Summary
이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.
Abstract
우리는 시냅스 회로 망막에 underlies 시각 정보 처리 연구를 전체 세포 패치 클램프 기법을 사용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 망막 슬라이스 준비에서 개별 세포의 빛을 evoked 흐름 전체 세포 레코딩을 수행하는 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 우리는 동물 모델로 수생 호랑이 도롱뇽을 사용합니다. 우리는 눈 해부를 설명함으로써 시작하고 조각이 electrophysiological 레코딩을위한 마운트하는 방법 보여줍니다. 슬라이스가 기록 챔버에 배치되면, 우리는 전체 셀 전압 클램프 레코딩을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 빛이 - evoked 현재 답변을 이끌어내는 수있는 통에 photoreceptors에 시각적 자극이 프로젝트를 만듭니다. 8 채널 재관류 시스템을 우리가 신속하게 다른 에이전트 사이를 전환할 수있게 의하여 기록하는 동안 우리는 약리 요원으로 슬라이스를 perfuse. 망막 슬라이스 준비 널리 특히 전체 마운트 준비에 액세스할 수 없습니다 amacrine 또는 바이폴라 세포를 연구, 망막의 패치 클램프 녹음에 사용됩니다.
Protocol
솔루션
- 신경절 세포에 대한 세포 솔루션 (MM)를 100 K - 글루 콘 산, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0.5 GTP, 90 μm의 Sulforhodamine B는 (얼룩)을 함께 산도 = 7.4로 조정 코
- 양극성 세포 (MM)을위한 세포 솔루션 : 90 K - 글루 콘 산, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0.5 GTP, 90 μm의 Sulforhodamine B는 (얼룩)을 함께 산도 = 7.4로 조정 코
- 세포외 링어의 솔루션 (MM)을 : 112 NaCl, 5 포도당, 5 HEPES, NaOH와 산도 = 7.75로 조정이 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2. 솔루션의 산소가 필요하지 않습니다.
녹화 실 준비
우리의 기록 챔버 다른 접착제의 잘라 작은 실리콘 블록이 잘 조직 조각에 대한 안정성을 제공하기 위해 배치됩니다 잘되는 접착제와 현미경 슬라이드로 구성되어 있습니다.
망막 조각의 준비
photoreceptors의 표백 피하기 위해, 절개는 IR 또는 희미한 붉은 빛 라이트에서 수행됩니다. 하나는 막대 경로에서 응답을 녹음에 관심이있다면, 오직 IR 빛이 (IR는 현미경없이 실내 조명을 해부. 추가 적외선 고글이 현미경으로하지 절차를 사용해야합니다) 사용해야합니다. 하나는 주로 원추 라이트 응답, 희미한 붉은 방 조명이나 붉은 손전등을 기록에 관심이있다면 사용할 수 있습니다. 현미경 그러나, 여전히 IR oculars 있어야합니다.
photoreceptor 입력이 실험을 위해 관련이없는 경우, 절차는 일반 현미경을 사용하여 일반 룸 라이트에서 진행하실 수 있습니다.
- 잘 접착제 실리콘 두 개의 현미경 슬라이드 준비 : (필터를 밀어 각 슬라이드에 실리콘 그리스의 두 병렬 밴드 (약 0.5 cm 간격)을 작성하고 슬라이드의 한쪽 거름종이의 사각형 조각을 배치, 모두 그리스 밴드를 건너 그것이 잘 슬라이드에 첨부되도록 면도날의 일부와 함께 종이)
- 동물 후 참수를 두 번 pithed, 30 분 동안 얼음 욕조에 배치됩니다 설립 프로토콜에 따라 도롱뇽을 희생.
- 샐러맨더 머리에서 눈을 제거하고 조직 종이에 해부 현미경으로 그것을 장소는 얼음처럼 차가운 링어의 솔루션 moistened
- 눈에서 결합 조직을 제거
- 각막에 작은 상처를 만들기 위해 면도날을 사용하여
- 눈에하기 위해 첨부 파일을 함께 가위로 그것을 제거하는 동안 집게로 각막을 절단 잡아
- 포셉와 렌즈를 제거
- 포셉로 방어막을 누른 상태에서 조리개를 제거 오라 세라타 따라 컷
- 이 직사각형 조각으로 세안 컵 컷
- (아주 조심스럽게 그것을 아래로 밀어하면서 조각을 평평하게해야합니다) 조각 중 하나를 선택하고 필터 종이에 공막엔 측면을 장소
- 부드럽게 지금 필러 용지에 첨부되어야하는, 망막에서 공막엔 리프트
- 신속하게 잘하는 얼음처럼 차가운 링어의 솔루션을 추가
- 두 번째 작품에 대해 동일한 단계를 반복
- 200 - 300μm 다양한 조각 잘라 사용자 정의 만든 기계에 위치 면도날을 사용합니다.
- 필터 종이의 측면에서 조각을 데리러 포셉 한 켤레를 사용하여 망막의 레이어가 표시되기 때문에 그들을 넘겨주하고, 진공 그리스 밴드에 장소를
- 손상되지 않은 외모와 망막의 레이어 (배율이 충분히 높지 않을으로 레이어를 한 일부 겹겹이 인식할 수있다면 그러나 슬라이스 일반적으로 충분이며, 때로는 해부 현미경 아래에서 볼 수 어렵습니다을 나타내는 수평 밴드를 보여줍니다 슬라이스를 선택하십시오. 가) 직립 현미경으로 볼되면 슬라이스를 사용하는 여부에 대한 최종 결정은, 그러나, 만들 수 있습니다. 두 슬라이드 사이에 링어 다리를 구축하여 녹음 챔버 슬라이드로 이동
- 슬라이스가 (신경절 세포와 photoreceptors가 동시에 초점이되어야합니다) 기울어져되지 않도록 필터 종이는 기록 챔버에있는 고무 블록에 대한 강요되어 있는지 확인
레코딩 장비에서 조직을 배치
- 녹음 슬라이드는 현미경으로 위치하고 중력 재관류의 syste 통해 링어의 솔루션과 perfused입니다
- 준비는 10X와 40x 물 침지 목적으로 직립 현미경 시각이다.
- 다시 말하지만, 우리는 photoreceptors의 표백 방지하기 위해 IR 조명을 사용합니다. IR 카메라는 TV 화면에 연결되어있는 현미경의 측면 포트에 첨부되어 있습니다.
시각적 자극
시각적 자극은 Psychtoolbox를 사용하여 Matlab에서 프로그래밍하고 현미경 이미지 주입기 (Mbf bioscience)를 사용하여 현미경의 상단에 포트를 통해 망막에 투영됩니다. 비트 + + 디지털 비디오 프로세서 (캠브리지 연구 시스템)는 14bit 휘도 규모를 구하고 synchr하는 데 사용됩니다데이터 수집과 자극 프레 젠 테이션을 onize. 이 동영상에 사용되는 시각적 자극이 지속적으로 균일한 배경 (두 초 동안 제시되었다 100 % 대비 밝은 또는 어두운 바 (폭 = 460μm)입니다 휘도 = 8 * 10 4 광자 / μm의 / s의 크기 : 1.84 X 1.38mm).
전기 생리학
- micropipette의 풀러와 함께 : 패치 전극은 borosilicate 유리 (1.5mm, ID 84mm.. OD)에서 가져온 있습니다. 신경절 세포의 경우, resistances 2 4 MOhms 사이입니다. 양극성 세포의 경우, 4, 8 MOhms 사이에 높은 resistances이 사용됩니다.
- 전압 클램프 녹음은 Multiclamp 700A (분자 장치), 앰프 및 Labview에서 프로그램 연구실 내부 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.
- 약물은 8 채널 재관류 시스템을 통해 perfused 수 있습니다. microperfusion 전극은 슬라이스 (조직 가시가에서 재관류를 켜고 때 이동해야 하나 요구 압력이 슬라이스가 여과지에서 분리 될 수 있도록 너무 강하지 않다는 것을 조심)에 가까이 위치합니다. 실험 동안 microperfusion 끊임없이 녹음에 재관류를 스위칭 및 해제에 의해 방해받지 않도록합니다 (약물이 필요하지 않은 경우 perfusing 제어 솔루션)을 설정해야합니다.
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Discussion
장점 :
- 모든 세포 유형은 액세스할 수 있습니다
- 셀 유형을 쉽게 식별은 특히 형광 염료는 전극 솔루션에 추가하는 경우
- 약리 요원들은 쉽게 표적 세포에 도달할 수
- 패치 클램프 기술은 망막 계산 서로 다른 이온 채널의 역할을 조사 할 수 있습니다. 동일한 정보는 날카로운 전극과 extracelluar 스파이크 녹음하거나 녹음을 통해 얻을 수 없습니다.
- 이 기술은 다른 동물 모델에 적용할 수있는
단점 :
- 프로세스는 깔끔히의 과정에 차단받을 수 있습니다. 따라서 공간 수용 분야에 초점을 연구 어려울 수 있습니다.
- 전기 생리학에 사용되는 체외 준비 가장 망막 마찬가지로, 안료 상피는 photoreceptors의 표백으로 이어질 수있는, 제거됩니다. 높은 광 강도와 자극이 필요하거나 많은 적응 상태에서 망막을 연구해야 할 연구는이 기술을 어려움에 빠질수도 있습니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
