착식 실리콘 웰 | 기타 | Molecular Probes, Life Technologies | 직경 20mm, 깊이 1.0mm | |
| 막 여과기 | 필터 | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| 붕규산 유리 모세관 | 전극 유리 | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| 주사기 필터 | 필터 | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm 필터, .2um 나일론 막, 폴리프로필렌 하우징 |
| IR 카메라 | 현미경 장착 카메라 | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W 비디오 카메라 |
| 피크로톡신 | 시약 | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| 스트리크닌 | 시약 | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| 이미다졸-4-아세트산 나트륨염 | 시약 | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| 호랑이 도롱뇽 유생 | 동물 | Charles E. Sullivan |
참고문헌
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B.
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