Summary
Il monitoraggio dei livelli del neurotrasmettitore extracellulare nelle regioni cerebrali distinte di muoversi liberamente animali offre approfondimenti sul legame tra il rilascio dei neurotrasmettitori e comportamento. In microdialisi in vivo accoppiato con rilevazione elettrochimica fornisce anatomica eccellente e la risoluzione chimici e informazioni su come neurotrasmissione basale è alterato da manipolazioni farmacologiche o fisiologiche.
Abstract
La capacità di misurare i livelli basali extracellulari di neurotrasmettitori nel cervello di animali svegli permette per la determinazione degli effetti di diverse sfide sistemiche (farmacologici o fisiologico) al sistema nervoso centrale. Per esempio, si può misurare direttamente come proiezioni dopamina dell'animale mesencefalo rispondere a rilascio di dopamina farmaci come gli stimoli d-anfetamina o naturale come il cibo. In questo video vi mostriamo come impianto cannule guida targeting siti specifici nel cervello del ratto, come inserire e impiantare una sonda microdialisi e come utilizzare cromatografia liquida ad alta prestazione accoppiata con rilevazione elettrochimica (HPLC-EC) per misurare i livelli extracellulari di neurotrasmettitori ossidabili e metaboliti. Locali introduzione preciso dei farmaci attraverso la sonda di microdialisi permette di raffinato lavoro sulle specificità del sito in un composto s meccanismo di azione. Questa tecnica è eccellente e la risoluzione anatomica chimiche, ma solo i tempi di risoluzione modesta come campioni microdialisi sono di norma elaborata ogni 20-30 minuti per assicurare i livelli di neurotrasmettitore rilevabili. Strumenti complementari ex vivo (cioè fetta e coltura cellulare elettrofisiologia) può aiutare con il monitoraggio in tempo reale la neurotrasmissione.
Protocol
Riassunto
Due mesi di età media di topi C57BL/6J età o equivalente o tre mesi età media ratti Sprague Dawley o equivalenti sono anestetizzati con ketamina (60 mg / kg ip per i ratti; 100 mg / kg ip per topi) e xilazina (10 mg / kg, ip per entrambe le specie). La sedazione è controllata mediante un pizzico dolce toe ritirare riflesso dimostrato in Walantus et al. (Giove, 6, 2007) e Szot et al. (Giove, 9, 2007). Termoregolazione può essere fornita attraverso una piastra elettrica thermostatregulated (ALA Instruments Inc.) e monitorati attraverso un termometro rettale. La testa è rasata di pelliccia e pulito con iodio prima incisione. Dopo l'incisione della pelle (2 cm di lunghezza per i ratti, 1 cm per topi) e la rimozione di tutti i tessuti molli dalla superficie del cranio, il posizionamento della cannula guida è determinato in relazione al bregma. A 6 mm foro si è esercitato attraverso il cranio con un trapano a batteria destinati per la chirurgia roditori (Strumenti Scienza Fine, Inc.). Si fa attenzione in modo che la punta non penetra attraverso le membrane meningee o vasi sanguigni. Cranio è impiantato bilaterale con 5 millimetri 21 alberi in acciaio inox calibro guida che porta al nucleo accumbens posteriore, striato dorsale o corteccia prefrontale. Le coordinate stereotassiche sono stabiliti secondo Franklin e Paxinos, 1997 (Il cervello del mouse in coordinate Stereotassica, Academic Press) o Paxinos e Watson, 2006 (Il cervello di ratto in coordinate Stereotassica, Academic Press). Gli impianti sono garantiti da cemento dentale. Un bolo di Ringer lattato della soluzione salina 0,9% è dato alla fine della chirurgia (5mls SC nei ratti e 1 ml SC nei topi dopo fluidi sono portata a temperatura corporea normale) per prevenire la disidratazione. Buprenorfina (0.1-0.5mg/kg SC) viene somministrato due volte al giorno e, poi, su una base come-necessaria, se l'animale sembra essere in sofferenza. Trattamento antibiotico locale (unguento bacitracina) e un trattamento antibiotico sistemico (penicillina 100.000 UI / kg IM ogni 12 ore per le prime 48 ore post-op) se vengono somministrati infezioni post-operatorie si verificano.
Dopo la chirurgia, gli animali sono alloggiati individualmente con il cibo e ad libitum acqua disponibile. Almeno una settimana è consentito per il recupero prima di microdialisi e l'eutanasia. A seguito di recupero da un intervento chirurgico, gli animali vengono trasferiti in una gabbia microdialisi e sonde microdialisi sono inseriti e cementati nei pozzi guida che sono stati installati durante l'intervento. L'inserimento della sonda non provoca dolore o fastidio, perché la sonda è bypassando tessuto cutaneo, muscolare e meningea attraverso l'albero guida. Pertanto, l'inserimento della sonda viene fatto senza anestesia e qualsiasi anestesia effetti indotti sulla neurochimica o comportamenti sono evitati. Lasciamo che le sonde stabilizzazione per 12 ore e poi iniziare il campionamento ogni 30 minuti per un altro 8-12 ore a seconda dell'esperimento. Monitoriamo il comportamento motorio degli animali attraverso fotocellule o la registrazione manuale del movimento dallo sperimentatore. Microdialysate campioni vengono iniettati in una cromatografia liquida ad alte prestazioni con rilevazione elettrochimica (HPLC-EC) strumento per la rilevazione e l'analisi neurochimiche. Siamo alla ricerca di effetti sulla neurochimica basale e il comportamento motorio. Alla fine dell'esperimento l'animale è eutanasia da un overdose di ketamina sistemica (200 mg / kg ip) e xilazina (20 mg / kg, ip). Allora il cuore è perfuso con soluzione salina 0,9% seguito da 4% paraformaldeide. I cervelli sono stati rimossi, congelati e tagliare lungo il tratto della sonda microdialisi per verificare il posizionamento preciso della sonda.
Procedura
- Impostare lo strumento stereotassico e tutti i materiali necessari. Assicurarsi che l'area e gli strumenti sono puliti e sterilizzati.
- Radersi pelliccia con rasoio elettrico. Vai dalle orecchie a soli in mezzo agli occhi, spostare rasoio in diverse direzioni per pulire efficacemente un'area di pelliccia. Applicare povidine / iodio a zona rasata, ma proteggere gli occhi da esso.
- Montare l'animale su l'apparato stereotassico inserendo le barrette orecchio nel condotto uditivo e di serraggio in posizione. Prima cosa si monti una barra orecchio nel canale auricolare, e poi tenerlo in posizione e scivolare nel bar altro orecchio. Sai che sono nella posizione corretta quando la testa non può più essere spostato lateralmente. Fissare la bocca con il supporto anteriore del stereotassica e assicurarsi che la testa sia a livello con un righello. Mettere il righello in posizione verticale rispetto alla piattaforma strumento stereotassico e verificare la presenza di un angolo di 90 ° tra il sovrano e la metà del cuoio capelluto dell'animale). Confermare questo attraverso lo strumento stereotassico se offre funzionalità di questo tipo.
- Fare un'incisione anteriore / posteriore del cuoio capelluto con un bisturi sterile, che si estende dal lambda a soli in mezzo agli occhi dell'animale. Usa hemostats sterilizzati per pizzicare sulla pelle e tenere aperta l'incisione. Utilizzando diversi tamponi di cotone sterile, asciugare la superficie esposta del cranio.
- Mettere la cannula guida sul suo supporto, trovare bregma sul cranio, e la posizione della cannula guida a destra su questa posizione. Annotare le coordinate anteriore / posteriore e laterale. Da bregma, trovare le coordinate necessarie per il corretto posizionamento del vostro sonda con l'aiuto dell'atlante stereotassico. Posizionare la cannula guida alle coordinate corrette aggiungendo o sottraendo dal bregma. Portate la vostra cannula guida verso il basso fino a toccare il cranio, e poi registrare questa coordinata ventrale. Fare un segno di matita con una matita sterile in questa posizione sul cranio, questo è dove sarete foratura.
- Rimuovere la cannula guida e sterilizzare la tua punta da trapano. Con attenzione praticare un foro al segno a matita fino ad ottenere attraverso la larghezza del cranio. Verificare con la cannula guida per vedere se sarebbe chiaro il foro senza toccare i bordi. Tenere foratura e controllo fino a quando la cannula può cancellare in un percorso rettilineo. Una volta che il buco è fatto, utilizzare un ago sterile a pugni con delicatezza le meningi in modo da permettere l'inserimento della cannula senza ostacoli.
- Successivamente, utilizzando un trapano a mano, rendono sei fori per le viti del cranio: due anteriori al foro della cannula, due laterali al foro della cannula, e posteriori ai lati due. Sterilizzare sei viti e metterli sul cranio, fino a che non sono strettamente ancorate su.
- Pulire la cannula guida con etanolo e saline, montare, e abbassare lentamente alla coordinata corretta ventrale. Assicurarsi che i lati non si toccano e che sta andando in perfetta verticale.
- Posizionare la vite di ancoraggio medialmente e dietro le viti cranio posteriore e tenerlo in posizione con le pinzette. Mescolare un lotto sottile di liquido cemento dentale e coprire la cannula guida, viti, e il resto del cranio con una spatola sterile. Fare un altro lotto, questa volta più spessa, e coprire completamente la zona e la vite cannula e ancora abbastanza per fissarlo.
- Come il cemento diventa più spessa e prima che si solidifica, separare la pelle dalla coppa cemento e stampo la coppa di cemento con la spatola per assicurarsi che il tappo di cemento è tutt'intorno e non irrita la pelle più tardi.
- Lasciare che il cemento dentale si asciughi completamente prima di rimuovere l'animale dall'apparecchio. Rimuovere il hemostats. Applicare tutto il percorso attorno al tappo di cemento bacitracina.
- Una volta che l'animale è spento lo strumento stereotassico, si iniettano con 0,25 ml di penicillina IM (intra-muscolare), seguito da 1 ml di soluzione fisiologica SC (via sottocutanea).
- Posto l'animale nella sua gabbietta e monitorare fino a che non prende coscienza prima di tornare alla sua stanza per recuperare.
- Monitorare gli animali fino a quando non riprendersi dall'anestesia il giorno dell'intervento e giorno post-op, fino alla fine dell'esperimento, eventuali segni di infezione e di valutazione del dolore / disagio. Questo include fine settimana e festivi. Bassa movimento spontaneo, vocalizzazione angoscia sulla gestione, la postura ingobbita, diarrea, gonfiore e scarico nella zona del headmount, e la mancanza di alimentazione / bere sono tutti segni di dolore e di angoscia. Buprenorfina (0.1-0.5mg/kg SC) viene somministrato due volte al giorno, e poi, su una base come-necessaria, se l'animale sembra essere in sofferenza. Trattamento antibiotico locale (unguento bacitracina) e un trattamento antibiotico sistemico (penicillina 100.000 UI / kg IM ogni 12 ore per le prime 48 ore post-op) se vengono somministrati infezioni post-operatorie si verificano. Se qualcuno di questi sintomi persistono dopo la somministrazione di buprenorfina, il liquido supplementare, e il trattamento antibiotico entro le 12 ore di intervento chirurgico, l'animale è eutanasia.
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Discussion
Microdialisi in vivo è lo strumento di scelta per la misurazione dei neurotrasmettitori multipli e metaboliti in siti diversi del cervello di un animale vivo. Tuttavia, controlla solo i livelli extracellulari di sostanze neurochimiche e non offre la risoluzione temporale di monitorare esocitosi dei neurotrasmettitori in tempo reale. Attraverso una versione della tecnica chiamata "net-flux", la concentrazione dei neurotrasmettitori effettiva in un determinato sito può essere calcolato, che a loro volta possono dare misurazioni accurate del tasso di neurotrasmettitore del reuptake attraverso trasportatori della membrana plasmatica.
Microdialisi è ideale nell'illustrare le differenze in basale livelli del neurotrasmettitore extracellulare tra i diversi gruppi di animali (cioè genotipi diversi) e nel decifrare gli effetti di droghe o altre manipolazioni sul rilascio di neurotrasmettitore.
L'introduzione di test alternativi per HPLC-CE come elettroforesi capillare (CZE) accoppiato con rilevazione a fluorescenza ha aumentato la risoluzione del tempo di microdialisi in vivo in pochi minuti per campione.
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Acknowledgments
Supportato da DK065872 (PEV), una famiglia Smith Award Foundation di eccellenza nella ricerca biomedica (PEV), F31 DA023760.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
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- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
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