Summary
自由に動物を移動させるの異なる脳領域における細胞外神経伝達物質レベルのモニタリングは、神経伝達物質の放出と行動の間のリンク上の洞察を提供しています。および基底神経伝達を薬理学的または生理学的操作によって変更される方法については、電気化学検出と相まって生体微量透析に優れた解剖学的および化学的分解能を提供します。
Abstract
目を覚まし、動物の脳内の神経伝達物質の細胞外基底レベルを測定する能力は、中枢神経系へのさまざまな全身性の課題の影響（薬理学的または生理学）の測定が可能になります。例えば、一つは、直接動物の中脳のドーパミンの予測は、食品のようなd -アンフェタミンまたは天然の刺激のようなドーパミン放出薬に反応方法測定することができます。このビデオでは、我々はマイクロダイアリシスプローブを挿入して移植する方法、ラットの脳内の特定のサイトをターゲットにガイドカニューレを注入する方法を説明し、細胞外レベルのを測定する電気化学検出と相まって、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC - EC）を使用する方法酸化神経伝達物質と代謝物。マイクロダイアリシスプローブを介して薬物のローカル正確な導入は、アクションの化合物のメカニズムの部位特異性で洗練された作業が可能になります。この手法は、優れた解剖学的および化学的分解能を持つが、マイクロダイアリシスサンプルなどのわずかな時間分解能は、通常、検出可能な神経伝達物質のレベルを確保するために毎20-30分を処理されます。補完的な生体外でのツールは（すなわち、スライスや細胞培養、電気生理学）リアルタイムの神経伝達を監視を支援することができます。
Protocol
まとめ
とキシラジン（10mgを、2ヶ月の古い平均年齢のC57BL/6Jマウスまたは同等以上の三ヶ月の平均年齢Sprague Dawleyラットまたは同等のケタミン（マウスでは100 mg / kgをIPラットで60 mg / kgを腹腔内）で麻酔/ kgのいずれかの種のためのIP）。鎮静は反射がで示した撤退穏やかなつま先のピンチを使用して監視されます。Walantusら （Joveの、6、2007）とSzotら （Joveの、9、2007）。体温調節はthermostatregulated加熱パッド（ALAインスツル株式会社）を介して提供し、直腸の温度計で監視することができます。ヘッドは、毛皮の剃毛と切開の前にヨウ素で洗浄される。皮膚切開（マウスの場合は1センチのラット、2センチ）と頭蓋骨の表面からすべての軟組織を除去した後、ガイドカニューレの配置は、ブレグマとの関係で決定されます。 6mmの穴はげっ歯類の手術のために設計されたバッテリ駆動ドリラー（ファイン科学のツール、（株））で頭蓋骨貫通されています。ケアは、ドリルビットが髄膜や血管を貫通しないように取られます。頭蓋骨は、後側坐核、背側線条体や前頭前野に至る二国間の5ミリメートル21ゲージステンレス製のガイドシャフトに注入される。定位座標はフランクリンとPaxinos、1997年（定位座標でのマウスの脳、アカデミックプレス）またはPaxinosとワトソン、2006（定位座標でのラットの脳、アカデミックプレス）あたりとして確立されています。インプラントは歯科用セメントで固定されている。 0.9％生理食塩水の乳酸リンゲルのボーラスは、脱水を防ぐために、手術の終わり（ラットにおける5mls SCとマウスの1ミリリットルSC流体は通常の体温に温めされた後）で与えられる。動物が苦痛にあると表示される場合ブプレノルフィン（0.1-0.5mg/kg SC）は、必要に応じて、その後、1日2回投与とされています。術後感染症が発生した場合、ローカル抗生物質治療（バシトラシン軟膏）と抗生物質の全身治療（最初の48時間術後12時間ごとにIMペニシリン100,000 IU / kg）を投与されています。
手術後、動物は個別に食料と水利用可能な自由に摂取して収容されています。少なくとも一週間は、マイクロダイアリシスと安楽死の前に回復のために許可されています。手術から回復後、動物は、マイクロダイアリシスケージとマイクロダイアリシスプローブに転送され、手術中にインストールされているガイドシャフトに挿入して接合されている。プローブは、ガイド軸を介して皮膚、筋肉および髄膜の組織をバイパスされているため、プローブの挿入は、痛みや不快感が発生することはありません。そのため、プローブの挿入は、麻酔なしで行われ、神経化学または行動上の任意の麻酔誘発性の影響が回避されています。我々は、プローブは12時間安定化し、我々が実験に応じて別の8〜12時間30分ごとのサンプリングを開始させて。我々はフォトセルまたは実験による移動の手動録画を介して動物の運動行動を監視する。 Microdialysateサンプルは神経化学的検出と解析のための電気化学検出（HPLC - EC）の測定器で高速液体クロマトグラフィーに注入されています。我々は、基礎神経化学と運動行動への影響を探します。実験の終了時に動物が全身ケタミン（200 mg / kgを腹腔内）とキシラジン（20 mg / kgを、IP）の過剰投与により安楽死されています。その後、心臓を4％パラホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で灌流される。脳を取り出し、凍結と正確なプローブの配置を確認するためにマイクロダイアリシスプローブの管に沿ってカットされています。
手順
- 定位固定装置と必要なすべてのマテリアルを設定します。エリアや楽器のクリーニングと滅菌されていることを確認します。
- 電気かみそりで毛を剃り落とす。耳からだけで、間に目に移動し、毛皮の領域を効果的にきれいに異なる方向にカミソリを動かす。剃毛面積にpovidine /ヨウ素を適用するが、それから目を保護する。
- 外耳道に耳のバーを配置し、所定の位置に締めて、定位固定装置の上に動物をマウントします。その後、最初のマウント外耳道の片方の耳のバー、および他の耳のバーの位置とスライドでそれを保持。あなたは頭がもう左右に移動することができる正しい場所にある知っている。定位の前部マウントで口を固定し、ヘッドが定規と水平であることを確認してください。定位固定装置のプラットフォームに対して垂直の位置に定規を置くと）動物の頭皮の定規と真ん中の間に90 °の角度を確認してください。それはそのような機能を提供する場合定位固定装置を介してこれを確認してください。
- ラムダからわずか動物の眼の間に延びる滅菌メスで頭皮上に前部/後部の切開を加えます。皮膚をピンチオフと切開を開いたままにして滅菌止血を使用してください。いくつかの滅菌綿棒を使用して、露出頭蓋骨の表面をふいて乾かす。
- この場所をガイドカニューレの右側頭骨上ブレグマ、および位置を見つけ、そのマウントの上にガイドカニューレを置く。後方/前方と横方向の座標を書き留めておきます。ブレグマから、脳地図の助けを借りて、あなたのプローブの配置に必要な正しい座標を見つける。追加またはブレグマから減算することによって、正しい座標にガイドカニューレを置きます。それがこの腹側の座標を記録して頭蓋骨に触れ、そしてされるまで、あなたのガイドカニューレをダウンさせる。頭蓋骨上のこの場所で滅菌鉛筆で鉛筆のマークを付ける、これが掘削される場所です。
- ガイドカニューレを外し、ドリルビットを殺菌する。あなたが頭蓋骨の幅を介して取得されるまで慎重に鉛筆のマークに穴を開ける。それは側面に触れることなく穴をクリアするだろうかどうかを確認するためのガイドカニューレに確認してください。カニューレはストレートパスでクリアできるようになるまで掘削し、定期的にチェックしてください。穴が行われると、静かにカニューレの遮るもののない挿入を可能にするために、髄膜を開ける滅菌針を使用してください。
- カニューレの穴に2つの前方に、二つのカニューレの穴、側面の後方に2〜横：次に、ハンドドリルを使用すると、頭蓋骨のネジのための6つの穴を作成します。 6本のネジを滅菌し、それらがしっかりと上に固定されるまで、頭蓋骨の上に置きます。
- エタノールおよび生理食塩水、マウント付きガイドカニューレを清掃し、適切な腹側の座標にゆっくりそれを下げて。双方が接触していないこと、それが完全に垂直に起きていることを確認してください。
- 内側および後頭骨のネジの後ろにアンカーボルトを配置し、ピンセットで所定の位置に固定します。液体歯科用セメントの薄いバッチを混合し、ガイドカニューレ、ネジ、および滅菌スパチュラで頭蓋骨の残りをカバーしています。 、別のバッチを作る今回は厚く、そして完全にエリアとそれを確保するのに十分なカニューレとアンカーネジをカバーする。
- セメントが厚く、それが固まる前になると、セメントのカップから皮膚を分離し、セメントのキャップは、すべての周りに滑らかであると後で皮膚を刺激しないことを確認するためにスパチュラでセメントのカップを成形。
- 歯科用セメントが完全に装置から動物を削除する前に乾燥することができます。止血を削除します。バシトラシンのセメントのキャップの周りのすべての方法を適用する。
- 動物は、定位固定装置をオフになると、生理食塩水SC（皮下）を1ml、続いペニシリンIM（筋肉内）0.25mlのでそれを注入する。
- 独自のケージに動物を配置し、それを回復するために、その部屋にそれを返す前に意識的になるまでそれを監視する。
- 彼らは手術と術後日常の日に麻酔から回復するまで痛み/苦痛の感染と評価の兆候を、実験の終わりまで、動物を監視します。これは、週末および休日を含んでいる。低自発運動、取り扱い時に遭難発声、猫背の姿勢、下痢、headmountの領域の腫れと放電、および摂食/飲料の欠如は、痛みや苦痛のすべての兆候です。動物が苦痛にあると表示される場合ブプレノルフィン（0.1-0.5mg/kg SC）は、必要に応じて、毎日二度、そしてその後に投与される。術後感染症が発生した場合、ローカル抗生物質治療（バシトラシン軟膏）と抗生物質の全身治療（最初の48時間術後12時間ごとにIMペニシリン100,000 IU / kg）を投与されています。これらの症状のいずれかが手術の12時間以内にブプレノルフィンの投与後、補足的な流体、および抗生物質治療を継続する場合は、動物を安楽死されている。
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Discussion
生体内微小透析で生きている動物の異なる脳部位で複数の神経伝達物質や代謝産物を測定するための最適なツールです。しかし、それは唯一の神経化学物質の細胞外レベルを監視し、リアルタイムで神経伝達物質のエキソサイトーシスを監視するための時間分解能を提供していません。 "ネットフラックス"と呼ばれるテクニックのバージョンを通じて、与えられたサイトでの実際の神経伝達物質の濃度は、順番に、細胞膜輸送を介してセロトニン再取り込みの神経伝達速度の正確な測定を与えることができる、計算することができます。
マイクロダイアリシスでは、動物のさまざまなグループ（つまり、異なる遺伝子型）間と神経伝達物質の放出を薬や他の操作の影響を読み解き基底細胞外神経伝達物質のレベルの違いを説明するのに最適です。
蛍光検出を組み合わせたキャピラリーゾーン電気泳動（CZE）のようなHPLC - ECへの代替アッセイの導入は、サンプルあたり数分内でのin vivoマイクロダイアリシスでの時間分解能を増加している。
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Acknowledgments
DK065872（ENP）、医学研究の卓越性のスミスファミリー財団賞（ENP）、F31 DA023760によってサポートされています。
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
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- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
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- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
