Summary
Die Überwachung der extrazellulären Neurotransmitter Ebenen in verschiedenen Hirnregionen der frei beweglichen Tieren bietet Einblicke über den Zusammenhang zwischen Neurotransmittern und Verhalten. In-vivo-Mikrodialyse mit elektrochemischer Detektion gekoppelt bietet eine hervorragende anatomische und chemische Auflösung, und Informationen darüber, wie basale Neurotransmission wird durch pharmakologische oder physiologische Manipulationen verändert.
Abstract
Die Fähigkeit, extrazelluläre basale Konzentrationen von Neurotransmittern im Gehirn der Tiere wach Maßnahme kann für die Bestimmung der Auswirkungen von unterschiedlichen systemischen Herausforderungen (pharmakologische oder physiologische) an das ZNS. Zum Beispiel kann man direkt zu messen, wie das Tier Mittelhirn Dopamin Projektionen zu Dopamin-freisetzenden Drogen wie d-Amphetamin oder natürliche Reize wie Nahrung reagieren. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie führen Kanülen auf bestimmte Websites im Gehirn der Ratte Implantat, das Einsetzen und Implantat eine Mikrodialysesonde und wie Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-EC) gekoppelt zu verwenden, um die extrazelluläre Konzentration von Maßnahmen oxidierbare Neurotransmitter und Metaboliten. Lokale genaue Einführung von Medikamenten durch die Mikrodialysesonde ermöglicht raffinierte Arbeiten auf der Baustelle Spezifität in einer Verbindung s Wirkmechanismus. Diese Technik hat hervorragende anatomische und chemische Auflösung, aber nur bescheidene zeitliche Auflösung als Mikrodialyseproben sind in der Regel alle 20-30 Minuten verarbeitet werden, um nachweisbar Neurotransmitter Ebenen zu gewährleisten. Ergänzende ex vivo-Tools (dh, in Scheiben schneiden und Zellkultur Elektrophysiologie) kann mit der Überwachung in Echtzeit Neurotransmission zu unterstützen.
Protocol
Zusammenfassung
Zwei Monate alten Durchschnittsalter C57BL/6J-Mäuse oder eine gleichwertige oder drei Monate alten Durchschnittsalter Sprague Dawley Ratten oder gleichwertig sind mit Ketamin (60 mg / kg ip für Ratten, 100 mg / kg ip für Mäuse) und Xylazin (10 mg / kg, ip der beiden Arten). Sedierung wird mit einem sanften toe Prise zurückzutreten Reflex zeigte Walantus et al. (JoVE, 6, 2007) und Szot et al. (JoVE, 9, 2007). Thermoregulation kann durch eine thermostatregulated Heizkissen (ALA Instruments Inc.) zur Verfügung gestellt und überwacht durch einen rektalen Thermometer. Leiter ist der Pelz rasiert und gereinigt mit Jod, bevor Einschnitt. Nach Hautschnitt (2 cm lang für Ratten, 1 cm lang für Mäuse) und Entfernung aller Weichteile von der Oberfläche des Schädels, ist die Platzierung des Führungskanüle in Bezug auf Bregma bestimmt. Ein 6 mm Loch durch den Schädel mit einer Batterie betriebenen Bohrer für Nager Chirurgie entwickelt (Fine Science Tools, Inc.) gebohrt. Es wird darauf geachtet, so dass der Bohrer nicht durch Meningen oder Blutgefäße eindringen. Der Schädel ist mit bilateralen 5 mm 21-Gauge Edelstahl Führungswellen, die zum hinteren Nucleus accumbens, dorsale Striatum oder präfrontale Kortex implantiert. Die stereotaktischen Koordinaten nach Franklin und Paxinos, 1997 gegründet (Gehirn der Maus in stereotaktischen Koordinaten, Academic Press) oder Paxinos und Watson, 2006 (Gehirn der Ratte in stereotaktischen Koordinaten, Academic Press). Implantate sind durch Zahnzement befestigt. Ein Bolus von Ringer-Laktat-der 0,9% ige Kochsalzlösung wird am Ende der Operation (5mls SC in Ratten und 1 ml SC in Mäusen nach Flüssigkeiten werden in den normalen Körpertemperatur erwärmt), um eine Austrocknung zu verhindern gegeben. Buprenorphin (0.1-0.5mg/kg SC) ist zweimal täglich verabreicht, und dann, auf einer as-needed Basis, wenn das Tier scheint in Schmerzen. Lokale Behandlung mit Antibiotika (Bacitracin Salbe) und systemischer Antibiotika-Behandlung (Penicillin 100.000 IU / kg IM alle 12 Stunden für die ersten 48 Stunden post-op) verabreicht werden, wenn die postoperative Infektionen auftreten.
Nach der Operation werden die Tiere einzeln mit Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung untergebracht. Mindestens eine Woche zur Erholung, bevor Mikrodialyse und Euthanasie erlaubt. Nach Erholung von der Operation werden die Tiere zu einem Mikrodialyse Käfig und Mikrodialysesonden eingefügt und in die Führungswellen, dass während der Operation installiert wurden zementiert übertragen. Probe Einsetzen verursacht keine Schmerzen oder Beschwerden, weil die Sonde unter Umgehung Haut, Muskeln und meningealen Gewebe durch die Führungswelle. Deshalb ist die Sonde Einsetzen ohne Betäubung durchgeführt und jede Narkose-induzierte Effekte auf die Neurochemie oder Verhalten vermieden werden. Wir lassen die Sonden für 12 Stunden zu stabilisieren und dann beginnen wir Probenahme alle 30 Minuten zum anderen 8-12 Stunden je nach Experiment. Wir überwachen Bewegungsapparates Verhalten des Tieres durch Lichtschranken oder manuelle Aufzeichnung von Bewegung durch den Experimentator. Mikrodialysat Proben werden in einem High Performance Liquid Chromatography mit elektrochemischer Detektion (HPLC-EC) Instrument für die neurochemischen Erkennung und Analyse injiziert. Wir suchen Auswirkungen auf die basale Neurochemie und Bewegungsapparates Verhalten. Am Ende des Experiments wird das Tier durch eine Überdosis von systemischen Ketamin (200 mg / kg ip) und Xylazin (20 mg / kg, ip) eingeschläfert. Dann wird das Herz ist mit 0,9% iger Kochsalzlösung von 4% Paraformaldehyd gefolgt perfundiert. Die Gehirne werden entfernt, eingefroren und geschnitten entlang der Mikrodialysesonde-Darm-Trakt, um genaue Aufsetzen der Sonde zu überprüfen.
Verfahren
- Richten Sie den stereotaktischen Instrument und alle benötigten Materialien. Achten Sie darauf, den Bereich und Instrumente gereinigt und sterilisiert.
- Abrasieren Fell mit elektrischen Rasierer. Gehen Sie von den Ohren, nur in-zwischen die Augen, bewegen Rasiermesser in verschiedene Richtungen, um effektiv zu reinigen Fläche von Pelz. Bewerben Povidin / Jod zu rasierten Bereich, sondern schützen die Augen von ihr.
- Montieren Sie das Tier auf den stereotaktischen Apparat, indem das Ohr Bars in den Gehörgang und Anziehen einrastet. Montieren Sie zuerst ein Ohr bar in den Gehörgang, und dann halten Sie es fest und schieben in das andere Ohr bar. Sie wissen, dass Sie an der richtigen Stelle, wenn der Kopf nicht mehr hin und her bewegt werden. Sichern Sie den Mund mit der vorderen Halterung der stereotaktischen und stellen Sie sicher, dass der Kopf Ebene mit einem Lineal wird. Legen Sie das Lineal in einer vertikalen Position in Bezug auf den stereotaktischen Instrument Plattform und suchen Sie nach einem 90 ° Winkel zwischen dem Herrscher und der Mitte des Tieres Kopfhaut). Bestätigen Sie diese durch die stereotaktische Instrument, wenn es solche Möglichkeit bietet.
- Machen Sie eine anteriore / posteriore Inzision auf der Kopfhaut mit einem sterilen Skalpell, die sich von der Lambda nur in-zwischen die Augen des Tieres. Gebrauch sterilisiert Hämostatika abzukneifen der Haut und halten den Schnitt zu öffnen. Mit mehreren sterile Wattestäbchen, trocknen die exponierte Kopfoberfläche.
- Legen Sie die Führungskanüle auf seiner Halterung, finden Bregma auf dem Schädel, und die Position der Führung Kanüle direkt über diesen Standort. Notieren Sie sich die anterior / posterioren und lateralen Koordinaten. Von Bregma, finden Sie die richtigen Koordinaten für die Platzierung Ihrer Sonde mit Hilfe des stereotaktischen Atlas benötigt. Positionieren Sie den Führungskanüle die richtigen Koordinaten durch Addieren oder Subtrahieren von Bregma. Bringen Sie Ihre Führungskanüle unten, bis sie zu berühren ist der Schädel, und notieren Sie diese ventral zu koordinieren. Machen Sie einen Bleistift mit einem sterilen Stift an dieser Stelle auf dem Schädel, das ist, wo sind Sie in der Bohrung.
- Entfernen Sie die Führungskanüle und sterilisieren Sie Ihre Bohrer. Vorsichtig bohren ein Loch in der Bleistiftstrich bis Sie durch die Breite des Schädels erhalten. Prüfen Sie mit dem Guide Kanüle zu sehen, ob es das Loch, ohne die Wände zu berühren klar würde. Keep Bohren und Kontrolle, bis die Kanüle in einen geraden Weg freigeben können. Nachdem das Loch ist gemacht, mit einem sterilen Nadel vorsichtig punch den Hirnhäuten, um ungehinderten Einführen der Kanüle zu ermöglichen.
- Anschließend mit einem Handbohrer, um sechs Löcher für Schrauben Schädel: zwei vordere, um die Kanüle Loch, zwei seitlichen, die Kanüle Loch, und zwei hinter den Seiten. Sterilisieren sechs Schrauben und legen Sie sie auf den Schädel, bis sie dicht am verankert sind.
- Reinigen Sie die Führungskanüle mit Ethanol und Kochsalzlösung, mount, und so langsam auf die richtige ventral zu koordinieren. Stellen Sie sicher, dass die Seiten sich nicht berühren und dass es sich perfekt in vertikaler gehen.
- Legen Sie die Ankerschraube medial und hinter der hinteren Schädel Schrauben und halten Sie ihn mit einer Pinzette. Mix eine dünne Partie von flüssigen Zahnzement und decken die Führungskanüle, Schrauben, und der Rest des Schädels mit einem sterilen Spatel. Machen Sie eine andere Charge, dicker dieser Zeit, und bedecken die Fläche und die Kanüle und Ankerschraube genug, um es zu sichern.
- Als der Zement wird dicker und bevor es erstarrt, trennen Sie die Haut von der Cement Cup-und Formenbau der Zement-Tasse mit dem Spatel um sicherzustellen, dass der Zement-cap is all around glatt und nicht die Haut reizen später.
- Lassen Sie den Zahnzement vollständig, bevor Sie das Tier aus dem Gerät trocken. Entfernen Sie die Hämostatika. Apply-Bacitracin den ganzen Weg um den Zement Kappe.
- Sobald das Tier aus dem stereotaktischen Instrument, spritzen sie mit 0,25 ml Penicillin IM (intramuskulär) von 1 ml Kochsalzlösung SC (subkutan) gefolgt.
- Legen Sie das Tier in seinem eigenen Käfig und zu überwachen, bis es bewusst vor der Rückgabe an ihren Platz zum erholen wird.
- Monitor Tiere, bis sie aus der Narkose auf den Tag der Operation und die tägliche post-op zu erholen, bis zum Ende des Experiments, auf Anzeichen einer Infektion und Bewertung von Schmerz / Leiden. Dies schließt an Wochenenden und Feiertagen. Low spontane Bewegung, Stress Vokalisation bei der Handhabung, gekrümmte Haltung, Durchfall, Schwellungen und Entladung in den Bereich der Headmount, und der Mangel an Ernährung / Trinken sind alle Anzeichen von Schmerzen und Leiden. Buprenorphin (0.1-0.5mg/kg SC) wird zweimal täglich verabreicht, und dann, auf einer as-needed Basis, wenn das Tier scheint in Schmerzen. Lokale Behandlung mit Antibiotika (Bacitracin Salbe) und systemischer Antibiotika-Behandlung (Penicillin 100.000 IU / kg IM alle 12 Stunden für die ersten 48 Stunden post-op) verabreicht werden, wenn die postoperative Infektionen auftreten. Wenn eines dieser Symptome nach der Einnahme von Buprenorphin, zusätzliche Flüssigkeit und Antibiotika-Behandlung innerhalb von 12 Stunden nach der Operation bestehen bleiben, ist das Tier eingeschläfert.
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Discussion
In-vivo-Mikrodialyse ist das Werkzeug der Wahl für die Messung mehrerer Neurotransmitter und Metaboliten in verschiedenen Gehirn Standorten eines lebenden Tieres. Allerdings ist es nur überwacht die extrazelluläre Konzentration von Neurotransmittern und es bietet nicht die zeitliche Auflösung zu Exozytose von Neurotransmittern in Echtzeit zu überwachen. Durch eine Version der Technik namens "net-flux", kann die tatsächliche Neurotransmitter-Konzentration an einem bestimmten Ort berechnet werden, was wiederum genaue Messungen der Neurotransmitter-Wiederaufnahme-Rate von über Plasmamembran-Transportern zu geben.
Mikrodialyse ist ideal in illustrieren Unterschiede in basalen extrazellulären Neurotransmitter Ebenen zwischen verschiedenen Gruppen von Tieren (dh verschiedene Genotypen) und bei der Entschlüsselung der Wirkung von Drogen oder andere Manipulationen an die Freisetzung von Neurotransmittern.
Die Einführung von Tests Alternative zu HPLC-EC wie Kapillarzonenelektrophorese (CZE) mit Fluoreszenzdetektion gekoppelt ist die zeitliche Auflösung der in vivo Mikrodialyse innerhalb von wenigen Minuten je Probe erhöht.
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Acknowledgments
Unterstützt durch DK065872 (ENP), eine Smith Family Foundation Award of Excellence in Biomedical Research (ENP), F31 DA023760.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
- Bungay, P. M., Newton-Vinson, P., Isele, W., Garris, P. A., Justice, J. B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 86, 932-946 (2003).
- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
