Usando uma pinça Laser Para Manipulação neurônios isolados In Vitro

Summary

Este vídeo descreve a manipulação de neurônios cultivados usando laser pinças in vitro.

Abstract

Neste artigo e vídeo, descrevemos os protocolos utilizados em nosso laboratório para estudar as preferências de segmentação dos processos celulares regeneração de neurônios da retina adulta in vitro. Procedimentos para a preparação de culturas de células da retina começam com a dissecção digestão, e trituração da retina, e terminam com o chapeamento de isoladas as células da retina em pratos feitos especialmente para uso com laser pinças. Estes pratos são divididos em meia célula adesiva e meia repelente celular. O lado adesivo célula é revestida com uma camada de Sal-1 anticorpos, que fornecem um substrato sobre o qual nossas células crescer. Outros substratos adesivo pode ser usado para outros tipos celulares. O lado repelente célula é revestida com uma fina camada de poly-HEMA. As células banhado no lado poli-HEMA do prato são capturados com a pinça a laser, transportado e depois colocado adjacente a uma célula na-1 Sal lado para criar um par. Formação de grupos de células de qualquer tamanho deve ser possível com esta técnica. "Micromanipulação Laser-pinças controlada" significa que o pesquisador pode escolher quais as células a se mover, e a distância desejada entre as células podem ser padronizadas. Porque o feixe de laser atravessa as superfícies transparentes da placa de cultura, seleção e colocação de células são feitas em um ambiente fechado estéril. As células podem ser monitorados por vídeo em tempo-lapso e usado com qualquer técnica de células biológicas necessárias. Esta técnica pode ajudar as investigações de interações célula-célula.

Protocol

Pinça óptica para manipulação de células isoladas em cultura

Forças aprisionamento de pinças ópticas são gerados a partir do impulso de luz (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). Embora estas forças facilmente armadilha células em suspensão, eles não são capazes de mover as células que aderem a uma superfície. Portanto, para reduzir a adesão ao prato de cultura no ponto onde as células estão presos, a lamela é revestido com poli-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), um composto não tóxico com célula repelente propriedades anteriormente empregados para estudos de adesão em células endoteliais (Folkman e Moscona, 1978). Enquanto poli-HEMA cobre metade da placa de cultura, a outra metade é revestido com um substrato que suporta o crescimento celular. Em nosso laboratório, Sal-1 é usado como substrato para a cultura de células da retina salamandra. O procedimento para a fabricação de Sal-1 e poli-HEMA pratos revestido é descrito abaixo:

Fabricação de placas de cultura

1. Esfregaços limpa (# 1 VWR Scientific Inc., Media, PA) em ácido. Esta lamela foi escolhida pela sua espessura de apenas 0,1 milímetros, necessária para a alta objetivos abertura numérica necessário para focar o laser.
2. Para criar uma área de repelente de células, dissolver 20 mg de poli-HEMA (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) em 1ml de etanol 95% durante a noite a temperatura ambiente. De preferência, esta solução deve ser utilizada dentro de 1 mês de preparação.
3. Escorar o esfregaços em uma posição quase vertical em um ambiente livre de poeira, como um capuz.
4. Coloque uma ou duas gotas de poli-HEMA solução perto do topo da lamela da ponta de plástico de uma micropipeta 200μl. As gotas (cerca de 50-100μl cada) deve ser restrito à metade da lamela. O declive íngreme garante que o líquido flui para baixo da superfície da lamela para o fundo, proporcionando uma camada fina e uniforme de poli-HEMA. Permitir que o esfregaços poli-HEMA revestido para secar o capô por 30-60 minutos em temperatura ambiente.
5. Marcar o lado do poli-HEMA da lamela com uma caneta de ponta fina perto da borda.
6. Faça um furo de 1 cm no fundo de um prato de cultura 35 mm.
7. Cole a lamela poli-HEMA revestidos para o fundo do prato de cultura com Sylgard 184 (Dow Corning Co., Midland, MI), de modo que o lado poli-HEMA revestido faces em direção ao interior do prato. Garantir a borda do revestimento de poli-HEMA corre abaixo do centro do buraco. Permitir que os pratos para secar por 1-3 dias em temperatura ambiente em um ambiente livre de poeira.
8. Riscar uma linha na parte externa da lamínula com uma caneta de ponta de diamante após a borda do revestimento de poli-HEMA. Então, nada duas linhas cruzam em ângulos retos a ele cerca de 2 milímetros de distância. Os dois pontos de interseção servem de referência ou pontos fiducial a ser utilizado para reproduzir a mesma orientação da placa de cultura no palco microscópio.
9. Esterilizar os pratos sob luz ultravioleta durante a noite.
10. Para criar uma meia-célula de adepto da placa de cultura, o revestimento do meia poli-HEMA não com Sal-1, que contém um rato de anticorpos anti-salamandra levantadas contra as membranas das células da retina (generosamente fornecida pelo Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine , Atlanta, GA; ver MacLeish et al (1983)).. Primeira camada, o Sal-1 lado com cerca de 100μl de 0,1 mg / ml estéril cabra anti-camundongo IgG (Boehringer Mannheim Corporation, Indianápolis IN), tomando cuidado para não derramar o líquido sobre para o lado poli-HEMA. Deixe por três horas, depois removê-lo. Lave a mesma área com solução de Ringer estéril de uma ou duas vezes, em seguida, coloque 100μl Sal-1 sobrenadante, tomando cuidado para não derramar o líquido no lado poli-HEMA do prato. O primeiro anticorpo garante Sal-1 é revestido com uma concentração conhecida.
11. Incubar os pratos com o overnight Sal-1.
12. Remover a solução Sal-1 anticorpo e lavar a área com solução de Ringer é estéril. Introduzir 2 ml de meio para o prato pouco antes do revestimento celular.

A composição da solução Ringer anfíbios, sem soro meio anfíbio, e solução de Ringer para a digestão enzimática são encontradas em MacLeish e Townes-Anderson (1988) e Mandell et al. (1993).

Preparação de culturas de células

As células utilizadas neste vídeo foram obtidos a partir de luz adaptados, adulto, aquáticos fase salamandras tigre (Ambystoma tigrinum), medindo 17-22 cm de comprimento (Charles Sullivan Inc., de Nashville, TN), mantido a 5 ° C em um 12 h: 12 h ciclo claro-escuro. Os protocolos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey em estrita conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health. Os procedimentos para a preparação de culturas de células da retina são descritos por Nachman-Clewner e Townes-Anderson (1996) e são as seguintes:

1. Decapitar e medula dos animais. Remove os olhos e dissecar as córneas e íris. O retinas deve separar um pouco dentro da ocular. Ao colocar uma pinça curva debaixo da retina, colher as retinas. Não é importante se a lente está ligado à retina nesta fase.
2. Digerir as retinas em 14 U / ml papaína (Worthington, Freehold, NJ) em solução de Ringer com salamandra por 40 minutos.
3. Antes do uso, a solução Ringer papaína deve ser aeradas com 95% O ₂ / 5% CO ₂ gás por 30 minutos. E depois esterilizados por passagem através de um filtro de 0,22 mícron (Millipore, Carrigtwohill, Irlanda).
4. Lave as retinas com solução fisiológica de Ringer com salamandra três vezes.
5. Remover as lentes de solução de Ringer, em seguida, delicadamente triturar o tecido da retina com um furo de 3 mm pipeta para produzir uma suspensão de células.

Laser manipulação de pinças de neurônios isolados

1. Coloque a placa de cultura no palco microscópio, orientando o prato, alinhando uma marca no prato com um ponto de referência no palco. Gravar as coordenadas dos pontos de referência no computador.
2. Células chapa para ambos os Sal-1 e poli-HEMA metades do prato.
3. Permitir que as células de se contentar com cerca de 20 minutos, que é longo o suficiente para as células do lado aderente do prato para anexar ao substrato de anticorpos.
4. Selecione uma célula do lado Sal-1 aderente do prato. Marque o x e estágio y coordenadas de uma posição próxima à célula. No nosso caso, o ponto foi de aproximadamente 10μm a partir dos dendritos primária da célula selecionada. Guardar as coordenadas no computador.
5. Selecione um segundo neurônio, no nosso caso um fotorreceptor, no lado poli-HEMA do prato e use a ferramenta de pinça a laser para prendê-lo. Trapping pode ser alcançado através de uma ampla gama de níveis de potência. No entanto, vamos definir o poder do laser em 10% -20%, o que é baixo o suficiente para evitar detritos captura junto com o celular, mas suficiente para transportar o celular através do médium.
6. Enquanto segura o celular na armadilha, menor o palco para que a célula está bem acima da superfície da placa de cultura e acima de qualquer neurônios conectados. Mover o palco sob o controle do computador para levar a célula à x salvo anteriormente e coordenadas y no-1 Sal lado. O movimento de estágio foi fixado em 8-20Hm / s, mas a velocidade máxima deve ser determinada empiricamente. À chegada ao ponto de destino no-1 Sal lado, aumentar o palco para levar o celular preso à superfície do prato. Colocação de células pode ser feita com uma precisão de alguns mícrons. Permitem que as células aderem ao substrato Sal-1.
7. Obtenção de imagens digitalizadas de ambas as células no par antes e depois da formação de pares fornece um registro útil.
8. Manter os pares de células em uma incubadora. Para as células da salamandra, coloque os pratos em uma câmara úmida a 10 ° C. As células podem ser monitorados por lapso de tempo de vídeo e usado com qualquer técnica de células biológicas necessárias.

Discussion

A luz tem força, e quando um raio de luz é refratada ao passar através de uma célula, uma força é necessária para mudar a direção do momentum. Por causa da lei da conservação do momento, uma força na direção oposta deve, por sua vez, reagem de volta em uma célula. Ashkin (1991) mostrou que a força gerada por um feixe de laser focalizado por uma lente objetiva do microscópio irá mover uma célula para o centro do foco. Mesmo que um feixe de laser gera apenas uma piconewtons alguns de força, essa força é suficiente para puxar uma célula através de médium. Comprimento de onda do infravermelho próximo, que é mal absorvido pela água é utilizada para evitar danos à célula (Liu et al 1995). A estação de trabalho a laser pinça utilizada em nosso laboratório (Cell Robotics Inc., Albuquerque NM) usa a 1 W, laser de diodo de comprimento de onda contínua onda de 980nm. A luz laser é transmitida para as células através de um plano de óleo de imersão 40x lente objetiva neofluor de alta abertura numérica (NA1.3) (Carl Zeiss Inc.), que focaliza o feixe no mesmo plano focal como o microscópio.

Laser-pinças controladas micromanipulação apresenta uma série de vantagens sobre os estudos sobre células aleatoriamente banhado. Por exemplo, as células podem ser colocadas a uma distância desejada de um outro que pode ser padronizado para todas as células manipuladas. Além disso, o feixe de laser passa através da superfície transparente da placa de cultura e, portanto, a manipulação de células é feito em um ambiente fechado estéril. As forças muito pequenas gerada pelo laser coloca um limite sobre o que pode ser preso. Em nossa experiência, adesão e forma da célula são os fatores mais importantes que limitam prendendo bem sucedida. Em geral, nós armadilha células isoladas de 10-15μm de diâmetro e transportá-los distâncias de vários milímetros em todo o prato de cultura ao seu destino. É possível mover células maiores do que estas, por exemplo, as células gliais Muller, que são 20-40μm de comprimento e são as maiores células em nossas culturas.

Como o aprisionamento de células é um desafio quando as células aderir ao fundo de vidro da placa de cultura e uns aos outros, desenvolvendo uma superfície repelente de células na lamínula usando poli-HEMA foi valiosa para o nosso sucesso em manipular as células. Mesmo assim, as células na superfície de poli-HEMA eventualmente se tornou mais rígidas e difíceis de manipular em culturas de mais de 1-2 horas de idade. Em culturas mais antigas, a prática comum em nosso laboratório foi tentar pegar as células com o laser utilizando a potência máxima, então ligue o aparelho para baixo para transportá-lo.

A facilidade com que pequenos objetos podem ser presos no laser significa que os resíduos podem ser puxado para dentro da armadilha de distâncias bem fora da célula. Isto provou ser um problema durante a captura de nossas células. Isto pode ser evitado na maioria dos casos, girando para baixo o poder do laser para o mínimo possível, que pode segurar o celular dentro da armadilha. A velocidade com que as células podem ser transportados na armadilha é limitada pela viscosidade do meio. Nós normalmente definir a velocidade em torno de 80-20 M / segundo, que foi encontrado para ser dentro de uma faixa de segurança para o transporte.

A possibilidade de que o laser tem efeitos prejudiciais sobre as células realizada na armadilha devem ser considerados. Em nossas culturas de retina, nos deparamos com objetos escuros, como as células de pigmento, que são destruídos quando capturados no feixe de laser. Claramente, portanto, essas células não podem ser estudadas usando a laser pinças. No entanto, em estudos anteriores sobre os neurônios da retina e fotorreceptores realizados em nosso laboratório, não encontramos diferença no crescimento neuríticas e capacidade de formar conexões entre as células-pinça manipulado e células não-manipuladas (Townes-Anderson et al 1998; Clarke et al 2008 ).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25mm circle No.1 coverglass	VWR international	48380 080
poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA)	Sigma-Aldrich	P-3932	Dissolve in 95% ethanol
Goat anti-mouse IgG antibody	Chemicon International	AP181	1mg in 1ml, dilute 10x for use
Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody	generously provided by Dr. Peter MacLeish		Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA
3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets	Corning	7078A-5
Cell culture dishes 35mm x 10mm	Corning	430165
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning
Optical tweezers-microtool or laser tweezers	Cell Robotics Inc.
1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength	Cell Robotics Inc.
Axiovert 100 inverted light microscope	Carl Zeiss, Inc.
40x oil immersion plan neofluor objective lens	Carl Zeiss, Inc.		Numerical aperture (N.A. 1.3)
Black and white CCD camera	Sony Corporation
Computer and joystick with software	Cell Robotics Inc.		for controlling a motorized stage