Summary
Мониторинг внеклеточных уровней нейромедиаторов в различных областях мозга свободно движущихся животных предлагает идеи о связи между выпуска нейротрансмиттера и поведения. В естественных условиях микродиализа в сочетании с электрохимическими обнаружения обеспечивает отличную анатомические и химические разрешение, а также информацию о том, как базальной нейротрансмиссии изменяется с помощью фармакологических или физиологических манипуляций.
Abstract
Способности измерять базальную внеклеточного уровня нейротрансмиттеров в мозгу проснуться животных позволяет для определения влияния различных системных вызовов (фармакологическая или физиологического) к ЦНС. Например, можно непосредственно оценить, как средний мозг животного прогнозы дофамина реагировать на дофамин-рилизинг наркотики, такие как D-амфетамина или природные раздражители, как пища. В этом видео мы покажем вам, как имплантат руководство канюли, ориентированные на конкретные сайты в головном мозге крыс, как вставить имплантат и микродиализа зонда и как использовать высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с электрохимическими обнаружения (ВЭЖХ-ЕС) для измерения уровня внеклеточного окисляемых нейротрансмиттеров и метаболитов. Местные точное введение наркотиков через микродиализа зонда позволяет изысканные работы на месте специфику в механизм соединения с действий. Эта техника имеет отличные анатомические и химические разрешение, но лишь скромные временным разрешением, как микродиализа образцы обычно обрабатываются каждые 20-30 минут, чтобы обеспечить определяемый уровень нейромедиатора. Дополнительные бывших естественных инструментов (например, нарежьте и клеточных культур электрофизиологии) может помочь с мониторингом в режиме реального времени нейротрансмиссии.
Protocol
Резюме
Два-месячный средний возраст C57BL/6J мышей или эквивалентную или три месяца средний возраст Sprague Dawley крыс или эквивалента анестезии с кетамином (60 мг / кг для крыс, 100 мг / кг для мышей) и ксилазина (10 мг / кг, внутрибрюшинно или для видов). Торможение осуществляется с использованием нежного ущипнуть палец снять рефлекс продемонстрировано в Walantus и соавт. (Юпитер, 6, 2007) и Szot и соавт. (Юпитер, 9, 2007). Терморегуляция могут быть предоставлены через thermostatregulated грелку (ALA инструменты Inc) и контролируется через ректального термометра. Голова бритая из меха и очищены с йодом перед разрезом. После разреза кожи (2 см в длину для крыс, длиной 1 см для мышей) и удаление всех мягких тканей с поверхности черепа, размещение руководство канюли определяется по отношению к брегмы. 6 мм отверстие сверлится через череп с батарейным питанием бурильщика предназначен для грызунов хирургии (Fine инструменты науки, Inc.) Уход берется так, чтобы сверло не проникает через мембраны мозговых оболочек или кровеносных сосудов. Череп имплантируется с двусторонними 5 мм номер 21 нержавеющая сталь руководство валов, ведущих к задней прилежащем ядре, стриатуме или спинной префронтальной коры головного мозга. Стереотаксического координатами квалифицировались как за Франклин и Paxinos, 1997 (Мышь Мозга в стереотаксического Координаты, Academic Press) или Paxinos и Уотсон, 2006 (Крыса Мозга в стереотаксического Координаты, Академический Press). Имплантаты обеспечены зубным цементом. Болюс лактата Рингера в 0,9% солевом приведен в конце операции (5mls SC у крыс и 1 мл SC у мышей после жидкость нагревают до нормальной температуры тела), чтобы предотвратить обезвоживание. Бупренорфин (0.1-0.5mg/kg SC) осуществляется два раза в день, а затем, по мере необходимости, если животное, кажется, от боли. Местное лечение антибиотиками (бацитрацин мазь) и системные антибиотики (пенициллин 100000 МЕ / кг внутримышечно каждые 12 часов в течение первых 48 часов после ор) находятся в ведении если послеоперационных инфекций происходят.
После операции животным индивидуально в тюрьмах вместе с пищей и водой доступны без ограничений. По крайней мере, одна неделя допускается для восстановления, прежде чем микродиализа и эвтаназии. После восстановления от хирургии, животных передаются клетке микродиализа и микродиализа зондов вставляются и цементировала в гид валы которые были установлены время операции. Зонд вставки не вызывает боли или дискомфорт из-за зонда обход кожи, мышц и менингеальные ткани через руководство шахты. Таким образом, зонд вставки делается без наркоза и анестезии любой-индуцированные эффекты у нейрохимии или поведение избежать. Мы даем зондов стабилизироваться в течение 12 часов, а затем мы начнем отбор проб каждые 30 минут в течение еще 8-12 часов в зависимости от эксперимента. Мы следим за опорно-двигательного поведения животного через фотоэлементы или ручная запись движения экспериментатором. Microdialysate образцы вводятся в высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической обнаружения (ВЭЖХ-ЕС) инструментом нейрохимические обнаружения и анализа. Мы ищем воздействие на базальную нейрохимии и опорно-двигательного поведения. В конце эксперимента животное усыпляют от передозировки системных кетамином (200 мг / кг) и ксилазина (20 мг / кг, внутрибрюшинно). Затем сердце озарен 0,9% физиологического раствора, затем 4% параформальдегида. Мозги удаляются, замороженные и разрезать вдоль тракта микродиализа зонд для проверки точного размещения зонда.
Процедура
- Настройка стереотаксического прибора и все необходимые материалы. Удостоверьтесь, что местность и инструменты очищаются и стерилизуются.
- Сбрить шерсть с электрической бритвой. Переход от ушей только в период между глазами, двигать бритвой в разных направлениях, чтобы эффективно очищать площадь меха. Применить povidine / йода бритой области, но защиты глаз от него.
- Горы животных на стереотаксического аппарата путем размещения ухо баров в ушной канал и ужесточение на место. Первое горе одно ухо бар в ушной канал, а затем, удерживая его на месте и слайд в другой бар уха. Вы знаете, вы находитесь в правильном месте, когда голова уже не может быть перемещен из стороны в сторону. Безопасные рот с передней горе стереотаксической и убедитесь, что голову на одном уровне с правителем. Положите линейку в вертикальном положении по отношению к стереотаксической платформы инструмент и проверить его на угол 90 ° между правителем и середине головы животного). Подтвердить это через стереотаксического прибора, если он обеспечивает такую возможность.
- Сделайте по передней / задней разрез на коже головы стерильным скальпелем простирается от лямбда только в период между глазами животного. Используйте стерилизованные hemostats к отщипывать кожу и держать разрез открытым. Используя несколько стерильные ватные тампоны, высушить подвергаются поверхности черепа.
- Положите руководство канюли на свою гору, найти брегмы на черепе, и положение правой направляющей канюли по этому адресу. Запишите передних / задних и боковых координат. С брегмы, найти правильные координаты, необходимые для размещения вашей зонд с помощью стереотаксической атлас. Позиция руководства канюлю правильные координаты, добавляя или вычитая из брегмы. Принесите ваш гид канюлю вниз, пока не трогает череп, а затем записать этот вентральной координат. Сделайте карандашом метки стерильной карандашом на этом месте на черепе, это, где вы будете бурения.
- Удалить руководство канюли и стерилизовать вашего сверла. Тщательно просверлить отверстие в карандаш марки пока вы не получите через ширина черепа. Проконсультируйтесь с руководством канюли чтобы увидеть, если она будет ясно отверстия, не касаясь сторон. Держите бурения и проверки до канюли можно удалить в прямой путь. Как только отверстие сделано, использование стерильных игл, чтобы мягко удар мозговые оболочки, чтобы позволить свободный вставки канюли.
- Далее, используя ручной дрелью, сделать шесть отверстий для винтов черепа: два впереди отверстие канюли, два боковых, чтобы отверстие канюли, и два сзади по бокам. Стерилизовать шесть винтов и разместить их на черепе, пока они не плотно, построенной на базе.
- Чистая руководство канюли с этанолом и соленые, узлы крепления, и опустите ее медленно, чтобы надлежащим вентральной координат. Убедитесь в том, что стороны не касались, и что он собирается в строго вертикально.
- Место якорь винт медиально и позади задних винта черепа и удерживать его на месте с помощью пинцета. Смешайте тонкой партия жидкого стоматологического цемента и охватывают руководство канюли, винты, и остальная часть черепа стерильный шпателем. Сделать еще одну партию, толще это время, и полностью покрыть площадь и канюли и анкерных винтов достаточно, чтобы обеспечить это.
- Как цемент становится толще и, прежде чем он затвердевает, отдельные кожу от цемента чашку и плесени цемента чашку с лопаточкой, чтобы убедиться, цемент крышка гладкая все вокруг и не раздражает кожу позже.
- Разрешить зубным цементом, чтобы полностью высохнуть, прежде чем снимать животное от аппарата. Удалить hemostats. Применить бацитрацин все наоборот цемента шапку.
- Как только животное от стереотаксического прибора, ввести его с 0,25 мл пенициллина IM (внутримышечные), а затем по 1 мл физиологического раствора SC (подкожно).
- Место животное в своей клетке и наблюдать за ним, пока не осознает до возвращения его в комнату, чтобы оправиться.
- Монитор животных, пока они не оправиться от наркоза на день операции и ежедневно послеоперационной, до конца эксперимента, признаки инфекции и оценки боли / бедственном положении. Это включает в выходные и праздничные дни. Низкий стихийного движения, бедствия вокализации при обработке, выгибание спины, понос, отеки и разряд в области headmount, а также отсутствие кормления / питьевой все признаки боли и страданий. Бупренорфин (0.1-0.5mg/kg SC) осуществляется два раза в день, а затем, по мере необходимости, если животное, кажется, от боли. Местное лечение антибиотиками (бацитрацин мазь) и системные антибиотики (пенициллин 100000 МЕ / кг внутримышечно каждые 12 часов в течение первых 48 часов после ор) находятся в ведении если послеоперационных инфекций происходят. Если любой из этих симптомы сохраняются после введения бупренорфина, дополнительные жидкости, и лечение антибиотиками в течение 12 часов после операции, животное усыпляют.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В естественных условиях микродиализа является инструментом для измерения нескольких нейротрансмиттеров и метаболитов в различных участках мозга живого животного. Впрочем, это только мониторы внеклеточных уровней нейрохимических веществ и она не дает временное разрешение на мониторе нейромедиатора экзоцитоза в реальном времени. Через версии метода, называемого "чистого потока", фактическая концентрация медиатора на данном сайте можно рассчитать, что, в свою очередь, может дать точные измерения нейромедиатора скорость обратного захвата через транспортеры плазматической мембраны.
Микродиализ является идеальным в иллюстрирующие различия в базальных внеклеточных уровней нейромедиаторов между различными группами животных (то есть различных генотипов) и в расшифровке эффектов лекарств или других манипуляций с нейромедиатором релизе.
Введение анализов альтернатива ВЭЖХ-EC, как капиллярный электрофорез зоны (Чехия) в сочетании с флуоресцентной детекции увеличилось временным разрешением в естественных условиях микродиализа в течение нескольких минут в образце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Поддержка DK065872 (ЕПС), Фонд Смит Семья премии передовых технологий в области биомедицинских исследований (ЕПС), F31 DA023760.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
- Bungay, P. M., Newton-Vinson, P., Isele, W., Garris, P. A., Justice, J. B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 86, 932-946 (2003).
- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
